2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

Özet

Makrofajlar, konak patojenitesinde rol oynayan anahtar hücrelerdir. Makrofajlar, proteomik analiz ile analiz edilebilen ve tespit edilebilen fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. Bu makale, M1 veya M2 fenotipine farklılaşmış insan makrofajlarının birincil kültürlerinin 2D elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Özet

Burada açıklanan iki boyutlu (2B) elektroforez protokolünün amacı, insan kültürlü makrofajların fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektir. Makrofajların anahtar rolü, inflamatuar, immünolojik ve enfeksiyöz hastalıklar gibi çeşitli patolojik bozukluklarda gösterilmiştir. Bu protokolde, M1 (pro-inflamatuar) veya M2 (anti-inflamatuar) fenotipine farklılaştırılabilen insan monosit türevi makrofajların birincil kültürlerini kullanıyoruz. Bu in vitro model, M1 ve M2 makrofajlarının biyolojik aktivitelerini incelemek ve ayrıca proteomik bir yaklaşım için güvenilirdir. Proteomik teknikler, konak patojenitesi sırasında M1 ve M2 makrofajlarının fenotipini ve davranışını karşılaştırmak için yararlıdır. 2D jel elektroforezi, çok sayıda proteini veya polipeptidi aynı anda haritalamak için güçlü bir proteomik tekniktir. 2D Diferansiyel Jel Elektroforezi (DIGE) adı verilen floresan boyalar kullanarak 2D elektroforez protokolünü açıklıyoruz. M1 ve M2 makrofaj proteinleri, birinci boyuttaki izoelektrik noktalarına ve ikinci boyuttaki moleküler kütlelerine göre, izoelektrik odaklama ile ayrılmadan önce siyanin boyaları ile etiketlenir. Ayrılmış protein veya polipeptit noktalar daha sonra protein veya polipeptit ekspresyon seviyelerindeki farklılıkları tespit etmek için kullanılır. Burada açıklanan proteomik yaklaşımlar, konak patojenitesi veya mikrobiyal toksinler gibi çeşitli bozukluklarla ilişkili makrofaj protein değişikliklerinin araştırılmasına izin verir.

Giriş

Makrofajlar, ayırt edici fonksiyonel fenotipleri elde edebiliyoruz heterojen ve plastik hücrelerdir. İn vivo olarak, bu hücreler mikrobiyal ürünler, sitokinler, vb. ¹ mikro çevre signalssuch büyük bir çeşitlilik yanıt. İn vitro, pro-enflamatuar fenotip (M + -1) makrofaj lipopolisakarit (LPS) ve interlökin-4 (IL-4) gibi sitokinler tarafından anti-iltihabik bir fenotipe (M2) tarafından indüklenebilir. Dahası, makrofajlar belirli sinyalleri ² üzerine, tersine M2 fenotip bir aktive M1 geçiş yapabilirsiniz.

Fenotip bağlı olarak, makrofajlar farklı işlevlere sahip olacaktır. M1 makrofajlar mikroorganizmaları ve tümör hücrelerini öldürmeye ^3, tümör nekroz faktörü α (TNF-α) gibi pro-enflamatuar sitokinleri üreten hücrelerdir. Buna karşılık, M2 makrofajlar anti-enflamasyon üreterek yara iyileşmesi ve fibrozis gibi bu enflamatuar yanıtı önlemekörneğin ^3,4, TGF-β Y faktörler.

Daha önce Boyum ⁶ uyarlanan bir teknik kullanarak ⁵ tarif edilen sağlıklı donörlerden elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri Ficoll yoğunluk farklı santrifüjü yoluyla izole edilmiştir. Kültür makrofajlar primer kültür ⁷ 6 gün sonra M1 veya M2 fenotip ayırt edilebilir.

Protein ekspresyonu ya da ana bilgisayar patojenik veya mikrobik toksinler gibi çeşitli kontrollü uyaranlarla altında makrofajların iki alt tip arasında, protein değişikliklerin analizi, pro- ve anti-inflamatuar makrofaj özelliğe deşifre yararlı olacaktır.

Proteomiks özellikle yukarı veya çeşitli uyaranlara altında insan kültürlü makrofajlar aşağı-regüle olan proteinlerin doğrudan izlenmesi için benzersiz araçlardır. Floresan boyalar gibi düşük duyarlılık ve görüntü analizi ⁸ gibi 2D jel elektroforezi sınırlamaları, bazı çözdük ^< / Sup>. Sistein kalıntıları ile reaksiyona sokulması boyalar lizin kalıntıları ⁹ ile reaksiyona kıyasla tespit karşı artmış bir hassasiyet. Önceki bir çalışmada, klasik, gümüş-lekeli 2D elektroforez ¹¹ kıyasla çok az örnekleri ¹⁰ analizinde DIGE doygunluk etiketleme yararını göstermiştir. Bu teknoloji hızlı bir makrofaj iki alt tip arasında veya aynı tipinin muamele edilmemiş ve edilmiş makrofajlar arası protein değişiklikleri analiz etmek yararlıdır.

Bu proteomik tekniğin avantajları, 2 boyutlu jel ¹² analiz protein boyut ve post-translasyonel modifikasyonları bilgilere erişim sahip olanlardır. Bu analiz edilebilir numunelerin sayısının sınırlandırılması, bu yüksek verimli bir yöntem değildir dikkate alınmalıdır. Kütle spektrometresi dayalı yüksek verimli deneyler gelişimi gözden olarak son ¹³ bu artırabilirsiniz.

_content "> Burada elektroforez, izoelektro-odaklanma süreçleri yoluyla kültürlü makrofajlar protein çıkarılması 2D DIGE analizi gerçekleştirmek için nasıl sunmak ve yeterli 2D yazılım kullanışlılığı SDS-PAGE yanı sıra bilgi.

Protokol

Protokolü kurumların insan araştırma etik kurulunun yönergeleri takip eder. Sağlıklı insan donörlerden Buffy coat Bölge Kan Transfüzyon Merkezi (Lille, Fransa) elde edilmiştir. Buffy kat elde edilen Numune bir Inserm koleksiyon (n ° DC2010-1209) olarak ilan edilmiştir.

1. Malzeme ve Kültür Medya Hazırlık

1. 1x PBS elde etmek için steril damıtılmış su içinde, 10X fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir.
2. Ve% 10 toplanmış insan serumu olmadan gentamisin (40 ug / ml) ve L-glutamin (2 mM) ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı sağlayın.

Monosit türevli makrofajlar 2. Primer Kültürleri (MDM),

1. 1x PBS ile buffycoat (25 mi) seyreltin. Dikkatlice oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 1600 x g'de Ficoll / leucosep tüp ve santrifüj yüklemek.
2. Yeni bir tüp içine arayüzde monositleri toplayın. 10 ml ile yıkayın 3x PBS% 0.1 etılendiamıntetra içeren 1x1,000 xg, 370 x g ve 10 dakika her biri için 160 x g ve daha sonra bir kez 1 x PBS içinde tek başına 160 x g'de, 10 dakika boyunca arka arkaya santrifüjleme ile asetik asit (EDTA).
3. Serumsuz 5 mi RPMI-1640 ortamı içinde hücre pelletini ve kap başına 1 x 10 ⁶ hücre yoğunluğunda 35 mm'lik kaplara hücreleri tohum.
4. Inkübatörde 90 dakika boyunca çökelme sonra yapışmayan hücreler ihtiva eden üst sıvıyı atmak. 1 ml PBS ile, monositlerin 3x oluşan yapışmış olan hücrelerin yıkayın; Daha sonra, daha önce serumsuz hücreler% 10 gliserol içeren taze ortam (h / h) insan serumunun 1 ml.
5. 6 günlük bir kültürden sonra, alternatif farklı makrofajlar (M2) elde rekombinant insan IL-4 (15 ng / ml) ekleyin ve 6 gün için muhafaza etmek. Daha sonra, M1, makrofajlar elde etmek üzere 4 saat 12. günde lipopolisakarit (100 ng / ml) ile farklılaştırılmış makrofajlar tedavi.

2D Elektroforez için M1 ve M2 Makrofaj Proteinlerin 3. Ekstraksiyon

1. Yıkama macrophyaşları 25 mM Tris, 30 mM Tris pH 8, 4,% 3 ihtiva eden tampon içinde pH 7,4 ve hurda ile üç kez - [(3-kolamidopropil) -dimetilamonyo] -1-propansülfonat (CHAPS), 2M tioüre ve 7 M üre.
2. -20 ° C'de bir buz ve deposunda 5 dakika için 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine için müsait bir mikser kullanılarak Hücreleri.
3. Ticari bir Bradford reaktifi kullanılarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Kullanılana kadar -20 ° C'de, proteinlerin 100 ul alikotları saklayın.

4. izoelektro-odaklanma

NOT: Karanlıkta bütün etiketleme prosedürleri uygulayın.

1. 37 ° C'de 1 saat boyunca 2 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP); ihtiva eden liziz tamponu ile 9 ul ayarlandı her bir örnek (M1 ve M2 makrofajlar) 5 ug azaltır.
2. 0.8 nM / ug protein konsantrasyonunda M1 özü ve M2 sülfidril-reaktif boya ekstreye siyanin 3 (Cy3) ekleyin. M1 siyanin 5 (Cy5) ilave et ve M2 0.8 nM / ug protein konsantrasyonunda alır ve inkübe37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı.
3. 7 M üre, 2 M tioüre, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) ve% 2 pharmalytes ihtiva eden numune tampon maddesinin eşit hacmi eklenerek reaksiyonu durdurun.
4. Mix bir yandan Cy5 etiketli M2 örnekleri ile M1 örnekleri Cy3 etiketli ve başka bir el Cy5 etiketli M1 örnekleri ile M2 örnekleri Cy3 etiketli.
5. Bir İmmobilize pH gradyanı Rehydrate (IPG) şerit (240 mm, pH 3-10 doğrusal gradyan) 7 M üre, bir İsoelektrik 2 M tiyoüre ve% 4 CHAPS odaklanarak içeren tamponda etiketli karışık örneklerin 450 ul (İEF) hücre sistemi herhangi bir akım uygulamadan 24 saat karıştırıldı.
6. 3 saat ve 3 saat sonunda 8,000 V 8000 V bir gradyan ile, 6 saat süre ile 1000 V bir gradyan daha sonra da 3 saat boyunca 300 volt (V) 'de odaklama yapın ve.

5. İkinci Boyut

NOT: Karanlıkta bütün elektroforez işlemleri gerçekleştirin.

1. Dengeleme tamponunda IPG şeritler içeren inkübe10 dakika süre ile 0.1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M üre,% 2 sodyum dodesil sülfat (w / v) (SDS) ve% 30 (h / h) gliserol ing.
2. % 12.5 PAGE jelleri üzerine, ikinci boyutta (SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)) için dengelenmiş IPG şerit aktarma ve agaroz, erime noktası düşük ile sağlanır.
3. Bromofenol mavisi önü jelin dibine ulaşana kadar, gece boyunca 300 V ve ardından, 70 V sabit gerilimde, bir Ettan-Daltsix sistemi kullanılarak 20 ° C 'de elektroforez yapınız.

6. Görüntü Alma ve Biyoinformatik Analizi

1. Cy5 100 um bir piksel boyutu ile görüntü elde etmek için Cy3 için 532/580 nm ve 633/670 nm uyarım / emisyon dalga boylarında, bir DIGE Görüntüleyici tarayıcı ile iki düşük floresan cam plakalar arasına dökülmektedir Tarama jeller.
2. Daha önce ¹² ayrıntılı olarak ticari yazılım ile görüntü analizi yapın.
3. Hesaplayın ve her görüntüde spot hacimleri normale. Bir pervane gibi bir normalize nokta hacmi atamaHer nokta, toplam değerinin ortion jel saptanmıştır.
4. Iki grup (M1 ve M2) arasındaki normalize nokta hacim değeri karşılaştırarak makrofajlar her tip protein nokta hacimlerindeki farklılıkları analiz. Değişim 1.5 kat (p <0.05, tek yönlü ANOVA analizi) ise anlamlı nokta hacimleri arasındaki farkı düşünün.

Sonuçlar

Uygun diferansiyel proteomik analizi gerçekleştirmek için, analiz edilecek örneklerin işlenmesi doğrulanması gerekir.

Önce ⁵ yayınlanan sunulan örnekte, makrofaj hücre kültürü kalitesi, morfolojik ve moleküler özellikler için gereklidir. Makrofajlar monositlerin farklılaşması ve kültürün homojenliği faz mikroskobu ile takip edilmiştir. Şekil 1, M1 ve M2 makrofajların primer kültürlerinde bir örnek göstermiştir. Gösterildiği gibi, M1 (Şekil 1A, B) ...

Tartışma

Bu tarifnamede tarif edilen protokol makrofajlar, M1 (pro-enflamatuar) ve M2 (anti-iltihap) olarak iki alt-tip farklı uyaranların etkisini analiz etmek için bir yöntem göstermektedir. Daha önce ⁷ yayınlanan M1 ve M2 makrofajların birincil kültürleri monositlerin farklılaşması elde edilmiştir.

2D DIGE jel elektroforezi prosedür, Cy3 ve Cy5 floresans bir tarayıcı için uyarım / emisyon dalga iki kez jel tarama yapmak için SDS-PAGE için izoelektro-odaklanma, düşük floresan levhaları I...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RPMI 1640	Canlandırıcı	31870-074
PBX 10 X	Canlandırıcı	14200-083
L-glutamin-200 mM-100X	Canlandırıcı	25030-024
gentamisin 10 mg / ml	İçleyici	15710-049
insan serumu	Canlandırıcı	34005100
Ficoll d = 1,077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
6 kuyulu plaka PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolisakkarit	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Araştırma Organikleri	3.00E + 01
Filtre 0.22 ve mikro; m	Millipore	SCGPTORE
100 ml silindir	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford reaktifi	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-reaktif boya	GE Healthcare	25-8009-83
IPG şeridi 3-10 24cm	GE Sağlık	17-6002-44
Protean IEF hücresi	Bio-Rad	165-4000
Düşük erime noktalı agaroz	Invitrogen	15517-014
Ettan-Daltsix sistemi	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Görüntüleyici tarayıcı	GE Healthcare
Progenesis Samespot Doğrusal	olmayan dinamikler
50 ml tüpler	herhangi bir tedarikçi	yok
15 ml tüpler	herhangi bir tedarikçi	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
sizin&ekanlığınız; e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Farmalitler 3-10	GE Sağlık	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Bromofenol mavisi	Sigma-Aldrich	114391
Gliserol	Sigma-Aldrich	G6279
Akrilamid% 40	Bio-Rad	161-0148
2D temizleme	GE Healthcare	80-6454-51
Glisin	Sigma-Aldrich	G7126
Loş ve eacute; thylformamide	Sigma-Aldrich	22705-6
elektrot fitilleri	Bio-Rad	165-4071