Method Article

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukozal patojenlere karşı savunma Erken bir epitel bariyer ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, hem oluşur. Her iki immunocompetency ve bunların interkom, enfeksiyonlara karşı korunması için çok önemlidir. Bir patojen ile epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri etkileşimleri en karmaşık davranış zaman ve mekan içinde izlerken vivo, incelenmiştir. Ancak, mevcut modeller mukozal düzeyinde patojenler ile savaş kolay uzay-zamansal görüntüleme için izin vermez.

Burada geliştirilen model çocuk zebrabalıkları statik taşıma içine mantar patojeni, Candida albicans, doğrudan enjeksiyon sureti ile bir mukozal infeksiyonu oluşturur. Ortaya çıkan enfeksiyon mukozal hastalık gelişimi boyunca epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücre davranışının yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu yöntemin çok yönlülük ph yol açan bağışıklık olaylar ayrıntılı dizisini prob konağın sorgulama için izin veriragocyte işe özel hücre tipleri ve koruma moleküler yolların rollerini incelemek ve. Buna ek olarak, immün bir fonksiyonu olarak patojen davranışı floresan protein ifade C ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir albicans arasından seçilir. Konak-patojen etkileşimi artmış uzaysal çözünürlüğü açıklanan hızlı swimbladder diseksiyon tekniği kullanılarak da mümkündür.

Burada anlatılan mukozal enfeksiyonu modeli mukozal kandidiazis çalışma için değerli bir araç yapma, basit ve son derece tekrarlanabilir. Bu sistem, aynı zamanda, normal epitel yüzeyleri boyunca enfekte mikobakteriyel bakteriyel veya viral mikropların gibi diğer mukozal patojenlerin geniş çapta çevrilebilir olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukozal enfeksiyonlar, patojenlerin sistemik ortama erişmesine izin veren epitel bariyerinin hasarı nedeniyle hayatı tehdit eden kan dolaşımı enfeksiyonlarına yol açabilir1,2. Ek olarak, mukozal enfeksiyonlar dışarıdan içerildiğinde bile önemli immünopatolojiye neden olabilir3-5. Kommensal tek hücreli mantar Candida albicans, popülasyonun çoğunda ağız boşluğunda ve diğer mukozal bölgelerdebulunur 6-9. Normalde doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtlar tarafından içerilmesine rağmen, doğuştan gelen immün kusurlar ve tıbbi müdahaleler ciddi mukozal kandidiyazise yol açabilir. Epitel bariyerine yapılan saldırı, vulvo-vajinal kandidiyazis durumunda olduğu gibi, immünopatolojinin yanı sıra hayatı tehdit eden yaygın hastalık riskinin artmasına neden olur, ayrıca C. albicans kolonizasyonu akciğer immün homeostazı ile ilişkilendirilmiştir10,11. Yaygın kandidiyazis şu anda yoğun bakım ünitelerinde dördüncü en sık görülen kan dolaşımı enfeksiyonudur12 ve %40'a varan mortalitesi onu önemli bir endişe kaynağı haline getirmektedir. Otoimmün hastalıklar, kanser veya organ nakli olan hastalar için immünomodülatör tedavilerdeki artış nedeniyle, bu patojen ile mukozal immün kompartman arasındaki etkileşimi anlamak zorunludur.

Mukozal düzeyde C. albicans hücre etkileşimleri ile ilgili hücre biyolojik ilerlemelerinin çoğu in vitro13-15 ve murin modelleri16-18'den gelmektedir. Bu yaklaşımların her ikisinin de belirgin avantajları vardır, ancak sağlam bir konakta canlı hücreleri yüksek çözünürlükte görüntüleme yeteneği, enfeksiyonun zamansal ve mekansal karakterizasyonunu sınırlamıştır. Bu çalışmalar için, patojen, doğuştan gelen bağışıklık ve epitel hücrelerinin etkileşiminin sağlam bir omurgalı konakçıda görselleştirilebildiği bir in vivo modele ihtiyaç vardır.

Zebra balığı, esas olarak şeffaflığı ve genetik manipülasyona elverişliliği nedeniyle insan hastalıklarının anlaşılması için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Hücre ve organ gelişimi, gelişmekte olan timus19'daki T hücresi davranışı veya hücre içi mikobakteriler vefagositler 20-22 arasındaki savaş gibi yeni bağışıklık hücresi davranışlarının tanımlanmasına yol açan mükemmel ayrıntılarla görüntülenmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, zebra balıklarında bağırsak mikrop-konak etkileşimlerini tanımlamış ve bağırsak yolunun mikrobiyal kolonizasyonunun konak bağırsak fizyolojisini ve diğer enfeksiyonlara direnci etkilediğini göstermiştir23,24. Ayrıca, bağırsak epiteli yoluyla enfeksiyon çeşitli patojenler için tanımlanmıştır.

Bağırsak yolunun aksine, yüzme kesesi daha izole ve tamamlayıcı bir mukozal modeli temsil eder. Bu organ, gelişmekte olan bağırsak tüpünün bir uzantısıdır ve karaciğer ve pankreasın önünde oluşur25,26. Yüzey aktif madde, mukus ve antimikrobiyal peptitlerüretir 27,28 ve anatomik olarak ve ontogenetik olarak bu organ, memeli akciğerinin29,30 bir homologu olarak kabul edilir. Pnömatik kanal zebra balığında bağırsağa bağlı kaldığından, bu, daldırma enfeksiyonunun doğal olarak meydana gelmesine izin verir. Dikkat çekici bir şekilde, Candida türleriyle balıkların bilinen tek doğal olarak meydana gelen enfeksiyonları, yüzme kesesindeki C. albicans enfeksiyonlarıdır31. Yakın zamanda, C. albicans'ın yüzme kesesini enfekte ettiği deneysel bir daldırma enfeksiyon modelini tanımladık ve bu enfeksiyonun C. albicans-epitel etkileşiminin bazı ayırt edici özelliklerini in vitro32,33 olarak özetlediğini bulduk.

Burada sunulan yöntemde, orijinal daldırma enfeksiyon modeli, C. albicans'ın döllenmeden 4 gün sonra (dpf) zebra balığının yüzme kesesine doğrudan enjekte edilmesiyle geliştirilmiştir. Bu, enfeksiyonun hassas zamansal kontrolünün yanı sıra yüksek oranda tekrarlanabilir bir aşılamaya izin verir. Zebra balığı modelinin çok yönlülüğü ile birlikte ayrıntılı intravital görüntülemeye izin verir. Bu yöntemle neler yapılabileceğine bir örnek olarak, C. albicans büyümesinin mekansal-zamansal dinamiklerini ve enfeksiyon bölgesine nötrofil alımını sunuyoruz. Zebra balığı yüzme kesesi dokusunun intravitalal olarak görüntülenmesi zor olduğundan, floresan sinyalini ve mikroskobik çözünürlüğü iyileştiren hızlı bir yüzme kesesi diseksiyon tekniği de sunuyoruz. Bu yöntemler, mantar, immünolojik ve su ürünleri araştırmaları için araç kutusunu genişletmenin yanı sıra, mukozal yüzeylerin diğer mantar, bakteriyel veya viral enfeksiyonlarını modellemek için çevrilebilecek yeni bir enfeksiyon yolunu tanımlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm Zebra balığı bakım protokolleri ve deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolü A2012-11-03 altında NIH kurallarına uygun olarak yapıldı.

4 Gün Post Döllenme 1. Zebra balığı Yetiştirme

  1. Başka bir video 34 'de gösterildiği gibi, ilk 3 saat sonra döllenme içinde, AB zebrafish veya başka bir transjenik çizgiler toplayın.
  2. (0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0,33 mM MgCl2, 2 mM HEPES, pH 6.8, 5 mM NaCl) metilen mavisi ile (0.3 ug / ml nihai E3 ortam 150 ml içeren 15 cm'lik bir petri tabaklarında 120 yumurta inkübe 12/12 açık / koyu fotoperiyodun ile 33 ° C inkübatör konsantrasyon).
  3. E3 + propiltiyourasil'i (1-fenil-2-tioüre, 10 ug / ml nihai konsantrasyon) ile 6 saat sonra ortam yerine ve ölü yumurta çıkarın.
  4. 2 gün sonra, taze E3 + propiltiyourasil'i Ortamı alışverişi, 33 ° C'de 4 gün boyunca inkübe edilir.

2. içindejection mikro-iğne hazırlanması

  1. Aşağıdaki ayarlarla bir iğne çektirmenin kullanarak bir mikro-iğne içine; borosilikat kılcal (ID 0.69 mm OD 1.2 mm) çekin (550 Heat, 0 çekin, 130 Velocity 110 Saat).
    NOT: Ayarlar filamanın değişecektir (Şekil 1) benzer şekilli mikro-iğneler elde etmek filament ve yeni bir filaman takıldığında yeniden ayarlanması gerekir.
  2. 0.4 um filtreden fosfat tamponlu salin 3 ul mikro-iğne ile doldurun (; 137 mM NaCI; 2.7 mM KCI, PBS, 10 mM, Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4, 7.4 pH) 20 ul Microloader pipet kullanılarak ucu.
  3. Bir basınçlı enjeksiyon sistemine bağlı bir micromanipulator bir mikropipet tutucu mikro-iğne ayarlayın. 30 PSI enjeksiyon basıncını ve 30 msn de darbe süresini ayarlayın.
  4. Iğne 1/5 su içinde olana kadar damıtılmış su ile bir petri kabı kullanarak, mikro iğne düşük. Mikro-iğne, wi Klipsu seviyesinin hemen altında ince cımbız th. Sudan mikro-iğne getir ve bir bolus görünene kadar pedalına birkaç kez itin.
  5. Çeşidi bir damla bir daldırma yağı ile katmanlı bir hemositometrede mikro-iğne düşürerek bolus çapını ölçün. İstenilen hacim elde etmek için darbe süresi ayarlayın (Tablo 1).
  6. Yağda stabil kalır (bolus hacmini artırır eğer basıncı düşürmek ve Kapsül hacmi azalırsa backpressure artırmak) için bolus için backpressure ayarlayın. Her mikro-iğne darbe süresini kaydedin.
  7. Bir Microloader pipet kullanarak aspire mikro-iğne PBS çıkarın ve enjektör geri yerleştirerek ve sürekli darbe anahtarı çevirerek sol-over PBS sınırdışı. Her mikro-iğne Rezervasyon.

3. Candida Hazırlık

  1. Streak Candida albicans kodon-optimize dTomato, GFP, BFP, EOS veya Far ile transformeBir maya peptine dekstroz (YPD) agar (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton üzerine steril ahşap takoz kullanılarak donmuş stoktan (-80 ° C hazır% 25 gliserol), kırmızı, 20 g / L dekstroz , 20 g / L ağar; otoklava Petri kapları içinde 25 ml boşaltılmıştır) ve 30 ° C de bir gece boyunca inkübe edilir.
  2. Steril bir ahşap takoz kullanılarak bir koloni almak ve YPD bir sıvı (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz, 5 ml kadar inoküle, Otoklavdan geçirilen ve aseptik 16 x 150 mm cam kültürü, 5 ml bölünebilir borular).
  3. 60 rpm'de bir silindir tambur içinde 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  4. C. 1 ml toplayın 1.7 ml steril santrifüj tüpü içine albicans kültürü ve transferi.
  5. Sn bir çift için 5.000 xg'de santrifüj. Süpernatant boşaltın ve iyice steril PBS, girdap 1 ml ekleyin. Iki kez bu işlemi tekrarlayın.
  6. Steril PBS içinde 1000: 1 ml stok 1 seyreltilmesi ile bir hemositometre kullanılarak kolonileri sayın.

4. Zebra balığı EnjekteSwimbladder

  1. Bir 33 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika için bir enjeksiyon çanak (% 2 agaroz) ısıtın.
  2. İstenen zaman, herhangi bir zebrafish aspire olmadan 25 mi pipet kullanılarak enjekte balık içeren 15 cm Petri için E3 + propiltiyourasil'i, 150 ml, 100 çıkarın.
  3. Geri kalan, 50 ml ortam (nihai konsantrasyon 200 mg / ml) bir 4 mg / ml tampon tricaine metan sülfonat stok (TR) 2 ml ekleyerek zebrabalıkları dpf 4 anestezisi ve 15 dakika boyunca bekleyin.
  4. Bir mikroskop altında, şişirilmiş bir statik taşıma ile balık seçin. Balık aynı zamanda MPO nötrofil dağıtımı, homojen fenotip için o anda taranabilir: GFP çizgi mikroskop diseksiyon bir Epifloresans kullanarak.
  5. C seyreltin orijinal konsantrasyon albicans stok 1.5 x 10 7 koloni PBS ml (cfu / ml) oluşturan üniteler için (adım 3.8).
  6. Plastik bir transfer borusu kullanılarak enjeksiyon çanak üzerine 30 zebrafish aktarıntte ve aşırı ortamı çıkarın.
  7. Bir balıkçı tel aracı (0.012 inç çaplı olta borosilikat kılcal içine süper yapıştırılmış) kullanarak, dikey enjeksiyon çanak tutarak 10 balık, 3 çizgiler yapmak ve dikey balık yönlendirmek.
  8. Fazla ortamı çıkarın.
  9. İyice 1.5 x 10 7 cfu ile tüp vorteks / mL C albicans arasından seçilir.
  10. C 3 ul bir mikro-iğne doldurun albicans, yeni bir Microloader pipet kullanarak ve uygun ayara darbe süresini ayarlamak (adım 2.9 bakınız).
  11. Swimbladder (Şekil 3A) arkasına doğru amaçlayan, mikro-iğne ve balık kafası arasındaki 20 ° lik bir açı yapmak için enjeksiyon çanak döndürün.
  12. , Statik taşıma içine mikro-iğne itin iğne deliği lümen olduğundan emin yapma, ve bir kez pedalına basın.
  13. Her balık için tekrarlayın ve E3 bir çanak sel bir kurtarma çanak (25 ml E3 + PTU) transferd kurtarma çanak içine boşalma.
  14. Enjeksiyon çanak başka 30 balık aktarın.
  15. İyice ile dolu yeni bir mikro-iğne ile enjeksiyon tekrarlayın C vortekslendi albicans arasından seçilir.
  16. Gerekirse kirlenmesini önlemek ve ayrı bir kurtarma çanak (adım 4.10) aktarmak için farklı bir enjeksiyon çanak kullanarak, PBS kontrol enjekte edilerek bitirin.

5. İstenilen İnokulum için Balık tarama

  1. Çözülene kadar mikrodalga ve 37 ° C'ye kadar soğutularak kaynatma, E3 40 ml 0.4% agaroz çözeltisi (LMA) düşük eriyik 160 mg ekleyerek, düşük erime sıcaklığı olan agaroz için 40 mi hazırlayın. Bir kez soğutulduğunda TR (nihai konsantrasyon 200 mg / ml) 400 ul ekle.
  2. (25 mL, E3 + propiltiyourasil'i, nihai konsantrasyon 200 mg / ml içine TR sadece 1 ml ile adım 4.3) de anlatıldığı gibi, 30 dakika sonrası nekahattan sonra, balık uyuşturan.
  3. Bir kilo tekne LMA 2 ml (mümkün olduğunca az medya ile) Transfer 30 balık.
  4. Aspire ayrı bir transfer pipeti ile balık ve sadece 10 x 6 merkez kuyu kullanılarak, 96 çukurlu bir görüntüleme plaka içine LMA'nın 1 damla balık plaka.
  5. Ekranın tüm balık görüntüleme plakasına yüklenir kadar tekrarlayın.
  6. Ortam, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya edelim.
  7. Onlar cam alt ile temas halinde emin, kendi tarafında balık yerleştirin.
  8. Bir ters Epifloresans / konfokal mikroskop ve uygun filtre üzerinde 20X objektif kullanılarak, C sayısını kaydetmek Her balığın statik taşıma albicans maya hücreleri.
  9. , Statik taşıma 15-25 maya hücreleri ile balık (veya arzu edilen inokulum) Select ötenazi seçili olmayan balık (E3 TR 800 ug / ml) tarafından E3 + propiltiyourasil'i 50 ml derin Petri kabı seçilen balık dönüş görüntüleme plaka seçilen kuyulara E3 3 damla ekleyerek ve plastik transfer pipet ile balık aspire.
  10. İstenen süre için 33 ° C'de inkübe edin.

6. Balık Sonrası tarama Görüntüleme

  1. İstediğiniz anda, görüntü balık içeren derin Petri kabı E3 + PTU medya 50 ml 25 kaldırın.
  2. (25 mi, E3 + propiltiyourasil'i kalan, nihai konsantrasyon 200 mg / ml içine TR sadece 1 ml ile adım 4.3) de anlatıldığı gibi balık anestezi uygulayın.
  3. Uygun bir şekilde 96 oyuklu görüntüleme levhasının ve yerine balık Plate (5,3-5,7 adım).
  4. Uygun lazerler ve emisyon filtreleri kullanarak konfokal mikroskobu ile görüntü. İlk diferansiyel girişim kontrast (DIC) kapsamında 4X objektif kullanarak balık odaklama ve 2 mikro saniye / piksel hızı ve 1024 x 600 piksel en boy oranı ile tarama modunda konfokal lazerler ile 20X objektif kullanarak ilgi bölgenin görüntülerini elde. 3 kare Kalman filtresi modunu uygulayarak, 1 mikron adım boyutu ile Z-yığınlar edinin.
  5. 50 ml E3 + PTU veya individua içine derin bir Petri kabı dönl kuyuları (24 bölümlü kültür çanağı, 3 mi E3 + PTU) ile 33 ° C'de inkübe edin.

7. swimbladder Dissecting

  1. Yüksek vakum yağ ile bir 10 ml şırınga doldurun.
  2. % 2'lik bir LMA (agaroz E3 8 ml düşük erime 160 mg adım 5.3) hazırlayın.
  3. İstediğiniz anda, balık (adım 5.2) uyuşturan.
  4. Transferi 10 E3, 1 ml ile 1.7 ml santrifüj tüpüne balık ve santrifüj tüpüne 4 mg / ml 'Tricaine (nihai konsantrasyon 800 mg / ml) 200 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edilerek euthanize.
  5. Bir mikroslayd (75 x 25 mm, Şekil 2) 1 cm arayla, bir meydanda vakum gres 4 damla koyarak bir görüntüleme cam slayt hazırlayın.
  6. Meydanın ortasında% 2 LMA 2 damla yerleştirin.
  7. Bir mikroskop altında ayrı bir cam slayt bir balık yerleştirin ve kalp atışlarımı durduğundan emin olun, aşırı su çıkarmak.
    8. sol cımbız ile sabit bir pozisyonda kafa korumak ve doğru cımbız (Şekil 4A) ile ön gut aşağı çekerek swimbladder teşrih.
  8. Sindirim sisteminden ayıran, sol cımbız ile pnömatik kanal tarafından swimbladder Pick up ve katılaşır önce% 2 LMA merkezine yerleştirin.
  9. Görüntüleme cam slayt üstüne bir kapak kayma (18 x 18 mm) yerleştirin ve vakum gres yanı sıra, LMA (Şekil 2) dokunana kadar itin.
  10. Diseksiyon 10 dakika içinde Resim aşama 6.4'te tarif edildiği gibi. Adımı tekrarlayın 7,7-7,11 diğer balık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Posterior statik taşıma içinde Mikroenjeksiyon

Burada sunulan deneysel yöntem C tutarlı bir doz enjeksiyon açıklar zebrabalıkları dpf 4 statik taşıma albicans maya hücreleri. Daldırma modeli ile Önceki iş önerdiği C swimbladder immün yanıt Candida albicans, memeli mukozal kandidiyazis 32 benzerdir. Burada daha basit, tekrarlanabilir ve hızlı bir modifiye enfeksiyon yöntemi göstermektedir; zebrabalıkları bir kaç yüz enjekte edilmiş ve bir kaç saat i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Swimbladder mikroenjeksiyon hastalığı modeli Gelişmeler ve sınırlamaları

Burada sunulan model Gratacap et al mukozal kandidiyaz daldırma modelinin bir uzantısıdır (2013).; Bu kontrollü bir enfeksiyon zaman avantaj, yüksek ölçüde tekrarlanabilir enfeksiyon dozu ve bu nedenle geliştirilmiş verimlilik ekler. Biz burada non-invaziv ayrıntılı olarak enfeksiyon dinamikleri zamansal belgeleri yanı sıra statik taşıma yüksek çözünürlük ex vivo görüntüleme izin yeni yöntemler g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar cömertçe α-katenin sağlamak için Dr. Le Trinh ve Dr. Tobin teşekkür: sitrin balık hattı ve Bill Jackman bize onun laboratuarında filme yapmak için izin için. Yazarlar fon kaynaklarını Ulusal Sağlık Enstitüleri (Hibeler 5P20RR016463, 8P20GM103423 ve R15AI094406) ve USDA kabul (Proje # ME0-H-1-00517-13). Bu yazının ana Tarım ve Ormancılık Deney İstasyonu yayın sayısı 3371 olarak yayınlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 ml tüplerAxygenMCT-175-C
Derin Petri kaplarıFisher Scientific89107-632
Transfer pipetleriFisher Scientific13-711-7M
Maya ÖzüVWR Scientific90000-726
PeptoneVWR Scientific90000-264
DekstrozFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
İnce cımbız (Dumont Dumoxel #5)Güzel Bilim Araçları11251-30
Ahşap dübellerVWR Scientific10805-018
Düşük erime agarozVWR Scientific12001-722
Alevli Kahverengi mikropipet çektirmeSutter AletleriP-97
Borosilikat kılcalSutter AletleriBF120-69-10
MPPI-3 enjeksiyon sistemiUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMPPI-3
Geri basınç ünitesiUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonBPU
Mikropipet tutucu kitiUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMPIP
Ayak pedalıUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonFSW
MikromanipülatörUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMM33
Manyetik tabanUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonManyetik Taban
Trikain metan sülfonatWestern Chemical Inc.MS-222
Diseksiyon mikroskobuOlympusSZ61 üst SZX-ILLB2-100 baz
Konfokal mikroskopOlympusIX-81, FV-1000 lazer taramalı konfokal sistemli
20X mikroskop objektifiOlympusUPlanSApo 20x/0.75
Makaralı tamburNew Brunswick ScientificTC-7
Microloader pipet uçlarıEppendorf930001007
Cam kültür tüpleri (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Çocuk kili (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Metilen mavisiVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Petri kaplarıFisher ScientificFB0875712
Hemositometre ( Hausser bilimsel)VWR Scientific15170-172
Tip A daldırma yağıMavi Mermer Ürünleri51935
SantrifüjEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agaroz (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Olta teliStren
96 kuyulu görüntüleme plakası (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Yüksek vakum gresi (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Mikro kaydırak (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Kapak fişleri (18 x 18 mm), No 1.5VWR Scientific48366-045
15 cm Petri kabı (Olympus plastikleri)Genesee Scientific32-106
Gliserol (EMD kimyasalları)VWR ScientificEMGX0185-5
24 oyuklu kültür kabı (Olympus plastikleri)Genesee Scientific25-107
Ağırlık tekneler (8.9 cm)VWR Scientific89106-766

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mucosal CandidiasisZebrafish ModelSwimbladder InjectionCandida AlbicansConfocal MicroscopyNeutrophil RecruitmentHost Pathogen InteractionFluorescent ProteinSwimbladder DissectionJuvenile Zebrafish

Related Articles