Yöntem makalesi

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi İn Vitro

DOI:

10.3791/52221

⸱

21 Mart 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Animal Biology, The University of Western Australia, 2School of Animal Biology and The Oceans Institute, The University of Western Australia, 3Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Anatomy, Physiology and Human Biology, The University of Western Australia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutarlı olmayan Xenon ışığı, kültürlenmiş hücrelere değişen dalga boyu ve yoğunlukta ışık iletmek için dar bant girişim ve nötr yoğunluk filtrelerinden geçirildi. Bu protokol, kırmızı / yakın kızılötesi ışık terapisinin in vitro olarak reaktif türlerin üretimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanıldı: test edilen parametreler kullanılarak herhangi bir etki gözlenmedi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer veya ışık yayan diyot (LED) tarafından teslim Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık tedavisi (R / NIR-LT), muhtemelen oksidatif stresi azaltarak in vivo merkezi sinir sistemi yaralanmaları, bir dizi fonksiyonel ve morfolojik sonuçlar geliştirir. Bununla birlikte, oksidatif stres R / NIR LT etkileri dalga boyu ya da ışının yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir gösterilmiştir. Tedavi parametreleri karşılaştıran çalışmalar nedeniyle vitro optimizasyon çalışmalarında koymak yoluyla yüksek uygun çoklu dalga boylarını veya yoğunluklarını, teslim piyasada mevcut cihazların olmaması nedeniyle, eksiktir. Bu protokol belirli bir yaralanma modeli için gerekli olan terapötik dozları optimize etmek için dalga boyu ve yoğunluk aralığında ışık iletimi için bir yöntem açıklanır. Bu dalga boyu ve yoğunluk parametreleri kolayca değiştirilebilir hangi ışık sağlamaya yarayan bir yöntem olup, reaktif oksijen türleri azaltmak için Ar / NIR LT optimal dozunun belirlenmesini kolaylaştırmak ileri sürdülerIn vitro (ROS).

Düzensiz Xenon lambası değişen dalga boylarında (440, 550, 670 merkezi dalga boylarının ve 810nm) ve akızamanları sağlamak için dar bantlı girişim filtreleri içinden süzülmüş (8.5 x 10 -3 3.8 x 10 -1 J / cm2) ışık kültür hücreleri. Aygıtından Işık çıkışı, her dalga boyunda ışık, terapötik anlamda ilgili, eşit quantal doz yayılmasını sağlamak için kalibre edilmiştir. Glutamat DCFH-DA ve H2O 2 duyarlı fluoresan boyalar kullanılarak ışık ile muamele edilmiş hücreler stresli reaktif türleri tespit edilmiştir.

Başarıyla MSS yaralanması modeli olarak glutamata maruz kültür hücreleri, ilgili dalga boylarında ve yoğunlukları, fizyolojik ve terapötik bir aralığında ışık vermiştir. Kültürlenmiş hücreler tarafından üretilen ROS üzerinde bir etki gösterebilir değil mevcut çalışmada kullanılan R / NIR LT akıcılıklarda birlikte, ışık uygulama yöntemi için diğer syst için geçerlidirems daha fizyolojik mitokondri veya ilgili organotipik dilim kültür modelleri izole dahil, ve oksidatif metabolizma sonucu önlemlerinin bir dizi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktif oksijen türleri (ROS) sinyal transdüksiyon yollar ve nöro-1 de dahil olmak üzere, hücresel metabolizmanın normal reaksiyonlar, bir dizi gereklidir. Endojen antioksidan mekanizma ROS üretimini kontrol edemiyoruz Ancak, hücreler oksidatif strese 2,3 yenik düşebilir. MSS yaralanma sonrasında, ROS ve oksidatif stres varlığında ilişkili artışlar hasar 4,5 ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Değerlendirilmiştir oksidatif stres zayıflatmaya yönelik stratejiler geniş olmasına rağmen, nörotravma 6 aşağıdaki klinik kullanımda ROS üretimini ve ilişkili oksidatif stresi zayıflatmaya yönelik hiçbir tamamen etkili, klinik açıdan önemli bir anti-oksidan stratejileri şu anda. Bu nedenle oksidatif stres zayıflama terapötik müdahale 7 için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.

İyileştirmeler takiping R / NIR LT yaralanmalar ve belki de oksidatif stres azaltarak miyokard enfarktüs boyutu, diyabet renal ve hepatik komplikasyonlar, retinal dejenerasyon, merkezi sinir sistemi hasarı ve inme 8 azalmalar da dahil olmak üzere geniş bir hastalık aralığında bildirilmiştir. MSS yaralanması, özellikle ilgili olarak, 670nm ışık etkinliğinin klinik öncesi çalışmalar, retinal dejenerasyon 9-11, omurilik yaralanması, 12 nöronal ölüm 13 modellerinde iyi etki gözlemlenmemiştir. Klinik çalışmalar, ancak bu çalışmaların sonuçları 15 parametreleri etkin tedavi istihdam belki de bir arıza, umut verici görünmüyor, bağlı makula dejeneresansı kuru yaş için yapılan ve inme 14 şu anda devam etmektedir edilmiştir. Gibi, R / NIR-LT yaygın bir non-invaziv, yönetmek kolay ve nispeten ucuz bir tedavi olmasına rağmen, nörotravmada normal klinik pratikte bir parçası olarak kabul edilmemiştir. Klinik çeviri Engeller bir cl eksikliği,Erken bir standart etkili tedavi protokolü 16,17 eylem ve yokluğu mekanizmasını anladım. Işık tedavisi ile ilgili güncel literatür ışınlama kaynaklarına göre (LED veya lazer), dalga boyu (örneğin, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), ışınlama toplam dozu (joule / tedavi parametrelerinin varyasyon bir bolluk ortaya birim alan), süresi (maruz kalma süresi), zamanlama (öncesi veya sonrası hakaret), tedavi sıklığı ve doğum şekli () darbeli veya sürekli 8. çalışmalar arasında tedavi parametreleri değişkenlik karşılaştırma zorlaştırır ve etkinliği 16 ilişkin şüphecilik katkıda bulunmuştur.

Bu nedenle, R / NIR-LT optimizasyonu açıkça birden değişkenleri karşılaştırmak için gerekli yüksek verimli tarama mekanizması sağlamak mümkün hücre kültürü sistemleri, gereklidir. Ancak wa üzerinde yeterli esneklik ve kontrol sağlayabilir birkaç piyasada mevcut aydınlatma sistemleri vardırvelength ve yoğunluğu gibi optimizasyon deneyleri gerçekleştirmek için. Ticari olarak temin edilebilen cihazlar genel olarak ışık yoğunluğu, sadece farklı olabilir, farklı üreticiler tarafından birden çok LED elemanları içeren araştırmacılar olarak elde edilen çoklu dalga ya da yoğunlukları, teslim etmek mümkün değil, aynı zamanda yayılan ışığın dalga boyu spektrumu değildir. Biz böylece R / NIR-LT parametrelerinin yakın, doğru kontrol sağlayan, dalga boyu ve ışık akıcılıklarda bir dizi üreten, dar girişim filtreleri ile filtre geniş bant Xenon ışık kaynağı kullanılarak bu konuya değindik.

Bu tedavinin terapötik doz R / NIR LT durumunda sitokrom C oksidaz (COX) 18 olduğu kabul edilmektedir, photoacceptor (kromofor) ile etkileşim fotonların sayısı ile tanımlanır dikkat etmek önemlidir. Teslim foton enerjisi dalga boyu ile değişir; farklı dalga boylarında enerji eşit dozlarda anlam com olacakfotonların farklı sayılar ödüllü. Bu nedenle, cihazdan çıkan ışık, test edilecek seçilmiş dalga boylarının her biri için bir foton eşit sayıda yaymak üzere kalibre edilmiştir. Biz in vitro hücrelere dalga boyu ve yoğunlukları aralığında R / NIR-LT sunmak için kullanılabilecek bir sistem geliştirildi ve tabi hücrelerde ROS üretimi üzerinde teslim R / NIR-LT etkilerini ölçmek yeteneği göstermiştir glutamat stres.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Optik Kalibrasyon: Ölçme Işık Çıkışı

  1. Işık teslim aparatı hazırlamak için, geniş bant ışık kaynağı bağlamak (örneğin, Xenon veya tungsten lamba) uygun bir güç kaynağına. Işık, birleştirilmiş ışını üretmek için, ışık kaynağının önünde bir kolimatör lensi yerleştirin. Işık demeti gelen ısının çoğunu çıkarmak için bir sıvı ısı filtre içinden ışık geçirir. Uygulamaya bağlı olarak, ışığın daha esnek teslimat (örn., Bir kuluçka makinesi içine) sağlayan bir sıvı ışık kılavuzunun giriş açıklığı, üzerine birleştirilmiş ışın odak.
  2. Sıvı ışık kılavuzunun diğer ucunda, ikinci bir kolimatör lensi ve daha sonra müdahale ve nötral yoğunluk filtreleri için bir tutucu yerleştirin. Bu düzenleme istenen dalga ve yoğunlukta bir ışık eşit aydınlatılmış nokta üretir olmadığını kontrol edin.
    Not: Işık rehber ve örnek uçağın sonu arasındaki mesafe bağlı olarak değişebilir gerekebilirIşıklı, ancak gereken alan ışık kılavuzu artar ucundan mesafe olarak, ışık şiddeti azalacak unutmayın. Bu çalışmada, bu mesafe, 14cm ve eşit oranda 96 oyuklu bir plaka üzerinde 3x3 alan iyi aydınlatan bir kiriş kesite üretir.
  3. Lamba ve ilişkili optik bileşenleri bu sokak ışığı olun numune ulaşmak mümkün.
  4. Sıvı ısı filtresi su soğutucusu açın ve filtre ceket suyun değişimi olduğundan emin olunuz. Lamba güç kaynağı açın ve stabilize genişbant ışık kaynağı için en az 5 dakika bekleyin. Not: su soğutucu kullanılması cihazın aşırı ısınmasını önlemek için gereklidir.
  5. Aydınlatma istenen dalga bandını oluşturmak için (genellikle yarım maksimum (FWHM) bant genişliği kendi merkez dalga boyu, tepe geçirgenlik ve tam genişliği tarafından açıklanan) bir dar girişim filtre seçin. Not: Bu çalışmada kullanılan dar girişim filtreleri 4 idi42 nm, 550 nm, 671 nm ve 810 nm.
  6. Numune tedavi sırasında yerleştirilmiş olan düzlemde lamba tarafından üretilen ışık ölçülür. Üreticinin talimatlarına uygun olarak uygunluk yazılımı kullanılarak, uygun bir spektrorayometrenin bağlı kalibre edilmiş bir ışık şiddeti prob (kosinüs kolektörü) kullanılarak ışık ölçülür.
  7. İstenilen çıkış elde edilene kadar ışık yoğunluğunu ayarlamak için nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Not: Bu çalışmada, her bir girişim filtresi tarafından geçirilen ışığın yoğunluğu dört tedavi dalgaların her birinde eşit quantal çıkış verecek şekilde ayarlanır. Bu lamba çıkışı değişebilir gibi, düzenli kalibrasyon kontrol etmek önemlidir.
    Not: aparatın set up takiben, hücreler ışıklı hazır 1 çalışmada kullanılan ışık teslim aygıtının bir temsildir..

figure-protocol-1

Işık teslim aparatı. Resimli Şekil 1. Görüntü ışık güç kaynağı, konut, collimating lens, su filtresi, giriş açıklığı, sıvı ışık kılavuzu, ikinci kolimatör lens, filtre tutucu, tedavi çerçevesi ve mat siyah kart ile xenon lamba vardır. Dar dalga boyu ve yoğunluğu filtreleri gösterilmez unutmayın.

2. Hücre Hazırlanması

  1. açıklandığı gibi R / NIR LT dağıtım yöntemi, herhangi bir hücre tipi ya da in vitro model sisteminde uygulanabilir; Hücre kültürü, aşağıdaki tanımları, kültür feokromositoma (PC12), Müller (rMC1) ve primer karma retina hücreleri tarafından iyi bilinen teknikler kullanılarak, genel olarak.
  2. Işık tedavisi ve oksidatif stres tahlilinde hücre ekim önce kültür T75 flas uygun ekler (örn., FBS, antibiyotikler) ihtiva eden ilgili büyüme ortamında hücrelerin ölümsüz% 70-80, birbirine karışana kadar ks.
  3. Örneğin test edilecek hücre tipi için uygun yöntemi kullanarak, T75 şişelerinden ölümsüzleştirdi hücreleri ayırmak., Tripsin. Gerekirse, 96 oyuklu tahlil plâkalarında hücrelerin tohumlama ile devam etmeden önce, kaplama bir deney plakası (PC 12 hücreleri için, örneğin.) 1 saat için 10 ug / mL poli-L-lizin ile kuyu veya 10 ug / ml poli-L-lizin için 10 ug olan bir O / N inkübasyon, ardından 1 saat / mL, laminin (ör., karışık retina hücreleri için).
  4. Santrifüj hücreleri (örn., PC12 hücreleri için 405 x g ya da rMC1 hücreleri için 218 x g'de 10 dakika sonra 3 dakika) uygun toplamak için, uygun hücre kültür ortamı içinde 8 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
  5. Karışık retinal hücreler kullanılacak ise, tespit edilmiş işlemler 19'a göre enzimatik sindirme (papain) ile P0-5 yenidoğan sıçan yavrularından hazırlanması
  6. Bir hemositometre kullanılarak,% 0.4 (a / h), tripan mavi boya hariç canlı hücre sayısı.
  7. Hücre yoğunluğu suc ayarlamaHücreler, kültür içinde 24 ya da 48 saat sonra yaklaşık olarak% 70-80 konfluent olacak s. (PC 12 hücreleri için tohum yoğunluğu rMC1 hücreleri için, bu, 2.5 x 10 5 canlı hücre / ml ve karışık retina hücreleri için 8 x 10 5 canlı hücre / ml, 4.0 x 10 5 canlı hücre / ml). Hücreleri ilave edildikten sonra ya da uygun bir büyüme ortamı, 100 ul, (H2O 2 veya DCFH-DA deneyi için sırasıyla kullanılır) açık ya da siyah 96 oyuklu plakalar, plaka 37 ° C'de, 5 düz bir yüzey üzerinde oturmasına olanak sağlamak için % CO2 hücre yapışmasını sağlamak için en az 24 saat boyunca (ya da koşullar, belirli bir hücre tipi için uygun).
  8. Uygun 96 gözlü tepsiler içinde büyüme ortamı içinde kültür hücreleri% 70-80 konfluent (PC12 ve rMC1 hücreleri için 24 saat karıştırılmış retina hücreleri için 48 saat) kadar.

3. Hücreleri Glutamat stresördür ekleme

  1. Uygun tam yetişmektedir 0-10mM L-glutamik asit monosodyum tuzu, hidratı stres konsantrasyonları hazırlamakinci kültür ortamı.
  2. Hücrelerden ortamı çıkarın ve yavaşça PBS (PC12) veya HBSS (rMC1 ve karışık retina hücreleri) ile hücreler 3 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, / göz 100 ul toplam hacmine glutamat içeren ortamı eklenir.

Işık Tedavi 4. İlk dozları

  1. Hemen glutamat ya da tercih edilen stres eklenmesi ile hazırlanan ışık verme cihazının altına yerleştirilerek, istenen dalga boylarında ve yoğunluklarda ışık tedavisi hücrelerin maruz kalmaktadır. Dalga boyuna bağlı olarak nötral yoğunluk filtreleri kurulan kombinasyonları kullanılarak ışık demetinin quantal çıkışını yönetilen değiştirmek emin olun.
    Not: Mevcut deneylerde, 3 dakika boyunca ışık tedavisi hücreleri maruz 37 o C ısı yastığı 96 kuyu plakaları dinlenme sıcaklığını korumak. Gerekli tedavi süresi değişebilir.
    1. 96-wel bitişik kuyulara yansıtan ışık önlemek için hücrelerin altında bir mat siyah kart yerleştirinl tepsisi diğer tedavi parametreleri için belirlenen.
  2. Tedavi süresi, daha uzun için arzu edildiği takdirde, uygun olan ya da koşulları hücre kültür ortamının pH'ının muhafaza edilmesi ya da, ideal olarak% 5 CO2 ayarlandı CO2 konsantrasyonuna sahip bir kuluçka makinesi içinde cihaz ve tedavi plakaları yerleştirmek için 25 mM Hepes tampon eklemek özel bir hücre tipi için.
  3. Işık tedavisi tamamlandıktan sonra, düz bir yüzeye yerleştirin ve hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübe 24 saat için (ya da koşullar ne olursa olsun hücre tipi için en uygun).
    Not: Yukarıda tarif edildiği gibi, istenen R / NIR LT ek dozlar uygulanabilir.

ROS Işık Tedavi ve Algılama 5. Nihai Doz

  1. Işık tedavisi son turu yapmadan önce, reaktifler ROS tespiti için kullanılacak hazırlamak. 2 O 2 algılama reaktif çalışma 50mM sitrat tamponu (pH 6.0), Triton X100 ve H hazırlayınçözeltisi (1: 2: 10 mM H2O 2 saptama reaktif maddesi stok çözeltisi 97 oranı, 10 U / ml yaban turpu peroksidaz, 50 mM soyum sitrat (pH 6.0)). Uygun bir ortamda 100uM nihai konsantrasyon DCFH-DA hazırlayın.
    Not: PC 12 hücreleri için DCFH-DA reaktif RPMI ortamı içinde olan, rMC1 hücreleri için DCFH-DA reaktif DMEM ortamı. Piyasada mevcut algılama reaktifleri özel ROS diferansiyel hassasiyetleri var ve reaktifler bir bireysel başvuru için istenen bilgileri temin etmek dikkatle seçilmelidir unutmayın.
  2. Aşama 4.1-4.1.2 tarif edildiği gibi, hücrelere ışık tedavisi uygulayın. Emin olun hücreler ışık istenen etkilenirler / dalga boyları ile tedavi ediliyor.
  3. Hemen glutamat içeren ortamını çıkarın ve uygun tampon çözeltisi ile iki kez yıkanır, ışık tedavisi aşağıdaki gibidir (PC 12 hücreleri için, PBS kullanılır ve rMC1 hücreleri için, HBSS kullanılır). Aşağıdaki gibi hücreler üzerinde ROS tahlilleri gerçekleştirin:
    1. H2O 2 CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve% 5. H 50 ul H2O 2 algılama çalışma çözeltisi eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. 530nm bir eksitasyon dalga boyu ve 480nm emisyon dalga boyu olan bir plaka okuyucusu kullanılarak floresan ölçülür.
    2. DCF deneyi: bölümlerinin her birine DCFH-DA, 100 uM çözeltisi 100 ul ve 37 ° C'de 30 dakika% 5 CO2 inkübe edilir. 100 uM DCFH-DA içeren Ortamı çıkarın ve (yukarıda anlatıldığı gibi) iki kez uygun bir tampon çözeltisi ile yıkanır. Kuyusunun herbirine, tampon çözeltisi ve 10 ul Triton X100, 90 ul ekleyin ve yavaşça 37 ° C'de 30 saniye 15 önce dakika kuluçkalama için bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. 480nm bir eksitasyon dalga boyu ve emisyon Wavel bir plaka okuyucusu kullanılarak DCF edilen floresan ölçülür530nm ve ength.
    3. Hızlı ROS mg protein hesaplamak için standart bir eğri değini ile, üreticinin talimatlarına uygun olarak protein konsantrasyonunu belirlemek için kolorimetrik bir kit kullanılarak, oyuklarda kalan hücrelerin protein konsantrasyonu ile ilgili değerler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

670nm bir dalga boyunda, iletilen ışığın, önceden in vivo üretimi (0.3 J / cm2), 20 olarak yararlı olduğu gösterilmiştir 670nm ışık dozu kapsayan akıcılıklarda bir dizi hücre ışın tedavisi amacıyla nötr yoğunluk filtreleri kullanılarak kalibre edilmiştir. Artan ışık kaynağının önünde nötral yoğunluk filtreleri sayısı arttıkça, yoğunluk (W / m 2) daha az ışık hedef alana geçmek için izin düşmüştür. Tablo 1, bir dalga boyu filtre takılmış bir ışık kaynağından üretilen 670nm ışık kal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz başarıyla R / NIR-LT in vitro optimizasyonu çalışması için bir mekanizma sağlamak için kesin ve kalibre ışık iletim sistemini adapte var. R Dalgaboyu ve yoğunluk parametreleri / NUR-LT, bu sistemi kullanarak doğru ve etkili bir şekilde manipüle edilmesi mümkün bulunmaktadır. ROS test edilen hücre tiplerinde, Verilen dalga boylarında ve dozajlarda düşük değil, ancak biz, hücre ölümüne yol açmamıştır hücrelerininkine ışık tedavisi kurulmuştur. 670nm (20.11W / m 2) akım sistem tarafından ulaşılan ma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Nörotravma Araştırma Programı (Batı Avustralya) tarafından desteklenmiştir. Bu proje, Yol Travması Güven Hesabı aracılığıyla finanse edilmektedir, ancak Yol Güvenliği Konseyi'nin görüşlerini veya tavsiyelerini yansıtmamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
OxiSelect Hücre İçi ROS Test Kiti (Yeşil Floresan)Cell BiolabsSTA-342
Amplex UltraRed ReaktifMoleküler ProblarA36006
300 Watt Xenon Ark LambasıNewport Corporation6258Çok yoğun ışık kaynağı, doğrudan lambaya bakmayın. Açıkken lambanın yeterli soğutma olduğundan emin olun
USB4000-FL Floresan SpektrometresiOkyanus Optiği
CC-3-UV Emisyon Toplama için KosinüsDüzeltici Ocean Optics
200μ m çaplı kuvars fiber optikOkyanus Optiği
SpectraSuite Spektroskopi PlatformuOkyanus Optiği
2300 EnSpire Çok Modlu Plaka OkuyucuPerkin Elmer
Pierce BCA Protein Test KitiThermo Scientific23225
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Akut toksisite, kullanırken eldiven giyin.
L-Glutamik asit monosodyum tuzu hidratSigma-Aldrich142-47-2 (susuz)
Feokromasitoma sıçan adrenal medulla (PC12) hücreleriAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-2522
Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI1640) MedyaGibco11875-119
Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı ile inaktive edilmiş, ABD menşeliGibco10082-14737 ° C'ye kadar sıcak; Kullanmadan önce su banyosunda C
At Serumu, Yeni Zelanda menşeliGibco16050-12237 ° C'ye kadar sıcak; Kullanmadan önce su banyosunda C
GlutaMAX TakviyesiGibco35050-06137 °C'ye kadar ısıtın; Kullanmadan önce su banyosunda C
100 mM Sodyum PiruvatGibco11360-07037 ° C'ye kadar ısıtın; Kullanmadan önce su banyosunda C
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140-12237 °C'ye kadar ısıtın; Kullanmadan önce su banyosunda C
100X MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler ÇözeltisiGibco11140-05037 °C'ye kadar ısıtın; Kullanmadan önce su banyosunda C
Retinal Muller (rMC1) hücreleriCalifornia Üniversitesi, San Diego
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco11965-11837 ° C'ye kadar sıcak; Kullanmadan önce su banyosunda C
75 cm2 ŞişelerBD BiosciencesB4-BE-353136
Poli-L-lizin hidrobromürSigma-Aldrich25988-63-0Aliquot ve -20 °C'de saklayın; C
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Gibco14025-13437 °C'ye kadar ısıtın; Kullanmadan önce su banyosunda C
Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS)Gibco10010-04937 ° C'ye kadar ısıtın; Laminin
Mouse Protein, NaturalGibco23017-015Aliquot'u kullanmadan önce su banyosunda C ve -20 ° C'de saklayın; C
1X Nörobazal OrtaGibco21103-04937 °C'ye kadar sıcak; Kullanmadan önce su banyosunda C
Tripan Mavi Çözeltisi,% 0.4Gibco15250-061
165U PapainWorthington
L-SisteinSigma-AldrichW326305
Corning 96 kuyulu plakalar, şeffaf alt, siyahCorningCLS3603-48EA
Costar Şeffaf Polistiren 96 Kuyulu Plakalar İşlenmemiş; Kuyu şekli: Yuvarlak; Steril.Costar07-200-103
Tahterevalli RockerStandart laboratuvar epuipment
SantrifüjStandart laboratuvar epuipment
Nötr Yoğunluk Filtre Kağıdı (0.3)THORLABS
442 nm Bant Geçiren FiltreTHORLABSFL441.6-10
550 nm Bant Geçiren FiltreTHORLABSFB550-10
670 nm Bant Geçiren FiltreTHORLABSFB670-10
810 nm Bant Geçiren FiltreTHORLABSFB810-10E
Sökülmemiş ve Oslash; 25 mm Emici Nötr Yoğunluk Filtreleri (0.1)THORLABSNE01B
Sökülüp takılan; 25 mm emici nötr yoğunluk filtreleri (0.2)THORLABSNE02B
Sökülüp takılmamış; 25 mm Emici Nötr Yoğunluk Filtreleri (0.3)THORLABSNE03B
Sökülmüş ve Oslash; 25 mm emici nötr yoğunluk filtreleri (0.5)THORLABSNE05B
Sökülüp takılmamış; 25 mm emici nötr yoğunluk filtreleri (0.6)THORLABSNE06B
monte edilmemiş ve eğilmiş; 25 mm Emici Nötr Yoğunluk Filtreleri (1.0)THORLABSNE10B

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
  2. Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
  3. Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
  4. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
  5. Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
  6. Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
  7. Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
  8. Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
  9. Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257(2012).
  10. Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
  11. Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828(2013).
  12. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
  13. Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
  14. Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
  15. Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
  16. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  17. Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
  18. Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
  19. Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
  20. Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
  21. Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002(2013).
  22. Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
  23. Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksidatif Stres De erlendirmesiDalga Boyu iddeti Manip lasyonuKsenon I k letim SistemiDar Bant Giri im FiltreleriN tr Yo unluk FiltreleriReaktif Oksijen T rleri TespitiDCFH DA Floresan BoyasH2O2 Duyarl AnalizGlutamatla Streslenmi H creler

İlgili makaleler