Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi

16.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52187

⸱

16 Mart 2015

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Bu makalede

Özet

Açıklanan kulak sonrası cerrahi yaklaşım, kan kaybını ve hayvan ölümlerini en aza indirirken fare koklear skala timpanisine hızlı ve doğrudan iletim sağlar. Bu yöntem, yuvarlak pencere zarından doğum sonrası farelere moleküler, farmakolojik ve viral iletim kullanılarak koklear tedavi için kullanılabilir.

Özet

Sensörinöral sağırlık fonksiyonel iyileşme elde etmek için kullanılan gen terapisi, işitme kaybı katkıda yatan moleküler ve genetik mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını vermek için vaat ediyor. Iç kulak içine vektörlerin giriş mevcut yapılara yaralanmasına en aza yaygın koklea boyunca maddesi dağıtan bir şekilde yapılmalıdır. Bu yazının moleküler, farmakolojik ve fareler doğum sonrası gün 10 ve yuvarlak pencere membranı (RWM) üzerinden eski viral teslim kullanarak fare koklear tedavisi için kullanılabilecek bir post-aurikular cerrahi yaklaşım anlatılmaktadır. Kan kaybını en aza indirmek ve hayvan ölümleri kaçınarak bu cerrahi yaklaşım skala timpani'ye içine hızlı ve doğrudan teslim sağlar. Bu teknik, temel iç ve orta kulak yapıları yanı sıra boyun kasları tamamen işitme koruyarak ihmal edilebilir veya hiç hasar içerir. Bu cerrahi teknik, veziküler glutam etkinliğini göstermek için3 nakavt (KO VGLUT3) fareler bir adeno-bağlantılı virüs (AAV-1) iç kulağa VGLUT3 teslim aldıktan sonra işitme kurtarır konjenital sağırlık bir fare modelinde bir örnek olarak kullanılacaktır taşıyıcı yedi.

Giriş

Gen tedavisi uzun genetik işitme kaybı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür, ancak bu alanda başarı 1 zor kalmıştır. Bugüne kadar, viral aracılı metodolojiler nispeten ulaşılmaz koklea içinde belirli hücre türlerini hedef teorik yeteneği nedeniyle hakim olması. Her iki adenovirüs (AV), adeno-bağlantılı virüs (AAV), koklear gen aktarımı için kullanılmıştır. AAVler bir takım nedenlerden için kokleadaki avantajlıdır. Onlar çoğaltma eksikliği virüsler ve verimli nöronlar, işitme kaybının nedenleri bir dizi için önemli bir hedef gibi farklı hücre tiplerine transgenik molekülleri aktarabilirsiniz. Hücreye AAV giriş spesifik reseptörler 2 aracılık eder; hücre tipleri transduse edilmesi ile, böylece, belirli bir serotip tercih uyumlu olmalıdır. AAVler etkili saç hücreleri 3 transfekte Transformatörün istikrarlı, uzun vadeli ifade Elde edilen konakçı genomu içine dahil edilebilirnsgenic proteini ve hücre 4 fenotipik bir değişiklik. Bu tür saç hücre yenilenmesi gibi kısa süreli uygulamalar için gerekli olmayan, avantajlı olmasına rağmen, uzun vadeli ifade, genetik kusurların sabit kurtarma için çok önemlidir. AAVler herhangi bir insan hastalık ya da enfeksiyon ile bağlantılı hiçbir ototoksisiteye 5,6,7 göstermeyen, çünkü bunlar kaybı 8 işitme kalıtsal formları için gen terapisinde kullanım için ideal bir aday olup.

Viral vektörleri kullanılarak memeli iç kulak içine egzojen genetik madde aktarımı son on yıl içinde incelenmiştir ve zarar 9 işitme genetik ve elde edilen her iki formu da tedavisi için ümit vaadeden bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır. koklea potansiyel çeşitli nedenlerle, gen terapisi için ideal bir hedeftir: küçük hacimli gerekli virüs sınırlı miktarda gerektiren 1); Diğer organ sistemleri limitleri yan etkilerinden 2) göreceli izolasyon; ve 3) kendi sıvı dolu odaları viral kolaylaştırmakLabirent 10, 11,12,13,14, 15 boyunca teslim.

Konjenital sağırlık Fare modelleri sistematik, yinelenebilir bir şekilde iç kulak gelişimini izlemek için çalışmanın birçok yöntem kullanımına izin verir. Fare cochleae küçük boyutu, bazı cerrahi zorluk sunmak yok iken, fare diğer türlerin üzerinde 16 çeşitli deneysel avantajları ile genetik işitme kaybı çalışmada son derece önemli bir model olarak hizmet vermektedir. Fare modelleri genetik bağlantı analizi, detaylı morfolojik gözlemler toplanması ve patojenik senaryoları simüle edilerek özellikleri bir dizi değerlendirilmesine olanak; gibi, bu viral olarak aracılık edilen, gen terapisi için iyi adaylardır. Teknolojik gelişmeler ile birlikte farelerde Kapsamlı genetik çalışmalar mümkün laboratuvarlarda 17,18, 19, 20,21 arasında bir tekrarlanabilir şekilde genetiği değiştirilmiş fareler üretmek için yaptık. Furthermorhem edinilmiş ve bu hayvan modelinde 22, 23,24 titiz test sağlayan, farelerde işitme kaybı fenotipleri kalıtsal e, sayısız modelleri de bulunmaktadır. Bu durumda, bir fare modelinde, viral aracılı gen terapisi kullanılarak işitme düzeltmek insan hastalığı için bir tedavi arayışında uygun bir ilk adımdır.

Biz daha önce veziküler glutamat taşıyıcı 3 (VGLUT3) eksik transgenik fareler nedeniyle İHK şerit sinaps 25 glutamat salınımı eksikliği sağır doğarlar olduğunu göstermiştir. Bu mutasyon duyusal saç hücrelerinin birincil dejenerasyonuna yol olmadığından, bu mutant fareler potansiyel doğumsal işitme kaybı için koklear gen tedavisi sınamak için mükemmel bir modeldir.

Bugüne kadar, koklear gen terapisi için viral uygulama teknikleri sayıda kokleostomisi ile yuvarlak cam membran yayılma, yuvarlak cam membran enjeksiyonu ve verme dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Güçlü vardırial avantajları ve bu yaklaşımların 9 her dezavantajları.

Burada yuvarlak pencere membranı (RWM) üzerinden VGLUT3 KO fare iç kulağa viral aracılı gen aktarımı için cerrahi bir yöntem sunulmaktadır. sonrası auricular RWM enjeksiyon yöntemi mükemmel işitme koruma ile minimal invaziv ve nispeten hızlı. Daha önce yayınlanmış gibi, bu fare modelinde işitme geri bir çaba, VGLUT3 genini (AAV1-VGLUT3) taşıyan bir AAV1 vektör doğum sonrası 12. günde de bu sağır farelerin koklea içine tanıtıldı (P! @), Sonuçlanan 26 işitme restorasyonu. Transgen protein ifadesi immünoflüoresans (IF) ile doğrulandı iken VGLUT3 KO farelerde İşitme, işitsel beyin sapı cevabı (ABR) tarafından doğrulandı. Bu metodoloji, böylece viral-aracılı gen terapisi olur, aksi takdirde sağırlık neden genetik kusur düzeltmek olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: NIH etik kurallar ve Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, San Francisco onaylanan protokol şartlarına uyulması Tüm prosedürler ve hayvan taşıma.

1. Cerrahi Hayvan Hazırlama

  1. Temiz, özel alanda cerrahi işlemleri yürütmek. Ameliyat öncesinde bir cam boncuk sterilizatör ile sterilize, tüm cerrahi aletler otoklav.
    NOT: Bu protokolde, doğum sonrası geçen gün 10-12 (P10-12) FVB fareler kullanın. Farklı yaş ve farelerin suşları belirli bir projenin ihtiyaçlarını karşılamak için kullanılabilir. Bül kemik zorlaşıyor çünkü P40 daha yaşlı Fareler zor olabilir.
  2. Ketamin hidroklorür (100 mg / kg), ksilazin hidroklorür (10 mg / kg) ve asepromazin (2 mg / kg) karışımı intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi. Hayvan artık böyle ayak tutam gibi ağrılı uyaranlara, cevap sonra cerrahi hazırlık başlayın. Eğer Mutlakay orijinal anestezi uçağı geri anestezik kokteyl bir rapel doz (beşte biri orijinal doz) yönetmek.
    NOT: Bu yaşta görülen mortalitenin en anestezik doz aşımı nedeniyle çünkü bu aşamada dikkat edin.
  3. Hayvanın göz kırpma refleksi baskılayarak, anestezi sırasında gözleri nemli tutmak için koruyucu bir oftalmik merhem ile hayvanın gözlerini örtün.
  4. Fare tamamen uyanık olduğu kadar anestezi sonrası hipotermi önlemek için, işlem boyunca bir ısıtma yastığı genişletilmiş boyun ile fare yerleştirin.
  5. Bir kesme makinesi ile sol sonrası kulaktan bölgeyi Tıraş ve cerrahi manipülasyon öncesi% 70 etanol ve povidon-iyot ile dezenfekte edin.

2. Cerrahi Prosedür ve Vektör Enjeksiyon

  1. Timpanik bülü maruz sonrası aurikular yaklaşımı kullanın. Post-aurikular kas maruz küçük makas ile deri altı doku İnsizyon. Adipoz dokusu geri çekilmeden inci sonraKesi e arka tarafında, zamansal kemik açığa kesi dik sağ ve sol tarafına kasları ayrı. Bu kesi yeterli görselleştirme ile rahat çalışmak için yeterince uzun olduğundan emin olun.
  2. 25 G iğne ile kulak bülü perfore ve koklea bazal dönüş erişime izin vermek için geri kemik soyulması ile forseps ile gerekli delik genişletin ve sonra da stapes arter ve yuvarlak pencere membranı görselleştirmek için yeterince genişletmek (RWM) .
  3. Bir borosilikat kılcal pipet ile merkezde hafifçe RWM delinme. Bu noktada RWM yoluyla sıvı akışını gözlemlemek; Bu normaldir. Akış stabilize kadar bekleyin (koklea gelen effluxed sıvı steril bir filtre kağıdı ile kurutulur).
    NOT: tutma ve RWM perforasyon mümkün olduğunca küçük olması, böylece cam iğne ilerleyen dikkatli olun. Kullanılan mikroskop bağlı olarak, pipetler, bir pipet kullanarak bir micromanipulator kullanarak veya elle tutuntutucu.
  4. Aynı şekilde yama kelepçe pipetler hazırlanır çektirmenin bir pipet kullanarak enjeksiyon için pipetler hazırlayın. Uç çapı büyük (yaklaşık 15 mikron çapında), dışarı virüs pipetle ve kolayca yapılır böylece olduğundan emin olun.
  5. Bir enjeksiyon pipet içine AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP veya AAV2-GFP 1 ila 2 ul kadar çizin. Akış (5 dakika 10) stabilize microinject aynı delikten skala timpani'ye içine bu sabit bir hacim, daha önce RWM yapılır sonra.
  6. Kas küçük bir fiş ile pipet çekerek sonra hızla RW niş Seal ve yuvarlak penceresinden sızıntıyı önlemek için kas üzerine yerleştirilen doku yapıştırıcı küçük bir damla ile sabitleyin.
    Not: çok iyi iğne koklea-Bu aşama bir perilenf sızıntıyı önlemek için kas küçük bir tıpa ile kaldırıldıktan sonra, bu delik Seal işitme korumak için önemlidir. Sızdırmaz takdirde tamamen RWM zaman içinde işitme kaybı ile sonuçlanacaktır.
  7. Enjeksiyon sonrası, kapakadipoz dokusu ile işitsel bül delik, normal pozisyona sonrası aurikular kasları ve adipoz dokusu dönmek ve 6-0 ya da daha küçük emilebilir kromik sütür ile katmanlar halinde yara sütür.
  8. Povidon-iyot ile yarayı dezenfekte edin.

3. Ameliyat Sonrası Bakım

  1. Sıcak kafeste fareler yerleştirin ve tam geri anne ile taşıyabilirsiniz kurtarıldı kadar onları yalnız bırakmayın. Bu anne ile geri yavrular koymadan önce kafesinden erkek kaldırmak için tavsiye edilir.
  2. Inflamasyon ve ağrı yönetmek için deri altına karprofen postoperatif analjezi ve 3 gün boyunca her 24 saat için (2 mg / kg), yönetme. Sıkıntı, anormal kilo kaybı, ağrı, ya da enfeksiyon belirtileri günlük hayvanları izleyin. Genellikle tüm fareler normal hareket edilmelidir ameliyat sonrası 3. gün. Sıkıntı veya hastalık belirtileri 3. günden sonra bir fare görünüyorsa, t euthanizing düşününkurumsal kurallarına göre o fare.

İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) Kayıtlar kullanma Viral Teslimat ardından Koklear Fonksiyon 4. Değerlendirme

NOT: işitsel beyin sapı cevabı (ABR) işitsel bir kafa derisi altına yerleştirilen elektrotlar aracılığıyla beynin devam eden elektriksel aktivite çıkarılan ve kaydedilen potansiyeli uyarılmış olduğunu. Hayvan sesi ile uyarılır. Elde edilen kayıt işitsel uyarının başlamasından sonra ilk 10 msn işitsel yolda ardışık noktaları elektriksel aktivitesini yansıtan beş dalgalar oluşur.

  1. Asepromazin olmaması haricinde, bu protokolün Bölüm 1.2'de tarif edildiği gibi ketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi.
  2. Fare tamamen uyanık olduğu kadar anestezi sonrası hipotermi önlemek için, işitme testi boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde fare yerleştirin.
    NOT: kullanBu deneyde aşağıdaki ses uyaranlar: (; 31 Hz sunum hızı 5 ms süresi) tıklayın.
  3. Sol kulakta (referans) kepçesi altında, tepe de deri altı iğne elektrotları yerleştirin ve kontralateral kulakta altında (toprak) ve daha önce bir ses geçirmez odasına 27,28 açıklandığı gibi kayıt ABRS başlar. Aşağı maksimum genlik 5 dB ses basınç seviyesi aralıklarla Tutanak ABR dalga.
  4. ABR eşik Ameliyat sonrası erken 4 gün olarak viral doğumdan sonra belirleyin
    NOT: Eşik dalgalar için zirveleri tepki hangi düşük uyarıcı seviyesi olarak tanımlanan I-V açıkça ve görsel inceleme üzerine tekrar tekrar mevcut.
  5. Ben koklear sinir aktivitesini analiz Dalga ölçün. saptanabilir ABR dalga verir düşük uyaran eşik seviyesi olarak tanımlanır.

Immunofluorescence Kullanılması 5. Koklear Transgen Protein Ekspresyonu

  1. Intrap aşırı dozda fareler uyutmakketamin hidroklorür ve ksilizin hidroklorür karışımı eritoneal enjeksiyon asepromazin olmadan hariç, bu protokolün Bölüm 1.2'de açıklandığı gibi.
  2. Hayvan artık böyle ayak tutam gibi ağrılı uyaranlara, cevap sonra başını başını kesmek.
  3. 26 anlatıldığı gibi tüm montaj Immünofloresan için dışarı ve süreç cochleae incelemek. Anti-VGLUT3 ve anti-miyozin 7a antikorları kullanılarak koklear tüm montaj imünofloresans ayrıntılı bir protokol Akil ve diğ., 2013, 29 tarif edilmiştir.
  4. 250 seyreltme GFP etiketleme için, 1 ile bir tavşan anti-GFP antikor ile 4 ° C'de bir gece boyunca koklear tam bağlar inkübe edin.
  5. PBS içinde 4000: PBS ile 10 dakika boyunca iki kez cochleae yıkayın ve daha sonra 2'ye ait konjuge keçi anti-tavşan IgG 2 saat süreyle inkübe 1 seyreltilmiştir.
  6. 10 dakika boyunca PBS ile iki kez cochleae yıkayın ve 15 dakika boyunca DAPI ile inkübe edilir.
  7. Cam slaytlar cochleae monte ve und gözlemlemekkonfokal immünflörosans bir mikroskop er.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Teknik özellikleri ve koklear moleküler tedavi için post-aurikular yaklaşımın faydasını doğrulamak için, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ve AAV2-GFP RWM üzerinden P10-12 fareler iç kulak içine teslim edildi. Bu yaklaşım, iç saç hücreleri içinde başarılı bir şekilde, transgen ekspresyonunu gösterir (IHC); (VGLUT3 Şekil 1 ve GFP Şekil 2 ve GFP Şekil 3A), dış saç hücreleri (OHC) (GFP Şekil 2) ve destek hücreleri (GFP Şekil 2 ve Şekil 3A)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, ayrıntılı olarak yeniden veya bir genetik kusur tarafından tehlikeye normal işitsel fonksiyon kurtarmak amacı ile, koklear gen terapisi için kullanılan bir tekniği açıklar. Genellikle atravmatik olduğu için, bu yaklaşım koklear gen transferi ya da diğer olası moleküler tedaviler 30 için güvenlidir. Koklear tedavisi için başka bir yaklaşım, ventral yaklaşımla 24, fare ve gine domuzunda kokleostomisi 31,32 ve endolenfatik kese teslimat 33 de dahil olmak üzere tarif...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden bir R21 hibesi ve Hearing Research, Incorporated'dan bir hibe ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KetaminButler Schein
XylazineAnaSed
AsepromazinUCSF LARC
Carprofen analjeziUCSF LARC
BetadineBetadine Puredue Pharma
deksametazon oftalmik merhem (TobraDex)sağlanmıştırAlcon
Isıtma yastığıBraintree scientific, inc.
25G iğneBD305127
Borosilikat kılcal pipetDünya hassas aletler, inc.1B100F-4
Sütür PDS*plus AntibakteriyelEthiconPDP149
Doku yapıştırıcısı (Vetcode)Butler Schein31477
Tavşan Anti-GFP antikoruInvitrogenA11122
Diseksiyon mikroskobu         LeicaMZ95
Alevli/ Kahverengi Mikropipet         Sutter Enstrüman Co
Çektirme Modeli P-97   
TDT BioSig III Sistemi                               Tucker-Davis Teknolojileri
tarafından

Kaynaklar

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218(2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Viral Gen Aktar mKulak Arkas Cerrahi Yakla mAdeno li kili Vir sitsel Beyin Sap CevabVGLUT3 NakavtKoklear Transfeksiyonmm nofloresan MikroskopiTimpanik Bulla Ekspozisyonu
Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.