T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

Özet

Burada, T hücresi reseptör eksizyon çemberlerinin (TREC'ler) ve K-silme rekombinasyon eksizyon çemberlerinin (KREC'ler) eşzamanlı niceliklemesi için bir yöntem açıklıyoruz. TREC/KREC testi, timik ve kemik iliği çıkışının belirteci olarak kullanılabilir.

Özet

T hücresi reseptör eksizyon çemberleri (TREC'ler) ve K silici rekombinasyon eksizyon çemberleri (KREC'ler), T ve B hücresi reseptörlerini oluşturan rekombinasyon işlemi sırasında oluşan dairesel DNA elemanlarıdır. TREC'ler ve KREC'ler çoğalamadıkları için, her hücre bölünmesinden sonra seyreltilirler ve bu nedenle hücrede kalırlar. Periferik kandaki miktarları, timik ve kemik iliği çıkışının bir tahmini olarak düşünülebilir. İyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan TREC testini KREC testinin değiştirilmiş bir versiyonuyla birleştirerek, hem yeni üretilen T hem de B lenfositlerinin tek bir testte kantifikasyonuna izin veren çift yönlü kantitatif gerçek zamanlı bir PCR geliştirdik. TREC'lerin ve KREC'lerin sayısı, referans gen olarak görev yapan bir T hücresi reseptörü alfa sabit geninin bir parçası ile birlikte bir bakteri plazmidinde klonlanan TREC ve KREC sinyal eklemlerinin seri olarak seyreltilmesiyle hazırlanan standart bir eğri kullanılarak elde edilir. Sonuçlar TREC ve KREC sayısı / 10⁶ hücre veya ml kan başına rapor edilir. Bu DNA fragmanlarının miktar tayininin, hem çocuklarda hem de yetişkinlerde kemik iliği naklini takiben immün sulandırmanın izlenmesi, immün eksikliklerin daha iyi karakterizasyonu veya belirli immünomodülatör ilaç aktivitesinin daha iyi anlaşılması için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Giriş

T-hücresi reseptör eksizyon daire (TREC) ve K-silme rekombinasyon eksizyon daire (KRECs), genomik bir DNA yeniden birleştirme işlemi sırasında T ve sırasıyla A, B-hücreleri, bir oranda kesilmiş küçük daireselleşmiş DNA elemanları vardır giden Bir çok çeşitlendirilmiş T- repertuarına ve B-hücre reseptörleri oluşumu. Onlar hiçbir işlevi var, ama onlar kararlı ve taklit edilemeyen, çünkü onlar, böylece sadece iki kızı hücrelerin birinde ısrar, her hücre bölünmesinde sonra sulandırılır. Bu nedenle, periferik kandaki düzeylerinin timus, kemik iliği çıkışı bir tahmini olarak kabul edilebilir.

TREC tahlil ölçüde timik çıktı kapsamını değerlendir....

Protokol

NOT: Etik bildirimi: Bu protokol, bizim kurum, Spedali Civili di Brescia yönergeleri takip

Bir "Üç-Ekle" Plasmidinin 1. Hazırlık

1. Seçim ve uygun başlangıç ​​malzemesinin hazırlanması:
   1. EDTA tüpleri içine toplanan bir genç, sağlıklı konunun periferik kan gibi PCR ile saptanabilir TREC ve KRECs olması çok muhtemel hücreleri içeren bir örnek alın.
      NOT: Başlangıçta, biz KRECs için bademcik parçalardan TREC ve mononükleer hücreleri için timositleri kullanarak yöntemi geliştirmişti, ama sağlıklı denek genellikle TREC ve PCR ile kendi algılama sağlamak için yeterli KRECs bir miktar var. Bu nedenle, çevresel kan elde edilir....

Sonuçlar

Tahlil 87 sağlıklı kontrol temsili örneklemde gerçekleştirilmiştir: 42 çocuk 0 yaş - 17 (erkek / kadın: 25/17) ve 24 yaş 45 yetişkin - 60 (erkek / kadın: 29/16). Sonuçlar hesaplandı TREC 10 ⁶ PBMC başına KRECs ve daha sonra kan ml'si başına TREC ve KRECs olarak elde edildi.

- 4 yıl TREC sayısı nedeniyle 0-3 çok keskin bir şekilde, özellikle de timus involüsyon, ⁴ yaşla birlikte azalmaktadır. Kadınlarda erkeklere göre daha hızla azalır, çünkü erişkinlerde, TREC sayısı da.......

Tartışma

TREC ve KREC nicelemesi, bazı uyarıların dikkate alınması koşuluyla, son timik ve kemik iliği çıktısının iyi bir tahmini olarak kabul edilebilir. Standart eğri kullanan mutlak bir niceleme yöntemi, gerçek zamanlı PCR reaksiyon plakasında daha fazla reaktif ve daha fazla alan gerektirse de, bilinmeyen numune miktarları, bilinen miktarlarda başlangıç malzemesi üzerine inşa edilen standart eğrilerden enterpolasyon yapıldığından, son derece doğru nicel sonuçlar sağlar. Ayrıca, bu yöntem düşük miktardaki hedefleri tespit etme.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Histopak-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	yoğunluk gradyan ayırma yöntemi
QIAamp DNA Kan Mini Kiti (250)	QIAGEN	51106	DNA ekstraksiyonu
Modifiye edilmemiş DNA Oligonükleotidler HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reaktifleri S.r.l		Liyofilize ürünü 100 pmol/&mikro'ya yeniden süspanse edin; l
AmpliTaq DNA Polimeraz: 10x Tampon II ve 25 mM MgCl 2< / sub>		GeneAmp
		N8080261
TOPO TA Klonlama Kiti Subklonlama için	Invitrojen / Yaşam Teknolojileri	K4500-01
XL1-Blue Alt Klonlama Sınıfı Yetkin Hücreler	Stratagene	200130
PureYield Plazmid Miniprep Sistemi	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10.000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plazmid Midiprep Sistemi	Promega	A2492
XhoI 5.000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE tamponu (1 mM TRIS ve 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri	4364338
Çift etiketli problar HPLC 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reaktifleri S.r.l		Liyofilize ürünü 100 pmol/&mikro'ya yeniden süspanse edin; l
NanoDrop 2000c spektrofotometre	ThermoFisher
Uygulamalı Biyosistemler 2720 Termal Döngüleyici	Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri	4359659
Hızlı 7500 Gerçek Zamanlı PCR sistemi	Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri
SDS Dizi Algılama Yazılımı 1.4	Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri

dNTP Karışımı (100 mM) Uygulamalı Biyosistemler / Yaşam N8080156Teknolojileri dahil