Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

7.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52158

⸱

26 Kasım 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

Bu makalede

Özet

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Özet

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) lentiviral bazlı yeniden programlama yöntemleri ile üretilebilir. Bununla birlikte, genomun aktif transkribe bölgelerde kalan potansiyel onkojenik genlerin izleri, insanlar için terapötik uygulamalar 1 kullanım için potansiyelini sınırlamaktadır. Buna ek olarak, tedavi edici olarak uygun türevleri olarak, kök hücre yeniden programlanması ya da farklılaşma elde edilen insan olmayan antijenleri, insan klinik bağlamda 2'de kullanılan bu hiPSCs engellemektedir. Bu videoda, biz yeniden programlanması ve eksojen transjenlerin ücretsiz faktör ücretsiz hiPSCs analiz etmek için bir prosedür sunuyoruz. Bu hiPSCs sonra lentivirüs ihtiva eden özel bir intron gen sentezleme anormallikleri analiz edilebilir. Bu analiz, önceden gen ekspresyonu farklılıklarını 3 tespit etmek için kullanılan daha hassas teknikler üzerinde bir avantaja sahiptir hassas bir kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Içine tam dönüşümKlinik dereceli iyi üretim uygulamaları (GMP) koşullar, insan klinik önemi veriyor. Bizim protokol sunan başka bir metodoloji sağlanan akım güvenli liman kriterleri genişletmek ve insan terapötik uygulamalar-nedeniyle insan olmayan antijenlere karşı herhangi bir immünojenisite riskini ortadan kaldırmak gerekir GMP dereceli hiPSCs, türetmek için faktör içermeyen karakterize hiPSC-tabanlı türevlerini içerir ki. Bu protokol, her tür lentiviral yeniden programlanması hücrelerin geniş çapta uygulanabilir GMP dereceli koşullarına programlanması hücreleri dönüştürmek için yeniden üretilebilir bir yöntem sağlar.

Giriş

Yetişkin insan hücrelerinin, dört temel transkripsiyon faktörünün4,5 lentiviral temelli ekspresyonunun bir sonucu olarak epigenetik yeniden şekillenme ve yeniden programlama geçirebildiği gösterilmiştir. Yeniden programlama alanındaki önemli bir gelişme, protein ekspresyonunun6'nın kesin bir stokiyometrik oranına izin veren dört yeniden programlama transkripsiyon faktörünün tümünü barındıran tek bir eksize edilebilir lentiviral kök hücre kasetinin (STEMCCA) kullanılmasıydı. Ek olarak, belirli çok sayıda enfeksiyon aralığında transdüksiyon yapıldığında, STEMCCA yeniden programlama işlemi sırasında ağırlıklı olarak tek genomik entegrasyon olaylarına yol açabilir7. Cre / loxP teknolojisini kullanan STEMCCA'nın eksize edilebilir bir versiyonunun piyasaya sürülmesi ve ardından kök hücre hattının türetilmesinden sonra yeniden programlama vektörünün çıkarılması, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hatlarının türetilmesini sağladı8. Ek olarak, hiPSC'lerin terapötik uygulamalarını geliştirmek için, kseno içeren koşullardan kseno içermeyen koşullara kadar iyi üretim uygulamaları (GMP) dereceli hücre hattı dönüşümü için yeni, hızlı ve kolayca uygulanabilir bir metodolojinin uygulanması gerekiyordu. Burada, özellikle bir introna entegre edildiğinde, entegre gen ekspresyonu farklılıklarını ve varsayılan GMP koşullarına klinik dereceli hücre dönüşümünü daha kesin bir şekilde değerlendiren ilgili bir metodolojiyi tartışıyoruz.

Önceki araştırmalar, STEMCCA transdüksiyonundan sonra entegre genlerdeki gen ekspresyon farklılıklarını analiz etmek için yalnızca nispeten duyarsız mikrodizi transkripsiyonel analiz kullanmıştır3,9. Burada, entegre gen ekspresyonu farklılıklarını daha fazla incelemek için hassas kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizi metodolojisini tanıtıyoruz. Daha da önemlisi, mevcut güvenli liman kriterleri, viral entegrasyonlara sahip genlere sahip hiPSC'leri atmakta, böylece bu hücrelerin alt insan hücresel terapötikleri için uygulanabilirliğini sınırlamaktadır9. Mevcut durumun, tamamen karakterize edilmiş ve transgen içermeyen, tronik olarak yeniden programlanmış hiPSC'lerin kullanılmasıyla değişebileceğini öneriyoruz. Ek olarak, orijinal olarak kseno içeren koşullar10 altında türetilen çeşitli farklı hücre tiplerine kolayca uygulanabilen sağlam bir GMP dereceli hücre dönüştürme protokolü sunuyoruz. Bu, insan terapötik alaka düzeyini korumak için klinik dereceli koşullar gerektiren gelecekteki hücre yeniden programlama deneylerinin geliştirilmesi için önemli fırsatlar sağlar.

Bu metodolojiler, mevcut güvenli liman kriterlerinin, entegre introndan STEMCCA eksizyonu sonrası normal bir gen ekspresyon profilini koruyan karakterize edilmiş STEMCCA yeniden programlanmış hiPSC hatlarını içerecek şekilde genişletilebileceği bir temel sağlar. Ayrıca, insan dışı hayvan antijenlerinden arınmış klinik dereceli koşullara tam dönüşüm, daha önce yeniden programlanmış ve yalnızca kseno içeren koşullarda karakterize edilmiş daha birçok hücre tipinin dahil edilmesine yardımcı olacaktır. Bu metodolojiler bir araya getirildiğinde, ABD Gıda ve İlaç Dairesi'nin (FDA) sınırlı onaylarını insan embriyonik kök hücre (ESC) bazlı terapötiklerden hiPSC bazlı terapötiklere genişletmeyi düşünmesi için ikna edici gerekçelerdir11.

Son zamanlarda, tamamen karakterize edilmiş ve varsayılan klinik dereceli koşullara10 dönüştürülen faktörsüz bir hiPSC çizgisinin türetilmesini detaylandırdık. Burada, STEMCCA lentivirüsünü kullanarak hiPSC türetme protokolünü detaylandırıyoruz. Bu kök hücreler daha sonra bir eksizyon işlemine ve ardından gen ekspresyonu karakterizasyonuna tabi tutulur. Son olarak, hiPSC'ler yavaş bir dönüştürme metodolojisi ile GMP sınıfı koşullara dönüştürülür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not:. Bu yöntem, Awe ark 10'da rapor araştırmada kullanılmıştır.

STEMCCA 1. yeniden programlanması Yetişkin insan dermal fibroblastlarında

  1. Çözülme yetişkin dermal insan fibroblastlarının (HUFS), 2 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde geçiş 4 ya da daha düşük, su ile şişenin üst batırmak için özen.
  2. 15 ml konik bir şişe, insan fibroblast 1 ml'lik bir bulamaç koyun ve yavaş yavaş damla damla bir tarzda, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış, standart HUF ortam, 4 ml yerleştirmek, dimetil sülfoksit (DMSO) sulandırmak ve yeniden askıya hücreleri.
  3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'de şişe santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve / mi 100,000 hücre süspansiyonu elde etmek üzere ortam yeterli bir hacimde hücrelerin yeniden askıya ve daha sonra, altı gözlü bir plakanın bir kuyuya 2 mi ekleme,% 0.2 jelatin ile 20 dakika için önceden kaplanmış.
    NOT: hat ve durumun başına hücre eşit sayıda iyi bir kardeş fo seribaşı gerekiyorr hücre sayımı / enfeksiyon (İB) hesaplama çokluğu.
  4. Eşit hücreleri dağıtmak için ileri geri yan ve plaka yan Kaya. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edin.
  5. Transdüksiyon gününde hücre kardeş gelen sayısı (ler) de, ilk HUF sonra kaplama (lar) ile, takriben 24 saat elde edin.
  6. 2 x 10 8 TU, ya da eşdeğeri, lentiviral konsantre (STEMCCA) çözülme ve HUF medya 1 x 10 8 TU / ml sulandırmak.
  7. 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile takviye edilmiş HUF ortam içinde 10-İB oranında hücreleri nakletmek. Eşit kalıt kuyu karıştırın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edilir.
  8. Lentiviral transdüksiyon sonra yaklaşık 24 saat, standart insan pluripotent kök hücre (PSC) orta HUF medya geçiş.
  9. Gün 2 6 aracılığıyla, insan PSC orta günlük ortamı değiştirmek.
  10. 6. günde, iki% 0.2 jelatin kaplı 10 cm plakayıHUF ortam 12 CF1 fareler elde edilen 1,5 ila 10 x 1.75 ila 6 MEF'ler.
  11. Günde 7 günü, dikkatli olmak arasında eşit tüm hücreleri kaplama ile, bir 1:16 oranında altı plaka ve geçit bir kuyudan günde 7 yeniden programlanması fibroblastlar kaldırın 100'den fazla xg, kullanım oda sıcaklığı tripsin santrifüj değil bir gün önce MEF'ler ile kaplandı taze insan PSC medya, iki 10 cm tabak,. 37 ° C bir saat yönünde sarmal hareket ve yer hücre toplulukları dağıtmak,% 5 CO2, gece boyunca inkübatör nemlendirilmiş.
  12. Yaklaşık 48 saat sonra MEF'ler ve her gün üzerine yeniden programlanması hücreleri tohumlama sonra, taze medya ile harcanan insan PSC medya dışarı değiştirmek.
  13. 3-4 hafta sonra, bir 21 gauge iğne ile morfoloji gibi tipik ESC ile ayrı ayrı koloniler, çekme ve% 0.2 jelatin kaplı tek tek oyuklara belirli kolonilerin yaklaşık 8-10 bireysel parçaları yerleştirilerek 24 kuyucuklu plaka içerisine alt klonlamak 24-iyi plaka ön-çekirdekİnsan PSC ortamda CF1 fareler türetilen MEF'ler ile ed.
    NOT: seçilmiş kolonilerin büyütüldükten sonra, koloniler protein seviyesinde embriyoit vücut formasyonu ve Pluripotency markerlerinin ifadesi analizi ile pluripotent, özelliği gerekir.

2. Vektör Entegrasyon Site Analizi ve STEMCCA eksizyonu

  1. 10 anlatıldığı gibi olmayan kısıtlayıcı doğrusal amplifikasyon PCR ile STEMCCA entegrasyon siteyi analiz.
  2. Eski insan ESC orta kapalı aspire genomu, tüketim STEMCCA istenen alana bir entegrasyon sağlamak için tahlil sonra. Daha sonra, 24 saat süre ile standart PSC ortam 3 ml 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile konsantre Adeno Cre PuroR virüsünün 45 ul birleştirir.
  3. 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, karışık bir viral süpernatan aspire ve insan PSC ortamı ile iki kez yıkama hücreleri. 5 gün arasında bir süre için 2 ug / ml puromisin ile taze insan PSC ortamlarını ortam günlük wit değiştirmekh taze medya ve antibiyotik.
  4. 5 gün sonra, alt-klon 12-oyuklu bir plaka içerisinde,% 0.2 jelatin kaplı oyuklara üzerine 21-gauge iğne ile koloniler kalan CF1mice türetilen MEF'ler ile önceden kaplanmış ve yukarıda açıklandığı gibi genişletmek.
    Not: yeterli genişleme donmuş stok elde etmek üzere sonra besleyici içermeyen koşullar dönüştürme gereklidir. En hücreler başarılı bir şekilde transdüksiyona olmayacak ve kuluçkalama 5 günlük bir süre boyunca antibiyotiğe ölmek olarak en az% 95, kök hücre koloni ölümü bekliyoruz. Adeno Cre PuroR faktörü içermeyen koloni örnek reexposing, enfekte olmuş hücrelerin konukçu kromozomları içine 0.001-1 verimliliği% entegre olmasına rağmen, entegrasyon 13 oluştu doğrular% 100 hücre ölümünü sağlamak için puromisin için.
  5. Matris bir sıvı olduğu kadar, yaklaşık 2 saat (imalatçının önerileri) bir süre boyunca buz üzerinde ön aliquoted taban membran matrisi bir vial çözülme ve soğuk bazal ortam içinde 1:30 arasında nihai bir konsantrasyona kadar sulandırmak. Cooyuk başına 1 ml bir altı yuvalı plaka içindeki yuvalara istenen sayıda. 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
  6. Bir de daha önce MEF'ler ile kaplanmış 30 koloniler en az 20 (18 iğne, ya da bir cam veya plastik "ucu" kullanarak) çapraz çizgili. MEF canlandıran azaltmak ve plaka aktarmak dikkatli olun.
    1. Steril plastik pipet basit kullanımına açık alev üzerinde, daha karmaşık ısıtma, farklı yaklaşımların bir numara ile bir cam Pasteur pipet çekerek ve terbiye çapraz tarama cihazı üretmek ya, bizim olduğu gibi, 21- ve / veya 18 gauge iğne.
  7. Kaplanmış de sonra inkübasyon matrisi aspire.
  8. 200 ul pipet ile eski plaka hafif bir kazıma ile kolonilerin parçasını çıkarın ve dikkatli bir şekilde matris kaplı plaka taze kombine ortam 1, 3 ml içine koyun. 37 ° C,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. Değişim Medya 48 saat Pasajlanması sonra.
  9. Ticari DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak,% 80'den fazla confluency, eksize-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs genomik DNA ayıklayın.
  10. STEMCCA lentivirüs eksojen entegrasyon için özel primerler ile birlikte uygun bir eksizyon için Analiz: gDNA-Hendo-MycS ileri, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-ters, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. 10-uM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile Liyofilize primerler sulandırın.
  11. Aşağıdaki beş aşamalı protokol ile bir PCR çalıştırın: ilk denatürasyon 3 dakika boyunca 95 ° C'de; 15 saniye için 72 ° C 'de 15 saniye ve uzatılması için 62 ° C'de 20 saniye, primer tavlama için 98 ° C' de denatürasyon, aşağıdaki her bir 35 döngü 3 dakika boyunca 72 ° C 'de, tek bir döngü son uzatma eklenmiştir.
  12. Agaroz 1.5 gram tartılması ve 50 mi 1 x Tris-asetat-EDTA tampon içine yerleştirerek bir% 3 agaroz jel olun. Agaroz kadar Mikrodalga çözülmüş ve DNA jel leke olarak yer p de olduğuroper seyreltme, karıştırma, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca katılaşmaya jel kasetine doğru hacminin dağıtımı.
  13. PCR ürününün yüklenebilir 12 ul% 3 agaroz jel içine yükleme boyası 3 ul ile karıştırılır. 80 V de 30 dakika boyunca jel başlat
  14. Uygun eksizyon gösteren bir grubun olmaması için ultraviyole ışık ile gözünüzde canlandırın.

Öncesi ve Sonrası-kesilmiş hiPSCs gelen Kantitatif PCR kullanarak Gen İfadesi Farklar 3. kantitasyonu

  1. Ticari RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak kesilmiştir-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs toplam RNA ayıklayın.
  2. -Ters uyarlamak üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari kitler kullanılarak toplam RNA 1 ug kadar. Demirli-oligo (dT) 18 ve rasgele heksamer primer kullanın.
    NOT: PCR protokolü 4 kb daha fazla veya daha az gen transkriptleri için özel olduğundan emin olun. Spesifik primerler hangisi gen STEMCCA başlangıçta entegre i için yapılan gerekecektirnGoogle'a.
  3. 20 mcM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile liyofilize astar sulandırın.
  4. 10 mcM UPL prob oluşan reaksiyon 20 ul, 2x LightCycler 480 Problar Lisans başına numune 5 ng kullanın ve ileri 20 uM ve geri primerler.

GMP dereceli Koşullar içine 4. Dönüşüm

  1. GMP dereceli koşullarına üzerinde post-eksize hiPSCs geçiş ilk gününde, kombine insan PSC oluşan medya karışımı yapmak ortam 1 (kombine medya 1) ve klinik notu iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu medya (kombine medya 2 ) 80:20 oranında.
  2. Aspire eski kombine medya 1 ve 80:20 oranında yeni kombine medya 1 ve 2, önceden ısıtılmış 3 ml, koyun kapalı. Bu özel oran ile 3 gün boyunca günde ortamı değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
  3. 4. günde, 50:50 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Eski orta ve Replac kapalı aspire50:50 oranında bir araya ortam 1 ve 2 ile önceden ısıtılmış ortam, e. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
  4. 7. günde, bir 20:80 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Aspire eski orta kapalı ve 20:80 oranında kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
  5. 100 oranında: günde 10, bir 0 kombine Ortam 1 ve 2 yapmak. Aspire eski orta kapalı ve 0 kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin: 100 oranında. Bu özel bir oranda her gün medya değiştirin. Hücreler, tam olarak tanımlanmış kseno-içermeyen ortam artık. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
    Not: Bu, tüm dönüştürme işlemi sırasında bir 18 gauge iğne ile rutin pasajı uygun koloni büyüklüğü ve yoğunluğu sağlamak için gereklidir. S Planıkoloni boyutu akma ve farklılaşma olarak her 4-5 gün hücreler assaging.
  6. Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi tanımlanmış bir kseno-serbest alt-tabaka ile, altı gözlü bir plakanın üzerindeki çukurların kaplayın on.
  7. Mekanik geçit konfluent iyi, zaten 18-gauge iğne ile altı-kuyu plaka, kseno ücretsiz medya koşullarını dönüştürülür. Önemlisi, medya pre-condition için pasaj önce, 1 saat 1x ROCK inhibitörü olan hücreler üzerinde yeni medya (kombine medya 2) yerleştirin.
  8. Hücreler transfer ediliyor, yeni plaka kapalı sentetik substrat solüsyonu aspire. Eski plaka kök hücre kümeleri içeren tüm ortamları çıkarın ve yeni plaka transfer.
  9. (Kez inkübatör içinde, doğrudan herhangi bir şekilde dokunulmaz olan ideal plakaları) geri az fiziksel rahatsızlık ile 2 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO 2 kuvöz içine yerleştirin hücreleri maksimum eki izin vermek.
    NOT: Hücreler günlük medya değişiklikleri gerektirir. Sürekli passaging her 4 günde önemli olacaktır. 21-gauge iğne, optimum ESC-benzeri morfolojisi (yüksek Nükleositoplazmik oranı) ile kolonilerin geçişi yalnızca parçalarını kullanarak. Bu iyi büyür ve sonunda homojen koloniler verecek uygun hiPSC koloniler için seçimi sağlayacaktır. Kolonilerin gibi ESC derivasyon genel zaman ilk kombine medya değişiminden sonra 15-20 gün arasındadır.
  10. 18-gauge iğne ile ilk çapraz-hatch ile kolonilerin tüm GMP dereceli sonrası eksize hiPSCs aşağı dondurun. 200 ul pipet kullanılarak atık tüm parçaları kaldırın ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml konik bir şişe ve santrifüj hücreleri ihtiva eden tüm medya aktarın.
  11. Hücreler santrifüje tabi olsa da, soğuk kombine ortam 2 eşit hacimlerde oluşan ve% 7.5 nihai bir DMSO konsantrasyonu ile orta donması dondurma ortamı olun.
  12. Hücreler pelet sonra, eski orta aspire ve dondurma medya ile pelet yeniden askıya-damla damla. Hemen trdonma şişelere ansfer ve ° C derin dondurucuda bir -80 koydu.

5. karakterizasyon GMP dereceli Post-eksize hiPSCs

  1. 3. adımda qPCR yöntemleri de belirtildiği gibi takip anahtar Pluripotency belirteçlerinin (Sox2 Oct4 ve Nanog) aynı adımları Tablo 1'de listelenen primerler kullanılarak ifadesinin miktarını belirlemek için, QPCR kullanarak Pluripotency belirteçlerinin sonrası dönüşüm uygun bir ifade sağlamak için Aşama 3 'de gösterildiği gibi, aynı adım.
  2. Kullanımlar, daha önce 10 yayınlanan kitte yer alan standart koşullara uygun olarak, insan olmayan bir sialik asit Neu5Gc (N -glycolylneuraminic asit) tespit etmek için akış sitometrisi.
  3. Yavaşça 1x Fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanarak, hücrelerin bulunduğu hücre kültürü plakaları yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x ayrışma ajanı kullanılarak koloni ayrıştırmaları.
  5. Aşama 5.4, 5-dakikalık inkübasyon süresi esnasında verilen engelleme çözeltisi (hazırlamakbuz soğukluğunda PBS içinde bloke edici madde, bir% 0.5 yaparak Kit) birleştirildi.
  6. Flow sitometri analizi için tüplerin aşağıdaki kümesi Etiket: lekesiz; 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) DAPI; Kontrol antikoru 1: 200; Birincil antikor, 1: 200; İkincil antikor, 1: 200 Eşek anti-tavşan IgG'si (H + L); Örnek MEF'ler; Matris üzerinde örnek sonrası eksize hücreler; ve Numune sentetik alt tabaka üzerine hücreleri sonrası çıkarıldı.
  7. Yavaşça, 15 ml konik bir tüp çözeltisi ve aktarma içeriği bloke 2 ml ilave adım 5.4 hücre agregatları neden olacaktır. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 80 x g'de santrifüjleyin.
  8. Adım 5.7 belirtildiği gibi çözüm ve santrifüj engelleme ile iki kez hücreleri yıkayın.
  9. Yavaşça her bir antikorun uygun seyrelme hacmi ile bloke etme çözeltisi 100 ul, yaklaşık 1 x 10 6 hücre yeniden askıya. Yumuşak, 1 saat boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin.
  10. Adım 5.8 gibi yıkar üç kez tekrarlayın.
  11. Seyreltici Bu yüklenmiştir 400 ul hücre pelletini yeniden askıyaffer 1 ile (kit): tüpler 2, 6, 7 için DAPI 100 ve 8 adımda 5.6 altında listelenen.
  12. 40 mcM süzgecinden Gerinim hücreleri ve akış sitometresinin koşuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu STEMCCA Lentiviral bazlı yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, klinik sınıf faktörü içermeyen hiPSCs türetmek için bir protokol mevcut. Şekil 1A MEF'ler bir tabakası üzerinde STEMCCA yaklaşımı ile yeniden programlama sonra, üç farklı önceden kesilmiş hiPSC hatları temsili görüntüsünü gösterir. STEMCCA yeniden programlama yaklaşımının temel avantajı, farklı araştırma grupları ve yerlerde, birden fazla bilim adamları tarafından elde tutarlı yeniden programlama başarı yatıyor. Şekil 1B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz faktör ücretsiz hiPSCs kaynaklanan ve gelecekteki insan tedavide mansap hücre farklılaşması için GMP dereceli koşulları içine bu hücrelerin dönüştürerek onları klinik açıdan yapma bir metodoloji açıklar. Bu protokol, hücre tiplerinde çeşitli geniş çapta uygulanabilir olsa da, bağlı hastadan çıkarma kolaylığı ve kişiye özel insan terapötiklere uygulanabilirlikleri, insan dermal fibroblastları yeniden programlamak seçtik. Sınırlamalar klinik açıdan anlamlı hücre türevleri içine tam farklılaşma kadarıyla giderildiği so...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

James A. Byrne (JAB) ve Agustin Vega-Crespo, Fibrocell Science, Inc.'den araştırma fonu alıyor. JAB, Fibrocell Science, Inc.'in bilimsel danışmanıdır. Başka hiçbir yazarın açıklayacak herhangi bir rakip çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Patrick C. Lee, Cyril Ramathal ve Saravanan Karumbayaram'a (SK) iPSC türetme ve karakterizasyon deneylerinin gerçekleştirilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz; iPSC analiz deneylerini gerçekleştirmek için Aaron Cooper; Vittorio Sebastiano ve Renee A. Reijo Pera, ilk yeniden programlama çabalarını yönettikleri için; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack ve Donald B. Kohn, klinik dereceli iPSC'lerin dönüştürülmesine ve karakterizasyonuna izin veren UCLA GMP tesislerinin kurulmasını yönetmek için; Gustavo Mostoslavsky, bize STEMCCA polisistronik yeniden programlama vektörünü sağladığı için. Bu çalışma, güvenli kişiselleştirilmiş hücresel terapötikler oluşturmak için Fibrocell Science ve Dermal Mezenkimyal Olarak Elde Edilen Türevler için Klinik Araştırmalar (CIDMOD) Girişimi ile yapılan bir araştırma işbirliğine dayanmaktadır. Bu çalışma, UCLA'daki Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi, Phelps Aile Vakfı, Fibrocell Science, Inc. ve UCLA CTSI Scholar'ın JAB'a verdiği fonlarla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Media and reagents
DMEM/F12 (bazal media)Invitrogen (Carlsbad, CA, ABD)11330057
Fetal sığır serumuInvitrogen16000044
Minimum esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100xInvitrogen11140050
Glutamax, 100xInvitrogen35050-061
PenStrep, penisilin-streptomisin, 100xInvitrogen15140-1224 ° C'de çözülme; C, aliquot ve &eksi olarak saklayın; 20 derece > C
Nakavt serum replasmanıInvitrogen108280284 ° C'de çözülür; C, aliquot ve &eksi olarak saklayın; 20 derece > C
Tripsin / EDTA,% 0.5İnvitrojen15400-0541x PBS'de% 0.05'e kadar seyreltin
Stok Temel fibroblast büyüme faktörüGlobalStem (Rockville, MD, ABD)GSR-200110 & mikroya yeniden oluşturun; % 0.1 sığır serum albümininde g / ml stoğu, 1x PBS'de çözülür ve & eksi'de saklanır; 80 derece > C
β-merkaptoetanolMillipore (Billerica, MA, ABD)ES-007-E
Matrigel (bazal membran matrisi)BD Biosciences (San Jose, CA, ABD)356231Stok Matrigel şişesini 10: 12 seyreltme için buz üzerindeyken 2 ml DMEM / F2 ile seyreltin. Aliquot ve &eksi mağaza; 20 derece >C.
CELLstart (Sentetik Substrat)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (Cambridge, MA, ABD)04-0012-02
PuromisinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probları MasterRoche (Basel, İsviçre)4707494001
ProFreeze-CDM Orta/dondurucu ortamLonza (Basel, İsviçre)12-769E
Dimetil sülfoksitSigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)D8418
PBSInvitrogen14190-250
100 BP DNA Merdivenİnvitrojen15628019
SYBR Güvenli DNA Jel Lekesi 10.000xInvitrogenS33102
AgaroseBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, ABD)161-3101
Domuz derisinden elde edilen jelatinSigma-AldrichG1890-100GPBS'de% 0,2 oranında stok yapın, otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
mTeSR1Kök Hücre Teknolojileri (Vancouver, BC, Kanada)5850Ek 5x'i temel ortam, alikot ile birleştirin ve 4 ° C'de saklayın; 2 haftaya kadar C.
Stemedia NutriStem XF/FF Kültür OrtaStemgent05-100-1A4 ° C'de Çözülme; C O/N, alikot ve 4 &°C'de saklayın; 2 haftaya kadar C.
PrimocinInvivoGen (San Diego, CA, ABD)ant-pm-1
Aktataz (Dissosiyasyon Reaktifi)InvitrogenA1110501
Eşek anti-Tavuk IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, ABD)703-546-155
Polibren / transfeksiyon ajanıMilliporeTR-1003-G
Plasticware
>12 kuyulu plakalarVWR (West Chester, PA, ABD)29442-038
6 oyuklu plakalarVWR29442-042
10 cm plakalarSigma-AldrichZ688819
18 gauge iğneFisher Scientific (Pittsburgh, PA, ABD)148265D
21 ayar iğneFisher Scientific14-829-10D
Equipment
BD LSRII Akış SitometresiKSystem by Nikon (Tokyo, Japonya)
BD FACSDiva Sürüm 6.1.3 YazılımBD Biosciences
Kits
PureLink Genomik DNA Mini KitiInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR KitiKAPA Biosystems (Wilmington, MA, ABD)KK2601
Yüksek Saf RNA İzolasyon KitiRoche11828665001
Transkriptör İlk İplikli cDNA Sentez KitiRoche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Temel Paket KitiSialix (Newton, MA, ABD)Temel Paket
Media
Birleşik medya 1Kök Hücre Teknolojileri ve StemgentmTeSR1 ve Nutristem
Combined media 2StemCell Technologies'in eşit parçalarından oluşur ve StemgentTeSR2 ve Nutristem
HUF MediaDulbecco'nun eşit parçalarından oluşur s değiştirilmiş Kartal' % 10 fetal sığır serumu, 1x esansiyel olmayan amino asit, 1x Glutamax ve 1x Primocin
İnsan Pluripotent Kök Hücre OrtamıDMEM / F12 ile desteklenmiş s orta / F12 % 20 nakavt serum replasmanı, 1x Glutamax, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1x Primosin, 1x beta; - merkaptoetanol ve 10 ng / ml bazik fibroblast büyüme faktörü
DMEM/F12, Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta/F12; PBS, fosfat tamponlu tuzlu su.
, , .

Kaynaklar

  1. Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
  2. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
  3. Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
  4. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  7. Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  8. Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
  9. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
  10. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
  11. Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
  12. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
  13. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
  14. Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
  15. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  16. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İnsan İndüklenmiş Pluripotent Kök HücrelerLentiviral Yeniden ProgramlamaFaktörsüz hiPSC'lerGenomik DNA EkstraksiyonuAdeno-Cre Virüs EksizyonuGMP Derecesine DönüştürmeKseno-free KoşullarAkış Sitometrisi AnaliziPluripotens Marker EkspresyonuKlinik Derece hiPSC'ler
Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.