Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Özet

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Özet

55 yaş üstü kişilerde görme kaybının önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için bir tedavi keşfedilmemiştir. YBMD, etiyolojisi bilinmeyen karmaşık bir multifaktöriyel hastalıktır, ancak büyük ölçüde retinanın altında yatan ve fotoreseptörler için kritik destek sağlayan bir hücre tek tabakası olan retina pigment epitelinin (RPE) ölümü veya işlev bozukluğu nedeniyle ortaya çıktığı düşünülmektedir. RPE hücre replasman stratejileri, AMD hastalarının geniş bir alt kümesi için terapötik rahatlama sağlamak için büyük umut vaat edebilir ve birincil insan hücrelerine (hRPE) güçlü bir şekilde benzeyen RPE hücreleri, bizimki de dahil olmak üzere çok sayıda bağımsız laboratuvarda üretilmiştir. Ek olarak, iPS-RPE'nin kullanımları hücre bazlı tedavilerle sınırlı değildir, aynı zamanda RPE hastalıklarını modellemek için de kullanılmıştır. Bu tür çalışmalar sadece hastalıkların moleküler temellerini aydınlatmakla kalmaz, aynı zamanda yeni ilaçların geliştirilmesi ve test edilmesi için paha biçilmez araçlar olarak da hizmet eder. Burada, RPE'nin kök hücrelerden yönlendirilmiş farklılaşması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Belirli zaman noktalarında nikotinamid ve etkilerini taklit eden küçük bir molekül olan Activin A veya IDE-1'in eklenmesi, RPE hücrelerinin verimini büyük ölçüde artırır. Bu tekniği kullanarak, üç ay gibi kısa bir sürede çok sayıda düşük geçişli RPE elde edebiliriz.

Giriş

Retinayı işgal eden çeşitli hücre tipleri işlevsel bir mimaride düzenlenmiştir. Retinanın arkasındaki fotoreseptörler, ışığı fototransdüksiyon yoluyla elektriksel uyarılara dönüştürmekten sorumludur. Bununla birlikte, fototransdüksiyon, Mueller glia ve retinal pigment epitel (RPE) hücreleri dahil olmak üzere diğer komşu hücre tiplerinin koordineli çabaları olmadan gerçekleşemez. RPE hücrelerinin tek tabakası, duyusal retinayı fotoreseptörler için birincil kan kaynağı olan koryokapillaristen ayırır ve fotoreseptör homeostazı için önemli olan çoklu fonksiyonları kontrol etmek için ideal olarak konumlandırılmıştır. Aslında, RPE ve fotoreseptörler o kadar birbirine bağımlıdır ki, yaygın olarak tek bir fonksiyonel birim olarak kabul edilirler. (RPE'nin tüm çeşitli işlevlerinin gözden geçirilmesi için bakınız Strauss, 2005¹.) Retina pigment epitel hücrelerinin ölümü veya işlev bozukluğu, sanayileşmiş ülkelerde kalıcı görme kaybının önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonuna (AMD) neden olabilir^2-4.

AMD, RPE, fotoreseptörler ve koroidal vaskülatürden oluşan multifaktöriyel bir hastalıktır; risk faktörleri çeşitlidir ve çevresel ve genetik etkilerin kombinasyonlarını içerir^5,6. AMD için tedaviler çok sınırlıdır, ancak umut verici bir potansiyel tedavi RPE hücre replasmanıdır^7,8. Sonuçlar karışık olsa da, AMD hastalarında (ve retina dejenerasyonu olan diğer hastalarda) ve ayrıca retinal dejenerasyonun kemirgen modellerinde RPE hücrelerinin transplantasyonu, önemli fotoreseptör atrofisini^9-23 geçici olarak önleme potansiyeline sahiptir. (Bu çalışmalar için yaygın olarak kullanılan hayvan modeli, MerTK geninde bir mutasyon barındıran Royal College of Surgeons (RCS) sıçanlarıdır. Bu mutasyon, RPE hücrelerini fotoreseptör dış segmentlerini fagosisite edemez hale getirir ve retina dejenerasyonunu teşvik eder²⁴.) RCS sıçanlarının ve farelerinin subretinal boşluğuna implante edilmiş RPE'nin bildirilen sağkalım oranları büyük ölçüde değişmekle birlikte, birkaç ay veya yıl boyunca hayatta kalma potansiyelleri vardır^9,10,12,20.

RPE hücreleri pluripotent kök hücrelerden türetilerek transplantasyon için yeterli sayıda elde edilebilir^9-14,25-28. Birkaç bağımsız grup, bu hücrelerin somatik muadillerine benzer şekilde işlev gördüğünü göstermiştir ve uzun süreli çalışmalar, sıçan ve fare hastalığı modellerinde implantasyon üzerine güvenli olduklarını göstermektedir^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. Embriyonik kök hücreler yerine indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kullanılması, allojenik RPE ile ilişkili etik sorunlar ve immünolojik zorlukların ortadan kaldırılabilmesi nedeniyle avantajlı olabilir^33,34. iPS teknolojisi için bir başka heyecan verici uygulama da hastalık modellemesi^35'tir. RPE hastalığı olan hastalardan türetilen çok sayıda RPE hücresini sorgulama yeteneği, moleküler temellerini anlamak için paha biçilmez olabilir. Bu tür bir çalışma son zamanlarda En iyi hastalık hastası RPE ile gerçekleştirilmiştir ve kalıtsal makülopatilerle ilgili benzer çalışmaların önünü açabilir³⁶.

RPE'nin kök hücrelerden türetilmesi nispeten basit bir işlemdir ve tamamen kseno içermeyen koşullarda yapılabilir. En basit strateji, RPE hücrelerinin tek katmanlarını kendiliğinden türetmektir, ancak verim, yönlendirilmiş farklılaşma teknikleri kullanılarak önemli ölçüde iyileştirilebilir. Ancak bu teknikler, pahalı olabilen ve genellikle bakteri veya diğer insan dışı kaynaklarda üretilen eksojen protein faktörlerinin kullanımını içerir^10,12,37. Çalışmalarımızda, RPE spesifikasyonu³⁸ için yeterli olduğu gösterilen bir sinyal faktörü olan nikotinamid ve Activin A'yı kullanan yerleşik bir protokol^10'u takip ettik. Burada, küçük molekül IDE-1'in Aktivin A'nın yerini yeterince alabileceğini, böylece maliyetleri azaltabileceğini ve rekombinant proteinlerin kullanımıyla ilgili endişeleri hafifletebileceğini^{göstereceğiz 39}. Ek olarak, kseno içermeyen serum replasmanı kullanıyoruz ve farklılaşan RPE hücrelerini sentetik kseno içermeyen bir substrat üzerinde kültürlüyoruz. RPE hücrelerinin daha önce bu yaklaşımı kullanarak çok etkili bir şekilde farklılaştığı gösterilmiştir⁴⁰.

Tek tabaka olarak farklılaştırıldığında, RPE hücreleri içeren pigmentli kolonileri beş hafta gibi kısa bir süre sonra görselleştiririz¹². Yeterli boyuta ulaştıklarında, manuel olarak eksize edilebilir ve genişleme için başka bir kaba aktarılabilirler. RPE hücreleri, her pasajda farklılaşmamasıyla ünlüdür ve beş pasajdan daha eski herhangi bir şeyin kullanılmasından kaçınılmalıdır (hayvan modellerinde karakterizasyon ve transplantasyon için yeterli sayıda hücrenin iki veya üç pasajdan sonra kolayca üretilebileceğini bulduk). Tamamen farklılaştıktan sonra, hastalıklı RPE için yeterli ikame görevi görmelerini sağlamak için hücreleri anatomik ve fonksiyonel olarak karakterize etmek için birden fazla teknik kullanıyoruz. Bu tekniklerin tanımı ve iPS-RPE'nin kemirgenlerin subretinal boşluğuna implante edilmesi için protokol, bu yöntem makalesinin kapsamı dışındadır ve daha önce yayınlanmıştır^12,32,41.

iPS-RPE'nin etkili bir şekilde türetilmesi için standartlaştırılmış protokoller geliştirmek klinikler için açıkça önemli olsa da, hayvan modellerinde hala yapılması gereken önemli klinik öncesi çalışmalar da vardır. iPS'den türetilmiş hücrelerin immünojenisitesi ile ilgili endişeler vardır ve hücrelerin yapay substratlar üzerine implante edilmesi de dahil olmak üzere çok sayıda farklı implantasyon tekniği araştırılmaktadır^42,43. Bu nedenlerle, standardize protokollerin yayınlanmasının hem klinik hem de klinik öncesi çalışmaları kolaylaştırmak için faydalı olduğunu düşünmekteyiz. Özellikle, farklı araştırma grupları tarafından farklı laboratuvarlarda türetilen iPS-RPE hücrelerinin doğrudan karşılaştırmaları yapılacaksa.

Protokol

Kök Hücre kaynaklı RPE 1. Yönetmen Farklılaşma

Not: Tüm bekletme işlemleri,% 5 _CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir

1. Bakım medya (Tablo 1 MM) de embriyonik kök veya HIPS hatları (günlük yem) koruyun. Hat kalite kontrol yeterli standartlarını yakalamış sonra, fare embriyonik besleyici bir hücre tabakası bunları muhafaza (MEF'ler) 250,000 olan bir yoğunluk / gözenek bir altı yuvalı plaka olarak tohumlanır. Xeno içermeyen kültürler de Tucker ve ark. ⁴⁰ tarafından oluşturulan protokol takip edilerek üretilebilir.
2. Kök hücre kolonileri confluency ulaşmak için bekleyin.
3. Nikotinamid (Tablo 1 DM / NIC) ile farklılaşma medya geçin; Günlük yem.
4. RPE farklılaşmasını geliştirmek, kültür üç hafta sonra, nikotinamid ve ya Aktivin-A veya IDE-1 (Tablo 1 DM / NIC / AA veya DM / NIC / ide1) ile farklılaşma medya geçmek.
5. Kültür beş hafta sonra, DM / NIC geri dönün. Günlük beslenmeye artık beslendikten sonra sarı bir gün dönüm medya durağı pH göstergelerinin kez gereklidir.
6. (Şekil 2D F ve 3A bakınız) kadar kesilmesi ve alınması için büyük görünmesi pigmentli hücre adacıkları bekleyin.

2. Yalıtımlı Pigmentli Islets

1. Coat doğal hücre ortamı (xeno-ücretsiz tercih edilir) taklit eden bir matris ile 24 plaka kuyu.
   NOT: Kornea bıçaklar ve keskin, ince uçlu forseps seçmek için çok yararlıdır. toplama sırasında farklılaşmış hücrelerin tüm levha ayırabilirsiniz. Dikkatli çalışıyor ve başlangıçta yemeğin ortasında koloniler seçerek bu kaçının.
2. (Tablo 1 DM) gerektiği gibi farklılaşma ortam maddesi ile 24 oyuklu plaka gibi çok sayıda çukur doldurun. Pigmentli koloni sayısına bağlı olacaktır Bu kararToplanan.
3. Diseksiyon kapsamı ile bir hücre kültürü kaputu, el pigmentli adacıklar kesip. Yaklaşık 2-6 adet bir neşter kullanılarak orijinal plaka altındaki her adacık kıymak ve keskin forseps ile pigmentli parçaları kapmak.
4. Her 24 kuyunun içine 1-2 adet pigmentli aktarın.
5. Hücreler uygun kadar 3-5 gün süreyle ortamı değiştirmek etmeyin, daha sonra Ortam haftada üç kez değişen başlar. (Bu saatten sonra uygun değilse, olabilirlik onlar asla o iyidir).
6. (Tablo 1 DM) - tipik kültür bir görüntü Şekil 3B'de gösterilmiştir farklılaşma ortamda 3-4 hafta boyunca hücrelerin aç. Hücreler hala tüm kuyu doldurmak olmayabilir ama uzun bekleme yardım görünmüyor. Haftada hücreler üç kez besleyin.
7. Yaklaşık 3 hafta sonra, elle keskin forseps ile gerekirse kümeleri beyaz hücrelerin kümeleri kaldırın. Gerekli olmadıkça bu adımı yapmayın - bu kirletici tanıtmak için kolaydır. Bu ideal birAdım 1.6 orijinal pigmentli koloniler gelen RPE saf popülasyonlarının edinmeye çalışın.

3. Pasajlanması Kök Hücre türetilen RPE

1. Bir hücre ayrışma çözeltisi ile 200 ul hücreleri ayırmak 37 ° C'de 5-8 dakika boyunca (tercihen seyreltme tercih edilir ile inaktive edilebilir reaktif-a, tripsin olan), ve DM ile sulandırarak bu etkisiz hale getirirler. Tüm hücreleri yıkayın ve (iki 24-kuyulardan hücreleri havuzu düşünün, sadece bir kaç hücreleri içeren iyi seçtiyseniz) onları tekrar süspansiyon 200 ul pipet kullanın.
2. Santrifüj (5 dakika için 800 xg), 3 ml DM medya süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.
3. Yeniden plaka hücreleri bir (veya iki) oyuk başına DM 3 ml bir matris kaplı 6-kuyuya 24 kuyu ile ilgili (1: 5 genişleme).
4. Hücreler ~ 90% konfluent kadar 1-2 hafta genişlet; tam olarak farklılaşmış saf kültürünün bir görüntü Şekil 3C 'de gösterilmiştir.
5. 1 ml hücre d hücreleri ayırmak37 ° C'de yaklaşık 5-8 dakika boyunca issociation Çözelti, DM ile seyreltme ile inaktive tüm hücreleri yıkamak için 1000 ul pipet kullanın, ve bunları yeniden süspanse edin.
6. (5 dk için 800 xg) Spin 18 ml DM medyada süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.
7. (: 6 genişletme 1) ya da 75 cm ² balon içinde bir kaplanmış (1: 7.5 genişleme) altı matris içine bir 6-yuvalı her birinden yeniden plaka hücreleri, oyuk başına DM 3 ml 6-kuyu kaplama.
8. Yeterli hücre elde edilinceye kadar tekrarlayın 3.4-3.8 olarak gerekli adımları.
   NOT: yerine her geçiş RPE dediferansiyonunu indükler beri Pasajlanması aracılığıyla kültürleri yükseltmek için planlama daha genişleme için mümkün olduğunca çok koloniler toplamaya çalışın.

Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu metinde belirtilen adımlar, daha önce rapor edildiği gibi ^10,12 kolayca kök hücreler RPE oluşturmak için de kullanılabilir. Birkaç hafta iPS hatları sağlandıktan sonra, pigmentli koloniler 5-7 hafta (7 haftalık kültürler Şekil 2A-C gösterilmiştir) sonra kolonilerde görünmeye başlar. Bu koloniler, kültür muhafaza edildiği gibidir hafta boyunca büyümeye devam edebilirler. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Şekil 2D F

Tartışma

Bu yazıda verimli saf iPS-RPE kültürlerin çok sayıda oluşturmak için adımları özetlemektedir. Biz şiddetle transkriptomik, proteomik, metabolomik ve işlevselliğine dayalı hRPE benzer iPS-RPE üretebilir Aktivin A ile yönlendirilmiş farklılaşma protokolü kullanarak önceden göstermiştir, ve RCS sıçanlarda ^12,31,32 implante zaman retina dejenerasyonu geciktirir . iPS-RPE üretme süreci, zaman alıcıdır, ancak zahmetli (Şekil 1). IPS kültürleri konfluense ulaştıklarında onlar günlük bazda farklılaşm...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kornea bıçağı	Surgipro	SPOI-070	bıçak x 1
DMEM/F-12, HEPES	Yaşam Teknolojileri	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin, 1X Ca veya Mg olmadan	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fetal Sığır Serumu, Düzenli (Isıyla Etkisizleştirilmiş)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinant İnsan Protein	Yaşam Teknolojileri	PHG0021	100 ve mikro; g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Nakavt DMEM	Yaşam Teknolojileri	10829-018	500 ml x 1 nbsp;
KnockOut Serum Replasman Ömrü	Teknolojileri	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamin 200 mM	Yaşam Teknolojileri	25030-081	100 ml x 1
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi 100X	Yaşam Teknolojileri	11140-050	100 ml x 1
Nikotinamid	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-148	20 ml x 1
Rekombinant İnsan/Murin/Sıçan Aktivin A	PeproTech	120-14E	10 & g x 2
Synthemax-T Yüzey 6 Kuyulu Plakalar	Corning	3877	Kasa (12) x 1
TrypLE-Express Enzim (1X), fenol kırmızısı yok	Yaşam Teknolojileri	12604-021	500 ml x 1
Vakum Filtresi / Saklama Şişesi Sistemi, 0.1 & mikro; m gözenek, 500ml	Corning	431475	Kılıfı(12) x 1