Method Article

Bir Geliştirilmesi In vitro bir model sistem Equus Caballus ile IgE

DOI:

10.3791/52222

⸱

November 1st, 2014

 ,  , 
1Biological Department, King Abdulaziz University, 2The Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, The University of Sheffield

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, sıçan bazofilik lösemi hücrelerinin at FcεRIα geni ile transfeksiyonuna dayanan genetik olarak tasarlanmış bir test sisteminin geliştirilmesini ve uygulamalarını açıklamaktadır. Transfekte edilmiş hücreler, alerjik yanıtın mediatörlerinin salınımının IgE ve antijen tarafından aktive edilebildiği fonksiyonel bir reseptörü eksprese eder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IgE'nin yüksek afiniteli Fc reseptörü (FcεRI) ile etkileşimi ve ardından antijenik bir meydan okuma, IgE aracılı alerjik reaksiyonlardaki temel yoldur. IgE ve FcεRI arasındaki yüksek afiniteli bağlanmanın bir sonucu olarak, B hücreleri tarafından sürekli IgE üretimi ile birlikte, alerjiler genellikle yaşam boyu devam eder ve şu anda kalıcı bir tedavi mevcut değildir. Atlar, özellikle yaygın olarak akraba evliliği olan yarış atları, performanslarını ciddi şekilde etkileyebilecek aşırı duyarlılık tepkilerinin gelişmesine çok yatkın bir memeli türüdür. Atlarda alerjik duyarlılığa verilen fizyolojik tepkiler, insanlarda ve köpeklerde gözlenenleri yansıtır. Bu yazıda, at sistemine ait alerjik yanıtın aracılarının salınımının kantitatif değerlendirmesi için yerinde bir tahlil sisteminin geliştirilmesini açıklıyoruz. Bu amaçla, at FcεRIα'yı kodlayan gen, ebeveyn Sıçan Bazofil Lösemi (RBL-2H3.1) hücrelerinin yüzeyine transfekte edildi ve eksprese edildi. Transfekte edilmiş at α zincirinin gen ürünü, endojen sıçan β ve γ zincirleri 1 ile fonksiyonel bir reseptör kompleksi oluşturdu. Elde edilen tahlil sistemi, at IgE ile duyarlılık ve β-hekzosaminidaz salınımı kullanılarak antijenik meydan okumayı takiben at FcεRIα transfekte edilmiş RBL-2H3.1 hücrelerinden salgılanan aracı miktarının değerlendirilmesini kolaylaştırdı 2, 3. Mediatör salınımı 100 ng ml-1 antijende %36.68 ± %4.88 ile zirve yaptı. Bu test, insan ve köpek alerjik tepkilerini incelemek için kullanılan önceki testlerden modifiye edilmiştir 4, 5. Ayrıca, bu tür bir tahlil sisteminin, alerjik hastalıkta tanı araçlarının geliştirilmesi ve potansiyel terapötik müdahale stratejilerinin güvenlik değerlendirmesi için birden fazla uygulamaya sahip olduğunu göstermiştir 6, 2, 3.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alerji bin beri bilinmektedir. Bir astım tedavisi Ebers Papirüs (~ 1550 BCE) olarak bilinen Antik Mısır tıbbi metinde açıklanan ve 7 tedavisinde bitkisel ilaçlar tartışıldı.

Günümüzde alerji T yardımcı hücre tür 2 (T H 2), bağışıklık sistemi kolu alerjenler olarak adlandırılan, çevresel antijenlere yanıt olarak immünoglobülin E (IgE) antikorlarının üretimi yön, bir tip I hipersensitivite cevabı olarak sınıflandırılır. Bunlar yaygın olarak bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşen ve IgE sentezi, sigara dumanı ya da dizel egzoz parçacıklar içinde parçacıklar geliştirmek göstermemektedir gibi interlökin-4 ve interlöki....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celi Line 1) hazırlanması:

  1. At FcεRI α ifade RBL-2H3.1 hücre çizgisi Geliştirme:
    1. 28: tek tabakalı hücre hatları için temel doku kültürü teknikleri kullanılarak, at FcεRIα gen (Y18204.1 Gen Bankası) taşıyan, pEE6 plasmidi kullanılarak ebeveyn RBL-2H3.1 hücreleri transfekte. 1.2 x10 7 hücreleri mi -1 yoğunluğunda hücreler 0.8 ml 2 ug plasmid DNA ug ul -1 ekleyin. Hemen ardından 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe 0.4 cm'lik bir electrocuvette kullanılarak, 250 V 960 uF'de hücrelerin elektroporasyonu.
    2. Genetisin G418 sülfat 0.4 g içeren bir ortam kullanılarak dönüştürülmüş hücrel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ebeveyn RBL-2H3.1 hücreleri ve at FcεRIα reseptörü geni ile transfekte edilmiş olan birinci fare IgE anti-DNP-HSA ile duyarlı ve DNP-HSA antigen ile tehdit edildi. Fare IgE her iki hücre içinde endojen fare reseptörüne bağlanan ve bu nedenle mediatörler (Şekil 1 A) 'serbest bırakmak için, her iki hücre çizgilerinin salma canlılığını test etmek için bir kontrol olarak işlev görür. Bu önemli bir kontroldür ve hücre kültüründe uzatılmış (> 10 hafta) geçmesi üzerine rutin beri yapılmalıdır, RBL-2H3.1 hüc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özetle bu soruşturmanın sonuçları at FcεRIα ifade RBL-2H3.1 hücreleri, bir antijen tarafından at IgE ile duyarlı ve meydan, onlar içinde arabulucu toplam miktarın% 4.88 ± 36,68% bir zirve mediatör salınımını vermek olduğunu gösterdi Hücreler, RBL-2H3.1 göre ana hücreler ekuin FcεRIα ifade değildir.

Dolayısıyla, bu tahlil soruşturma ve in vitro at alerjik yanıtları incelemek için yararlı bir araç sağlar. Onun mast hücresi / bazofil soy hücreleri tarafından salınan arabulucu miktarını.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalede rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, tavsiye ve laboratuvar olanakları için Dr. Lynda Partridge'e teşekkür eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RBL-2H3.1 At Fc & epsilon İfade Etme; RI ve alfa;-Laboratuvarda üretilen
At IgE anti NIP-HSA-Laboratuvarda üretilen
96 Kuyulu PlakaSigmaCLS3595-Çok
Kanallı Pipet Anachem-
İnkübatörGalaxy R-
4Hidroksi-5-iyodo-3-nitrofenilasetik asitCambridge Araştırma BiyokimyasallarıN-1070-1NIP-OH, laboratuvarda NIP-HSA yapmak için İnsan Serum Albümini ile konjuge edildi
İnsan Serum Albüminine Konjuge DinitrofenilSigmaA6661Kısaltılmış DNP-HSA
Plaka SpektrofotometresiAnthos Labtec HT2-
BorularSigmaP1851-Sodyum
KlorürSigmaS7653-Potasyum
KlorürSigmaP9333-Magnezyum
KlorürSigmaM2670-Kalsiyum
KlorürSigmaC1016-Triton
x100SigmaX100-4-nitrofenil
N-asetil-β-D-glukozaminidSigmaN9376β-heksosaminidaz substratı adı verilen stok çözeltisi, DMSO Dimetil Sülfoksit Sigma'da hazırlanan 50mM idi
D2650-Sitrik
Asit Sigma251275-Sodyum
AsetatSigmaS7670-Tris
SigmaT5941-
.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
  2. Sabban, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Equine IgEFc RI ReceptorRat Basophil Leukemia CellsMediator Release AssayBeta Hexosaminidase ReleaseAntigenic ChallengeAllergic ResponseIn Vitro ModelEquine AllergyRBL 2H3 1 Cells

Related Articles