Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Özet

Periyodik asit Schiff boyama, dokuların polisakkarit içeriğini görselleştiren bir tekniktir. Bu makale, insan venöz kanından saflaştırılmış periferik kan mononükleer hücrelerinde kullanılmak üzere uyarlanmış periyodik asit Schiff boyama protokolünü göstermektedir. Bu tür örnekler, lenfositler ve bağışıklık sisteminin diğer beyaz kan hücreleri için zenginleştirilmiştir.

Özet

Periyodik asit Schiff (PAS) boyama, kas biyopsilerinde ve kan örnekleri için bir tanı aracı olarak kullanılan immünohistokimyasal bir tekniktir. Glikojen, glikoproteinler ve glikolipidler gibi polisakkaritler, parlak macentayı lekeleyerek doku içindeki pozitif ve negatif hücrelerin numaralandırılmasını kolaylaştırır. Kas hücrelerinde PAS boyama, farklı kas hücresi tiplerindeki glikojen içeriğini belirlemek için kullanılırken, kan hücresi örneklerinde PAS boyama, çeşitli durumlar için bir tanı aracı olarak araştırılmıştır. Kan, bağışıklık sistemine ait beyaz kan hücrelerinin bir kısmını içerir. Bağışıklık sistemi hücrelerinin glikojene sahip olduğu ve onu bir enerji kaynağı olarak kullandığı fikri geniş çapta araştırılmamıştır. Burada, insan venöz kanından periferik kan mononükleer bağışıklık hücrelerine uygulanabilen PAS boyama protokolünün uyarlanmış bir versiyonunu açıklıyoruz. PAS pozitif granüllü küçük hücreler ve diffüz PAS boyaması olan daha büyük hücreler gözlendi. Numunelerin amilaz ile muamele edilmesi, lekenin özgüllüğünü doğrulayarak bu kalıpları iptal eder. Enzimatik sindirime dayalı alternatif bir teknik, numunelerdeki glikojenin varlığını ve miktarını doğruladı. Bu protokol, kan kaynaklı lenfositlerde polisakkarit içeriğini inceleyen hematologlar veya immünologlar için yararlıdır.

Giriş

Periyodik asit Schiff (PAS) boyama yaygın kas araştırma ve teşhis kullanılan bir immunohistokimyasal tekniktir. Aynı zamanda kan örnekleri üzerinde bir teşhis aracı olarak kullanılır. tekniği renksiz Schiff reaktifi böylece derin bir kırmızı ürünü üreten tepki polisakkarit oluşturarak aldehit grupları içinde birimler okside numune, periyodik asit çözeltisi uygulayarak çalışır. Bu işlem aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. leke glikojen, glikoproteinler, glikolipidler, müsin veya polisakarit parçası ile diğer moleküller de dahil olmak üzere polisakaritler, kırmızı, herhangi bir şey döner.

PAS boyama, genellikle kas lifleri glikojen seviyelerini ölçmek için kullanılır. Kaslar doku bölümleri onlar sıkıca slayt eklemek ve çoklu yıkama ve boyama aşamaları dayanacak gibi tekniği için idealdir. Glikojen yüksek bir talep var Tip II kas lifleri, hızlı seğirme en mevcutMaksimum performans için ^1,2 glikojen gerektiren hızlı ATP üretimi için. Glikojen glikojen fosforilaz enzimlerinin hareketiyle serbest glukoz ayrılabilir bir glikoz dallı bir polimerdir. Dinlenme ve beslenme yeterliliği zamanlarda, glikojen, glikojen depo sürecinde doldurulan ise beslenme yetersizliği veya yüksek-enerji talebi zamanlarında; glikojen glikojenoliz tarafından glikoz bölünür. Kan örneklerinde olduğu gibi erken 1950 en klinisyen bilim adamları araştırdı gibi PAS boyama çeşitli hastalıklarda ^3-7 glikojen içeriğini analiz etmek. Örneğin, Pompe hastalığı bir bonafide glikojen depolama hastalıksız beyaz kan hücreleri sağlıklı kontrollerden ⁸ önemli ölçüde farklıdır glikojen büyük miktarlarda birikir.

Bu video-madde periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) sağlıklı bir insan deneklerin venöz kan numuneleri kullanmak için PAS boyanması uyarlanmış bir versiyonunu gösterir. PBMCs örneğin doğal katil hücreler ve monositler gibi T lenfosit ve B lenfosit ailesine ve diğer bağışıklık hücrelerinin, çoğunlukla lenfositler içerir. İlk saflaştırma adımı, eritrositleri, nötrofiller ve diğer granülositler kaldırır. Bu teknik, tam kan smear ile karşılaştırıldığında PAS pozitif hücrelerin daha güçlü sayımı için izin lenfositlerin konsantre oranı ilgili verileri sağlar.

Şekil 1:. PBMC PAS boyama aşaması yöntem vasıtasıyla, aşama (a) İlk olarak, PBMC izole Ficoll gradyanı ile elde edilir, Sol panel, santrifüj işleminden önce hazırlanışını göstermektedir, sağ panel santrifüj sonra gösterilmekte olup, burada PBMC içeren ince beyaz tabaka tüpün merkezinde görülmektedir. (B) izole edilmiş PBMC, formalinle etanol sabitleyici Solu kullanılarak slayt üzerine sabitleniryon. Slayt hafifçe plastik bir yıkama şişesinden damıtılmış su ile iyice durulanır. (C), Lam, daha sonra glikojen eriyecektir amilaz çözeltisi ile doldurulmuş 100 ml'lik bir beher yarım, yerleştirilir. Slayt hafifçe çalkalanır. (D) slayt sakarit oksidasyon meydana periyodik asit çözeltisi ile muamele edilir. Slaytlar hafifçe durulanır; bu fazla periyodik asit çıkarın ve oksidasyon aşamasını durur. (E) Schiff reaktif slaytlara eklendi, bu oksitleme adımı sırasında oluşturulan aldehit ile reaksiyona girer. Bu, renksiz bir reaktif maddesi daha sonra, bir koyu kırmızı eflatun bir ürün ile sonuçlanır. Slaytlar hafifçe fazla Schiff reaktifi kaldırmak için durulanır.

Protokol

İnsan kan örnekleri ile Araştırma Concordia Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu, sertifika numarası 10000618. tarafından Concordia Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu, sertifika numarası 2010BERG tarafından onaylanan fare kas çalışmalarını kabul edildi.

Tüm Blood 1. PBMC İzolasyon

NOT: Steril teknik ve üretici-sterilize ekipmanı kullanarak bir biyogüvenlik kabini bu prosedürü gerçekleştirin.

1. Dikkatli bir şekilde 50 ml steril konik tüp içine heparinize (anti-koagülant), kan toplama tüpleri tam kan 10-15 ml dökün. Küçük kan dökülmeleri için, temizlik bezi kullanarak GKD ₂ O ve% 70 EtOH ile silin.
2. Fosfat tamponlu salin (PBS 1x), pH 7.4 ile 1: 1 oranında, konik bir tüp içinde kan seyreltin. Maksimum toplam hacim 30 ml aşmayacak emin olun.
3. Hafifçe kabarcıklar kaçınarak bir serolojik pipet tabancası kullanarak karıştırın.
   NOT: Kan a önlemek için tüp tersini KARIŞTIRMAYINIZSantrifüj sırasında kapak ve daha sonra sızma olarak ccumulation.
4. Yeni 50 ml kapasiteli konik tüp, Ficoll Paque 13 ml (Malzemeler ve Ekipmanları tabloya bakınız) ekleyin. Rafa tüp dik tutun.
5. Bir transfer pipet kullanarak, sulandırılmış kan almak tepesine yakın tüpün iç duvarına aktarım pipet dokunun. Yavaş ve sabit bir basınç ile, sukroz tabakanın üstünde kan tabakayı oluşturan borunun iç duvarı boyunca kan aktarın. Tüm kan transfer olmuştur kadar bu adımı birkaç kez yapın.
6. Sıkıca tüp Cap ve 5 orta hızlanma seti ile bir salıncak rotor 700 xg'de 30 dakika oda sıcaklığında santrifüj tüpü, ve yavaşlama SIFIR ayarlanır.
7. Yavaşça tüp almak ve katmanları bozmadan, biyogüvenlik kabini onu geri almak.
8. Dikkatle PBS / plazma a arasına yerleştirilen PBMCler bulunduğu buffy coat (ince bulutlu beyaz tabaka), toplamaknd fikol tabakalar Bir transfer pipeti kullanarak. Sakaroz tabakası toplama kaçının ve kırmızı kan hücresi katmanı rahatsız etmeyin.
9. Yeni 50 ml steril konik tüp içine buffy coat aktarın. Tüm PBMC'yi toplamak için adım 1.8 tekrarlayarak birkaç kez alabilir.
10. PBMC ile tüp PBS pH 7.4 ekleyin ve 45 ml işaretine kadar doldurun. Iyice tüp sallayın. Vorteks etmeyin.
11. 1 yıkayın: Santrifüj 15 dakika konik tüpün dibinde PBMC'lerin bir pelet oluşumunu gözlemleyin 9'a ayarlanmış maksimum hızlanma ve yavaşlama hem 480 xg'de.
12. Ağartıcı 10 ml bir plastik geniş şişenin içine PBS (süpernatant) atın.
13. Hafifçe dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı "bozucu" hücre pelet gevşetin. Vorteks etmeyin.
14. Tüpüne taze PBS pH 7.4, 25 ml ilave edilir. Birden fazla tüp işlenirken, bu aşamada topaklan bir arada havuz.
15. 2 yıkayın: santrifüj tüpüne 12 dakika için 480 xg wi9 ayarlanan maksimum hızlanma ve yavaşlama hem de inci.
16. Çamaşır suyu bir sıçrama ile plastik beher içine PBS (süpernatant) atın.
17. Bir dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı yavaşça "raf". Vorteks etmeyin.
18. Tüpüne taze PBS 25 ml ilave edilir.
    1. Hücrelerin 50 ul çıkarın ve canlılık saymak için bir mikrosantrifüj tüp içine aktarın.
    2. Tripan mavisi (bir canlılık leke) ve pipet kadar eşit miktarda (50 ul) ekleyin ve yavaşça karıştırın.
19. 10 ul çıkarın ve ml başına hücre canlılığı kontrol etmek için bir hemositometrede transfer. Hücre / ml sayısını kaydeder.
20. Hücrelerin istenilen miktarda çıkarın ve 9 ayarlanan maksimum hızlanma ve yavaşlama hem 480 xg'de 12 dakika santrifüj tüpü.
21. Ağartıcı ile çanak içine PBS (süpernatant) atın.
22. Bir dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı yavaşça "raf". 8 EkleTüpüne PBS 0 ul.

2. PBMC Slide yapma

1. Bir mikroskop lamı üzerine hücreler 80 ul koyun. Başka bir sürgü yardımı ile damla yayma ya da sürgünün her iki ucunda 40 ul, her 2 damla yerleştirin.
2. Kuruması için biyolojik güvenlik kabininde slayt bırakın. Buzlu tarafında bir kalem ile slayt etiketleyin.

3. Slaytlar üzerinde Örnekleri Tespit

1. 4.5 ml% 99 etanol,% 37 formaldehid 0.5 ml karıştırılarak sabitleyici çözelti hazırlayın.
2. Slaytlar kurutulur sonra, taze yapılmış fiksatif solüsyonu 2 ml çıkar ve slayt tüm yüzeyi kaplı olduğunu, böylece slayt üzerine dökün.
3. 1 dakika slayt üzerinde çözüm bırakın. Musluk suyu ile 1 dakika boyunca slayt durulayın ve kurumaya bırakın.

4. Negatif Kontrol Amilaz Çözüm yapma

1. Amilaz toz 0.25 g almak ve di 50 ml içinde çözülürstilled su. Temiz bir 100 ml beher çözüm dökün.
2. Sürgünün yarısı muameleye tabi tutulur ve diğer yarısı tedavi edilmezse, ve daha sonra oda sıcaklığında (Şekil 1 C) 'de 15 dakika boyunca inkübe yani beher içinde slayt bırakın.
3. Slayt yan amilaz tedavi olduğu not edin. Tedavi ve kontrol arasındaki sınırı gösteren slayt arkasında bir çizgi çizin.
4. Amilaz çözüm kaldırmak ve kuru hava slayt bırakmak GKD ₂ O slaytlar yıkayın.

5. Periyodik Asit Schiff (PAS) Boyama ve Görüntüleme gerçekleştirin

NOT: PAS reaktifler Teneffüs yoluyla toksik ve korozif, bu yüzden adımlar kimyasal davlumbaz yapılması gereken, ve atık ürünleri düzgün kurumsal kurallarına göre imha edilmelidir.

1. Düz bir yüzeye yerleştirin ve slayt örnek üzerinde Periyodik Asit Çözüm 1,50-2,00 ml dökün. Doğmuş iyileşmesiniOda sıcaklığında 5 dakika boyunca te.
2. Distile su birkaç ücretleri slaytlar durulayın.
3. Slayt Schiff reaktifi 1,50-2,00 ml dökün ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
4. 5 dakika distile su ile yıkayın ve slayt kuru hava bırakın.
5. Slaytta 10 ul montaj medya uygulayın ve iki küçük lamelleri ile kaplayın ya da 50 ul uygulamak ve büyük bir lamel kullanın.
6. Lamel kenarlarında açık oje uygulayın, kuru gecede izin.

6. 100X Amaç kullanma Dürbün Işık Mikroskobu ile Görüntüler elde

Sonuçlar

Reaktifler ve temel tekniği doğrulamak için, PAS boyama fare soleus kas bölümlerinde üreticinin talimatlarına göre yapıldı. boyama kurban aynı gün yapıldı ve boyama son adımda, bölümler ksilen ile tespit edildi. Soleus Kas ~% 35 glikojen-pozitif hücrelerin ⁹ ihtiva ettiği bilinmektedir. lekeli, kas hücreleri, hücre içinde iki farklı PAS pozitif özellikleri-noktalı granüller görüntülenir ve hücre zarı (Şekil 2A) demarking işlem kesintisiz bir hat. noktalı granüllerin varlığının glikojen depola...

Tartışma

Bu video makalede kritik adım hücrelerin yıkanması ve amilaz işlemi sırasında idi. Slaytlar yıkarken önemli bir adım bir plastik sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak ve su yavaşça slayt üzerinde numune üzerinden çalıştırmak izin ve örneklerin doğrudan hedefleyen değildi. Hatta ufak doğrudan su basıncı slayt dökülmek hücreleri neden olur. Bir başka önemli adım ± amilaz koşulları için aynı slayt kullanmak oldu. PBMC slayta yapıştırılmış sonra, dikkatli bir şekilde kayar, böylece yayma sadece yarısı amilaz çözeltisine maru...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Periyodik Asit Schiff Kiti	Sigma-Aldrich	395B	Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. Bu kit içindeki malzemeler toksik ve zararlıdır. Dikkatli kullanın.
Domuz pankreasından α-Amilaz	Sigma-Aldrich	A3176
Binoküler Mikroskop	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glikojen Analiz Kiti	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Sükrozun noniyonik sentetik polimeri.
Santrifüj			PBMC izolasyonu için açılı rotor (swing bucket) kullanılmıştır.