Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullanma: Kemirgenler Bir Nöroprotektiftir Tekniği

Summary

Uzaktan iskemik önkoşullama (RIP) zarar strese karşı koşullandırma dokuların bir yöntemdir. Biz 5-10 dakika bir tansiyon aleti manşet şişirilerek, arka bacak uzaktan iskemi bir yöntem kurduk. RIP nöroprotektif yetenekleri kemirgenlerde retina dejenerasyonu modelinde gösterilmiştir.

Abstract

Öldürücü iskemi etkilenen dokuda endogen mekanizmalar yukan doğru düzenlenmesi vasıtasıyla daha sonra, daha ağır iskemiye karşı dokuları korur. Öldürücü iskemi uzaktan dokularda koruyucu mekanizmalar artırdığı gösterilmiştir. Memelilerin arka bacak iskemi (5-10 dk), kısa bir süre, beyin, akciğer, kalp ve retinada kendini koruma tepkileri indükler. etki uzak iskemik önkoşullamanın (RIP) olarak bilinir. Bu hayati organları korumak terapötik umut verici yoludur ve kalp ve beyin yaralanmaları için klinik çalışmalarda altında zaten. Bir sıçan, özellikle arka uzuv - - iskemik Bu yayın bir uzuv yapma kontrollü, minimal invaziv yöntem gösterilmektedir. İnsan yenidoğanlarda kullanılmak üzere geliştirilen bir kan basıncı manşet manuel tansiyon aleti bağlı ve arka bacak üst kısmı 160 mmHg basınç uygulamak için kullanılır. Cilt sıcaklığını tespit etmek için tasarlanmış bir sonda ischemi doğrulamak için kullanılırBir bacak arterlerinin basınç kaynaklı tıkanıklığı nedeniyle cilt sıcaklığında düşüş, ve manşet bırakılmasını takip sıcaklık artışını kaydederek. RIP Bu yöntem parlak ışık kaynaklı hasar ve dejenerasyona karşı sıçan retinaya koruma sağlamaktadır.

Introduction

En hayatta, belki de, metabolik stres karşısında dokuları subletal iskemi ^1,2 bir süre ile önceden klima geliştirilebilir. Pratik açıdan İskemik önşartlama (IP) doku deneyimlerinden böyle bir sonraki iskemik hakaret olarak daha şiddetli stres, önce subletal iskemi doku maruz vardır. Hayvan modellerinde, IP beyin, retina, kalp ve akciğerler ^3-6 çarpıcı bir koruma sağlar. Buna karşılık, inme hastalarında gözlemler önceki geçici iskemik atak ve daha iyi klinik sonuçlar ^7,8 arasında bir bağlantı göstermiştir. IP ayrıca iskemik olmayan yaralanmalar ⁹ retina fotoreseptörleri korur.

Farklı doku ve yaralanmalarda IP etkinliği tüm dokuda bulunan hücre canlılığının doğuştan gelen bir mekanizma aktive olduğunu göstermektedir. Miyokardın İskemik ön şartlama, yukarı doğru düzenleme aracılığıyla koruyucu etkileri olduğu ileri sürülmüştüradenozin serbest bırakılması yoluyla veya mitokondriyal ATP potasyum kanallarının ^10,11 açıklıktan çok metabolik yolları düzenleyen bilinen hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 'nin. Adenozin bırakma ve ATP potasyum kanalları bugüne kadar iskemik klima nöroprotektif mekanizmalar içine araştırmalar, anti-eksitotoksisitesi, anti-apoptotik ve anti-inflamatuar yolların ^12,13 modifikasyon odaklanmış olan, serebral iskemi karıştığı fakat. Genel olarak, nöronlar korumak için iskemik klima moleküler sürecin anlaşılması sınırlıdır.

Uzaktan iskemik önkoşullama girişimleri daha az kritik dokularda iskemi oluşturarak uzak son derece önemli organları (kalp, beyin, akciğer) şart için. Arka bacak ile uzaktan iskemik ön şartlama (RIP) ^{inme, 14-17} arasında, kemirgen modellerinde nöro-koruyucu olduğu gösterilmiştir. bizim tarafımızdan açıklanan yöntem, basit, güvenilir ve non-invazif Prot sağlarRIP uyarılması için ocol.

RIP protokolleri büyük çoğunluğu üst arka bacak bulunan femoral arter kolayca tespit ve cerrahi sıkıştırma ve turnike uygulama için erişilebilir muhtemelen çünkü, arka uzuv içerir. Beyin ve cilt koruma çalışmaları için invazif ekstremite iskemik çalışmalarda, iskemi, kasık ligament femoral arter ayrılması ve femoral arter ^2,15,18 sıkıştırarak endüklenir.

ekstremite Kesilen ya da femoral arter ya da sıkıştırma kaynaklanan iskemi bir pals kaybı azalması oksijenlenme ve cilt sıcaklığında bir düşüş de dahil olmak üzere bacak değişiklikler ile teyit edilmiştir. Uzaktan iskemi lazer Doppler ultrason veya Doppler ^17-19 kullanılarak nabız kaybı ile teyit edilebilir. Cilt sıcaklığı ilişkisi ^20,21 doğrusal olmayan olmasına rağmen Doppler alternatif olarak kullanılabilir. Doğru sıcaklık kayıtları laboratuarlar ve can olağanKolayca uzak iskemik çalışmalar içine dahil edilebilir.

Cerrahi sıkma femoral bir alternatif turnike kullanılarak iskemi indüksiyon olduğunu. Turnike uygulama kabı sıkma ile elde edilene karşılaştırılabilir iskemi üretir; Kutchner ve diğ. non-invaziv turnike için sıkma invaziv femoral arter karşılaştırıldı ve her iki yöntem flep iskemi ¹⁸ bir plastik cerrahi modelinde ekstremite kan akımını ve daha az cilt hasarı durduruldu bulundu. Bacağı veya kolu ya Kesilen ve sistolik kan basıncının üzerinde manşon basıncı yükselterek domuz ve insan ^17,19,22 iskemik hasara karşı koruyucu olduğu bulunmuştur.

Farklı turnike iskemik tansiyon ölçme veya elastik bant ^17,22,23 kullanımını içerir uzak uyaran yaklaşımları. Ancak, iskemi ikna etmek için bir elastik bant kullanımı güvensiz bir yöntem basınç bir düzenlemesiz miktarda potansiyel veren yükselişi500 mmHg üzerinde basınç yükselir ile ekstremite, insanlarda ²⁴ kaydedilmektedir. Bundan başka, bir elastik bant ile kol veya bacak iskemisi Evans mavi boya, myofiber geçirgenliği ²⁵ in vivo bir işaretleyici ile değerlendirildiği gibi, bandın ²³ çıkarılmasından sonra farelerde kas hasarına yol açar. Bunun aksine, turnike kontrollü bir basınç dağıtım tansiyon aleti ^17,19,22,26 bağlı kan basıncı ölçümü kullanılarak elde edilebilir.

Bu çalışmada, fotoreseptör dejenerasyonu hafif bir yaralanma modeli uzaktan iskemik ön koşullandırma ve nöro-koruyucu etkinliğini göstermek için kullanılmıştır. Uzaktan iskemi hafif yaralanma hemen önce uyarılan ve retina fonksiyon testleri ile teyit gibi sonraki fotoreseptör dejenerasyonu engellenmiştir. Ekteki video non-invaziv uzaktan iskemi uygulamasını gösterecektir.

Protocol

Etik deyimi: protokol 5657 # AEC University of Sydney hayvan bakım kurallarına izler. Anestezi hayvan etik kurul (University of Sydney, AEC # 5657) tarafından onaylanmıştır.

1. Ekipman Hazırlığı

1. Gerçek zamanlı cilt ısısı izleme kullanın. Bilgisayarda açın ve veri toplama donanımı.
2. Açık sıcaklık kayıt yazılımı ve sıcaklık 30-35 arası C ayar ve her 100 msn örnekleme sıklığını ayarlayın.
3. İsteğe bağlı: çekirdek sıcaklığını sağlamak için Ekle rektal termometre 37.5 ° C'de sabit kalır.

Manuel tansiyon aleti 2. Kalibrasyon

1. Bir 250-550 gr sıçan için bir boyut 2 manşet sphygmomanometer.Use yenidoğan kolluğu bağlayın. Bir adaptör tansiyon aleti için manşon tüpünü bağlamak gerekli olabilir.
2. Her iki hava tahliye vanasını gevşemesine veya uyarlamak gelen manşon tüpünü ayırarak manşeti Söndürya da. Hiçbir baskı emin olun tüp kalır ve manometre iğne oval / dikdörtgen içinde sıfır aittir.
3. Boru, manometre ve manşet arasındaki basıncını kontrol edin. Bu manometre 100 mmHg okuyana kadar enflasyon ampul yumuşak pompalarla şişirin. Basınç sabit kalır emin olun. Yavaş yavaş hava bırakma değeri açarak manşeti söndürün.

3. Hayvan Hazırlık

Not: Koyu uyumu gerektiren hafif yaralanma geçmesi için uzaktan iskemi gece önce olan Hayvanlar. Işık hasarı geçiren Hayvanlar karanlık yetiştirme (12 saat ışık: karanlık döngüsü (5 lux)) gerektiren

1. Uyanık veya anesteziye kemirgenlerde ya uzaktan iskemi gerçekleştirin. Hayvanlar sağlıklı bir kas tonusunu olduğundan emin olun. Yeterli kas mevcut olduğunu teyit etmek için üst arka uzuv kısma bu sağlayın. Hafif yaralanmalara karşı RIP kaynaklı koruma yaşı 6 aya kadar sedanter sıçanlarda test edilmiştir.
2. R anesteziye hazırlıkIP
   1. 60 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ve intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçanlarda enjekte edilir. Bacak uzatma ve ayak altındaki deriyi sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. derinden Narkoz ise hayvan yok refleksi vardır. Anestezi altında iken kornea kuruluğu önlemek için yapay gözyaşı uygulayın.
   2. Bir ısı pedi veya 37.5 ° C arasında sabit bir vücut sıcaklığını muhafaza etmek için su ısıtıcı boru dolaşım ya da üzerinde sıçanlar yerleştirin. Alt ekstremite 'ayak pedleri yukarı bakacak şekilde yüzüstü pozisyonda sıçan yerleştirin. Sağ ya da sol kol uzak iskemi uğrayabilir.
3. RIP uyanık hazırlık
   Not: hayvan deneyleri iki kişi gerekir Uyanık. Bir kişi hayvanı kısıtlayan ve ikinci kişi manuel sfingomanometre çalışır. deneyci kısıtlama işleyicileri yaralanma riskini artırır olarak yordamı gerçekleştirmek için emin olmalıdır. Uzaktan iskemi uygulanan fareler t klimalı olmalıdıro manuel kısıtlama. Sezgisel kılavuzlar bağlı olarak el emniyet birkaç hafta içinde 5 dakikalık bir maksimum 30 saniye arasında ilerleme olmalıdır. Manuel kısıtlama acclimatise başarısız Çekingen hayvanlar uyanık deney dışında tutulmalıdır. Son olarak, manuel kısıtlama doğru RIP çalışma sonuçlarını yorumlamak için kullanılması gereken hayvanlara stres (ve potansiyel olarak çalışmaya boşa tanıtmak) ve sahte kohort (inflamasyon olmadan manşet yerleştirme) neden olabilir.
   1. 15 cm x 30-50 cm parçaya bir havlu kesin ve arka bacaklarda üstüne başını örten, sıçan omurga dik ve kısa kenarı yerleştirin.
   2. Sıçan gövde altında kısa kenarı sıkıca sokmak ve havlu kalan uzun kenarı ile sıçan sarmak başlar. Bir yatar pozisyonda kol altında sarılı hayvan sabitleyin. Sıçan sol kolunun altında tutulursa, havlu gelen sıçan sağ ekstremite özgür.

4. Uygulama of Cilt Sıcaklık Probu

1. Iskemi geçmesi ve footpad cilt probu yerleştirmektir sıçan bacak uzatın. Sıcaklık probu ve deri arasındaki temasını maksimize etmek için cilt probunu yerleştirin. Sıkıca footpad soruşturmanın itin ve kağıt bant ile prob yapıştırmayın.
2. Sıcaklık kayıt yazılımı sıcaklığını takip ederek cilt prob yerleşimini kontrol edin. Cilt ısısı 30-34 ° C arasında ve sabit kalır emin olun. 1-2 dakika boyunca deri sıcaklığını takip edin. Sıcaklık kararsız veya 30 ° C'nin altında ise deri probu ayarlayın.

5. Uzaktan İskemi

1. Manşeti Deflate ve hava basınç valfi kapalı olduğundan emin olun. Bacak uzatmak ve gevşek üst arka bacak üzerinde Manşeti kuşatmak. Pozisyonda gevşek manşet tutmak için bacak ve alt basamak uzatmak için işaret parmağı ve başparmak kullanın.
2. Uyanık hayvanlar artışlarla 160 mmHg, ve anesteziye hayvanın manşet basıncı kaldırın180 mmHg kaf basıncı ase.
   Not: sıçanların anesteziye kan basıncı 120-140 mmHg arasında değişir ve zaman bilinçli 160 mmHg yükselir. Doğru basınca ulaşıldığında zamanlayıcı ve ayak sıcaklığı kayıtları başlar.
   Not: Ayak sıcaklığı sabit basınç 5 dakika sonra 2 ° C ile damla gerekir.
3. Iskemi boyunca hayvanın "diz" yukarıdaki manşet pozisyonunu koruyun. Manşet basıncı bir kaç dakika sonra düşmeye başlayacak, ya da sıçan uzuv hareket ediyorsa.
4. Art arda pompalama istenen kaf basıncı tekrarlayan kısa bir patlama korumak için öbekler halinde enflasyon ampul pompa
5. Uzaktan iskemi dk 5 ila 15 için sürekli olarak teslim edilebilir. iskemi reperfüzyon protokolü bir müdahale 5 dk reperfüzyon ile 5 dk iskemi 2 dönemlerini kapsamaktadır.
6. Hava basıncı valfini gevşeterek kaf basıncını söndürün. Iskemi pro boyunca sıcaklık değişimini kontroltokol. Manşeti bırakın.
7. Yaralanma deneme ile devam edin. Anestezi etkisi altında hayvanlar bir ısı pedi üzerine yerleştirilmesi gerekir. Ayaktan kadar hayvanları izlemeye devam edin. Hayvanlar yürüyüş kadar konut iade edilemez.

6. Işık Yaralanma - Retina Dejenerasyon Modeli

1. Karanlık bir gecede hayvanları (12-15 saat) uyarlar. Hemen uzaktan iskemi klima veya sahte uzaktan iskemi (hayvan kısıtlama) yiyecek ve su ile Perspex konut yer hayvanları takip.
2. 24 saat 9'da Perspex yuvasının altında bulunan floresan aydınlatma (1.000 lux) açın. Işığa maruz kalma sonrasında, 7 gün boyunca döngüsel aydınlatma loş hayvanların dönün.

7. Sonrası uzaktan İskemi İşlemleri

1. Elektroretinogram (ERG) ile Vision değerlendirme:
   Not: ERG set-up ve flaş protokolü BRANDLI ve Stone ²⁶ izledi.
   1. Koyu bir gecede hayvanları adapte (12-15 saat). AltındaBu ışıklandırma ketamin ve ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu (60 mg / kg ve 5 mg / kg, sırası ile) ile hayvanların anestezisi dim. Midriyatik (atropin sülfat% 1.0), kornea anestetik (Proxymetacaine% 0,5).
   2. Kornea hidrasyon uygulayın (Carbomer polimer) göz kornea hemen düşer. Kornea hidrasyon korumak için 20 dakika aralıklarla göz jeli uygulayın.
   3. Istikrarlı ERG kayıtları yardım etmek için göz küresi etrafında gevşek bağlanmış iplik çizin. Bir rektal prob kullanarak sıcaklığı izlemek ve 37-37,5 ° C 'de, hayvanın vücut ısısını korumak.
   4. Bir Ganzfeld entegre kürenin içinde başını yerleştirin.
      Not: Ganzfeld göze LED'ler üniforma katiyen yanıp sunan tam programlanabilir ışık uyarıcıdır.
   5. Hafifçe kornea dokunmadan ısmarlama 4 mm platin pozitif elektrot ve ağız içine yerleştirilen bir 2 mm çapında Ag / AgCl elektrot kullanılarak pelet elektroretinogram kaydedin. Paslanmaz çelik iğne her iki elektrotlar Referanskıç içine deri altından yerleştirilen.
   6. 2 kHz edinme oranı ile 0.3-1,000 Hz (-3 dB) bant geçiren ayarıyla Tutanak sinyalleri (AD Instruments). Istikrarlı bir ERG kayıt kayıtları başlamadan önce konuyu 10 dk karanlık adaptasyonu hayvan kurulduktan sonra.
   7. Daha önce BRANDLI ve Stone ²⁶ tarafından açıklanan flaş protokolünü takip ediniz.
      1. Flaş süresini programlamak (biz yanıp söner süresi 1-2 msn kullanılır) ve -4.4 günlük scot cd.sm ^-2 2.0 onun yoğunluğunu ayarlayın. Retina fonksiyonu ölçmek için parlak yanıp söner (2.0 günlük scot cd.sm ^-2, 1 ms) kullanın. Bu çalışmada kontrol, ışık yaralanma ve RIP ile hafif yaralanma arasındaki karşılaştırma olduğunu.

8. TÜNEL tahlili

1. Fenobarbital aşırı dozda (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlar öldürülür. Gözleri enükleasyon ve% 4 paraformaldehid düzeltmek.
2. Cyroprotecting önce PBS içinde gözleri yıkayıngözler, gece boyunca sükroz% 30 (a / h). Ekim bileşik gözleri göm ve bir kriyostat kullanılarak 20 mikron sagital kesitler halinde kesilmiş.
3. Maslim ark protokolü takip DAPI boyama ile retina bölümlerde TÜNEL tahlil gerçekleştirin. ²⁷
4. Retina TÜNEL sayım için floresan mikroskobu kullanarak. TÜNEL hücreleri dış nükleer tabaka (onl) kaydedildi; fotoreseptör çekirdekleri içeren retinanın dış tabakası. Bu çalışmada, TÜNEL sayımı, her tedavi grubu için 5 gözlü, her bir göz için üç kopya halinde yapılmıştır.
5. Karşılaştırmak istatistiksel gruba tek yönlü ANOVA kullanın kontrolü, hafif yaralanma ve hafif yaralanma + RIP sıçan anlamına geliyor.

Results

160 mmHg üzerinde yükselmiş bir kan basıncı manşet Şekil 1B açıkça görüldüğü gibi arka bacak kan akışını durdurur. doku oksijenasyonu eksikliği bir iskemi-reperfüzyon protokolü (Şekil 2) için hayvanın ayak sıcaklığını düşürerek bir sonuçlandı. Ayak sıcaklığı (33 ° C) manşet (32 ° C) sönük iken yükselen kaf basıncı yüksekliği (31 ° C) sırasında çekirdek sıcaklığından daha düşük ve güvenilir azaltılmış oldu. Tek bir 1000 lux ışık yaralanma veya uzak iskemik ön olmadan albino sıçanlar kald...

Discussion

Kemirgen arka bacak iskemisi başarılı bir şekilde manuel tansiyon aleti ile uyarılan ve retina fotoreseptör için nöro teslim manşet oldu. Işık yaralanma ^9,28 den fotoreseptör iskemik klima kaynaklı koruma ile tutarlı bir bulgu.

Esas olarak, uzaktan iskemi dokulara kısa bir oksijen deprivasyonuna neden olur. Bu nedenle, uzak iskemik önkoşullamanın iskemik klima veya alternatif olarak adlandırılan iskemik hoşgörü, hipoksik önkoşullama ve bir dereceye kadar, anaerobik egzersiz için p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Altın serisi DuraShock el aneroid tansiyon aleti	Welch Allyn	DS56	Manuel Tansiyon Aleti
Yenidoğan [boyut 2] 1 tüp, 10 paket	Welch Allyn	5082-102-1	Uzuv kan basıncı manşeti
Luer kilit adaptörü	Welch Allyn	5082-178	Yenidoğan manşeti için adaptör
Termistör bölmesi	AD Instruments	ML 309	cilt sıcaklığı ünitesi
Cilt sıcaklığı probu	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4 kanallı satın alma donanımı	AD Instruments	PL 35044
Esnek problu homeotermik battaniye sistemi	Harvard Appartus	507222F
Havlu			isteğe bağlı: uyanık uzak iskemi
Isoflo - %100 İzofluran (250 ml)	Abbot Hayvan Sağlığı	05260-05	isteğe bağlı: inhalasyon anestezik uzak iskemi
Ketamil - ketamin 100 mg / ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		isteğe bağlı: enjekte edilebilir anestezik uzak iskemi
Xylium - Xylazine 100 mg / ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		isteğe bağlı: enjekte edilebilir anestezik uzak iskemi