Makrofajlar, konak patojenitesinde rol oynayan anahtar hücrelerdir. Makrofajlar, proteomik analiz ile analiz edilebilen ve tespit edilebilen fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. Bu makale, M1 veya M2 fenotipine farklılaşmış insan makrofajlarının birincil kültürlerinin 2D elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil
Bu makalede
Özet
Özet
Burada açıklanan iki boyutlu (2B) elektroforez protokolünün amacı, insan kültürlü makrofajların fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektir. Makrofajların anahtar rolü, inflamatuar, immünolojik ve enfeksiyöz hastalıklar gibi çeşitli patolojik bozukluklarda gösterilmiştir. Bu protokolde, M1 (pro-inflamatuar) veya M2 (anti-inflamatuar) fenotipine farklılaştırılabilen insan monosit türevi makrofajların birincil kültürlerini kullanıyoruz. Bu in vitro model, M1 ve M2 makrofajlarının biyolojik aktivitelerini incelemek ve ayrıca proteomik bir yaklaşım için güvenilirdir. Proteomik teknikler, konak patojenitesi sırasında M1 ve M2 makrofajlarının fenotipini ve davranışını karşılaştırmak için yararlıdır. 2D jel elektroforezi, çok sayıda proteini veya polipeptidi aynı anda haritalamak için güçlü bir proteomik tekniktir. 2D Diferansiyel Jel Elektroforezi (DIGE) adı verilen floresan boyalar kullanarak 2D elektroforez protokolünü açıklıyoruz. M1 ve M2 makrofaj proteinleri, birinci boyuttaki izoelektrik noktalarına ve ikinci boyuttaki moleküler kütlelerine göre, izoelektrik odaklama ile ayrılmadan önce siyanin boyaları ile etiketlenir. Ayrılmış protein veya polipeptit noktalar daha sonra protein veya polipeptit ekspresyon seviyelerindeki farklılıkları tespit etmek için kullanılır. Burada açıklanan proteomik yaklaşımlar, konak patojenitesi veya mikrobiyal toksinler gibi çeşitli bozukluklarla ilişkili makrofaj protein değişikliklerinin araştırılmasına izin verir.
Giriş
Makrofajlar, ayırt edici fonksiyonel fenotipleri elde edebiliyoruz heterojen ve plastik hücrelerdir. İn vivo olarak, bu hücreler mikrobiyal ürünler, sitokinler, vb. 1 mikro çevre signalssuch büyük bir çeşitlilik yanıt. İn vitro, pro-enflamatuar fenotip (M + -1) makrofaj lipopolisakarit (LPS) ve interlökin-4 (IL-4) gibi sitokinler tarafından anti-iltihabik bir fenotipe (M2) tarafından indüklenebilir. Dahası, makrofajlar belirli sinyalleri 2 üzerine, tersine M2 fenotip bir aktive M1 geçiş yapabilirsiniz.
Fenotip bağlı olarak, makrofajlar farklı işlevlere sahip olacaktır. M1 makrofajlar mikroo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Protokolü kurumların insan araştırma etik kurulunun yönergeleri takip eder. Sağlıklı insan donörlerden Buffy coat Bölge Kan Transfüzyon Merkezi (Lille, Fransa) elde edilmiştir. Buffy kat elde edilen Numune bir Inserm koleksiyon (n ° DC2010-1209) olarak ilan edilmiştir.
1. Malzeme ve Kültür Medya Hazırlık
- 1x PBS elde etmek için steril damıtılmış su içinde, 10X fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir.
- Ve% 10 toplanmış insan serumu olmadan gentamisin (40 ug / ml) ve L-glutamin (2 mM) ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı sağlayın.
Monosit türevli makrofajlar 2. Primer Kültürleri (MDM),....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Uygun diferansiyel proteomik analizi gerçekleştirmek için, analiz edilecek örneklerin işlenmesi doğrulanması gerekir.
Önce 5 yayınlanan sunulan örnekte, makrofaj hücre kültürü kalitesi, morfolojik ve moleküler özellikler için gereklidir. Makrofajlar monositlerin farklılaşması ve kültürün homojenliği faz mikroskobu ile takip edilmiştir. Şekil 1, M1 ve M2 makrofajların primer kültürlerinde bir örnek göstermiştir. Gösterildiği gibi, M1 (Şekil 1A, B) .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu tarifnamede tarif edilen protokol makrofajlar, M1 (pro-enflamatuar) ve M2 (anti-iltihap) olarak iki alt-tip farklı uyaranların etkisini analiz etmek için bir yöntem göstermektedir. Daha önce 7 yayınlanan M1 ve M2 makrofajların birincil kültürleri monositlerin farklılaşması elde edilmiştir.
2D DIGE jel elektroforezi prosedür, Cy3 ve Cy5 floresans bir tarayıcı için uyarım / emisyon dalga iki kez jel tarama yapmak için SDS-PAGE için izoelektro-odaklanma, düşük floresan levhaları I.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Beyan edilmiş bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Inserm tarafından desteklenmiştir. Marion Bouvet, Fransa Araştırma ve Teknoloji Bakanlığı üyesidir. Annie Turkieh, Avrupa Birliği FP7 HOMAGE (305507) tarafından verilen bir bursiyerdir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Canlandırıcı | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Canlandırıcı | 14200-083 | |
| L-glutamin-200 mM-100X | Canlandırıcı | 25030-024 | |
| gentamisin 10 mg / ml | İçleyici | 15710-049 | |
| insan serumu | Canlandırıcı | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6 kuyulu plaka PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolisakkarit | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Araştırma Organikleri | 3.00E + 01 | |
| Filtre 0.22 ve mikro; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml silindir | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reaktifi | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reaktif boya | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG şeridi 3-10 24cm | GE Sağlık | 17-6002-44 | |
| Protean IEF hücresi | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Düşük erime noktalı agaroz | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix sistemi | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Görüntüleyici tarayıcı | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot Doğrusal | olmayan dinamikler | ||
| 50 ml tüpler | herhangi bir tedarikçi | yok | |
| 15 ml tüpler | herhangi bir tedarikçi | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| sizin&ekanlığınız; e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Farmalitler 3-10 | GE Sağlık | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromofenol mavisi | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Akrilamid% 40 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D temizleme | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glisin | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Loş ve eacute; thylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| elektrot fitilleri | Bio-Rad | 165-4071 |
Kaynaklar
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
