Polikistik böbrek hastalığının olası bir zebra balığı modelini oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Böbrek yapısını görselleştirmek için Tg(wt1b:GFP) balığı kullandık. Wnt5a'nın yıkılması morfolino enjeksiyonu ile yapıldı. Bu GFP transgenik zebra balığında wnt5a knockdown sonrası pronefrik kist oluşumu gözlendi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte Wnt5a Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler
Bu makalede
Özet
Özet
Polikistik böbrek hastalığı (PKD), tedavisi olmayan yıkıcı bir hastalık olan son dönem böbrek hastalığının en yaygın nedenlerinden biridir. PKD'de kist oluşumuna yol açan moleküler mekanizmalar biraz belirsizliğini korumaktadır, ancak birçok genin dahil olduğu düşünülmektedir. Wnt5a, çok çeşitli gelişimsel süreçleri düzenleyen kanonik olmayan bir glikoproteindir. Wnt5a, renal tübüler hücre uzaması sırasında yönlendirilmiş hücre bölünmesini düzenleyen düzlemsel hücre polaritesi (PCP) yolu aracılığıyla çalışır. PCP yolağının kusurlarının böbrek kisti oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Makalemizde, wnt5a antisens morfolino (MO) oligonükleotidleri ile wnt5a geninin yıkılmasıyla bir zebra balığı kistik böbrek hastalığı modeli geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Tg(wt1b:GFP) transgenik zebra balığı, wnt5a yıkımını takiben böbrek yapısını ve böbrek kistlerini görselleştirmek için kullanıldı. İki farklı antisens MO (AUG - ve ekleme bölgesi) kullanıldı ve her ikisi de wnt5a yıkımından sonra kıvırcık kuyruk aşağı fenotipi ve kist oluşumu ile sonuçlandı. Primer baz çifti yapısındaki bir farklılık nedeniyle MO'lara dirençli fare Wnt5a mRNA'sının enjeksiyonu, anormal fenotipi kurtardı ve fenotipin morfolinin "hedef dışı" etkilerinden kaynaklanmadığını gösterdi. Bu çalışma, böbrekteki wnt5a fonksiyonunu incelemek için bir zebra balığı modeli kullanmanın geçerliliğini desteklemektedir.
Giriş
Balığı (Danio rerio) embriyo yaygın böbrek gelişim ve polikistik böbrek hastalığı çalışmak için bir model olarak kullanılmıştır. Orada bir hayvan modeli olarak zebrafish kullanarak pek çok avantajı vardır: genetik etkileşimlerin incelenmesinde fizibilite protein demonte için antisens morpholinos (MO) kullanma yeteneği fırsat hızlı bir şekilde embriyo sayıda tahlil edilmesi ve organ fenotipleri görüntüleme kolaylığı larva 1 yaşayan. pronephros omurgalılarda geliştirmek için ilk böbrek ve larva zebrafish 2 işlevseldir. zebra balığı pronephros yapısının memeli metanephros nispeten basit karşılaştırıldığında, üçüncü ve son böbrek, memeliler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Etik Açıklama: Tüm zebrabalıkları deneyler Eastern Virginia Medical School Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Morfolino Hazırlık
- (Şekil 1A), üreticinin talimatlarına uygun olarak söz konusu gen için tasarım ve sentez için engelleme (AUG-) ve ek yeri engelleyici (Splice-), anti-sens morfolino (MO) oligonükleotidleri. Tablo 1'de üreticinin bilgilerine bakın lütfen.
NOT: MOs cam şişelerde liyofilize hisse senetleri olarak sevk edilir. - 25 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar MOS yeniden askıya cam şişelere yüksek dereceli steril su ekle. Oligonükleotid....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Wnt5a yıkmak çeviri MO engelleme getirerek elde edildi (Ağustos-MO) veya bir hücre aşamada Zebra balığı embriyolarının için ekson / intron sınır ekleme MO (ekleme-MO). Ağustos-MO nedenle, hem anne ve zigotik Wnt5a mesajını engeller, başlangıç kodonu hedef ve. ek yeri MO, üçüncü parça verici bölge hedef ve Wnt5a (Şekil 1A) yalnızca zigotik transkript inhibe eder. AUG- ve splice- morphants kıvırcık kuyruk altındaki vücut ekseni ve kalp çevresi ödemine (Şekil 1B) de dah.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Polikistik böbrek hastalığı (PKD) insanlarda son dönem böbrek hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir ve ilerici kist oluşumu, böbrek genişlemesi, ve anormal tübül geliştirme 14 ile karakterizedir. Otozomal dominant PKD (polikistik böbrek), genetik hastalık olan ya PKD1 mutasyonu, polikistin-1 (PC1) veya PKD2 kodlayan polikistin-2 (PC2) kodlayan, polikistik böbrek sonuçlanır. Diğer birçok gen, birincil cilium bulunan proteinleri kodlayan özellikle, böbrek kist gelişimi dahil olmak üzere düşünce ve bugün.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu eser (LH DK093625 ve DK069909 ve DK047757 JHL için) NIH tarafından desteklenen ve VA (Başarı Ödülü JHL için I01BX000820). Biz gerekli desteği sağlamak için Pennsylvania Zebra balığı Core Üniversitesi'nden Dr. Michael Paketi ve Dr Jie He teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.5 Fenol-Kırmızı | Sigma | P0290 | Enjeksiyon için renk göstergesi |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (özelleştirilmiş) | İlgilenilen gene göre özelleştirilmiş |
| Önceden çekilmiş iğne | Tritech Research | MINJ-PP | Çok miktarda iğne gerekiyorsa, bir iğne çektirmesi de satın alabilir ve iğneyi laboratuvarda hazırlayabilirsiniz |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | Kurtarma deneyi için kapaklı mRNA yapmak için in vitro transkripsiyon için |
| N-Fenilthiourea | Sigma | P7629 | Melanizasyonun önlenmesi için |
| Trikain | Sigma | A5040 | Zebra balığı anestezisi için etil 3-aminobenzoat olarak da adlandırılır |
| Metil Selüloz | Sigma | M-0387 | Zebra balığının pozisyonu için |
| QIAquick PCR Arıtma Kiti | Qiagen | 28104 | Kapak RNA sentezi için PCR ürününün saflaştırılması için. |
| PCR Etiketi için dNTP karışımı | Promega | U1511 | |
| Polimeraz | Invitrogen | 10342-053 | PCR |
| NanoDrop spektrofotometre | Thermo Scientific | ND-1000 | Morfolino ve RNA konsantrasyonunu ölçmek için |
| Hava | Kompresörü Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Enjeksiyon için hava kaynağı |
| Pico mikro enjeksiyon pompası | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Diğer mikroenjeksiyon sistemi türleri kullanılabilir. |
| Mikro manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Sağ elini kullanan (sol elini kullananlar için MMJL) |
| İğne tutucu | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | Mikromanipülasyon için iğneyi tutmak için |
| Dumont Cımbız | İnce Cerrahi Aletler | 11253-20 | İğne ucunu kırmak için |
| Diseksiyon mikroskobu | Leica M205C | Zebra balığı embriyolarını gözlemlemek ve görüntülemek için | |
| Floresan mikroskobu | Zeiss Axio Obserer D1m | Zebra balığı pronephroslarını görüntülemek için | |
| Kılcal tüp (İç çap 0,15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | Enjekte edilen her damlanın hacmini ölçmek için |
Kaynaklar
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
