Yöntem makalesi

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

DOI:

10.3791/52224

⸱

25 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sürekli büyümeye göre ayarlanmış besleme kullanan besin düzenlemesi, karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörlerindeki kültürler için aralıklı toplu beslemeye kıyasla memeli hücre sferoidlerinin büyüme oranlarını iyileştirir. Bu çalışma, basit düzeltilmiş oranlı beslenen kültürlerin oluşturulması için gerekli yöntemleri göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu gösterimde, β-TC6 insülinoma hücre hattından oluşturulan sferoidler, besin seviyelerinin düzenlenmesinin hücre verimini nasıl iyileştirebileceğini göstermek için bir memeli adacık hücresi ürününün üretilmesinin bir modeli olarak kültürlendi. Önceki çalışmalarda, biyoreaktörler statik kültürlere göre artan kültür hacimlerini kolaylaştırdı, ancak hücre verimlerinde herhangi bir artış gözlenmedi. Toplu beslemeler arasında tüketilen glikoz gibi temel besin maddelerindeki sınırlamalar, hücre genişlemesinde sınırlamalara yol açabilir. Ortamdaki glikoz konsantrasyonlarındaki artışa rağmen, glikoz seviyelerinde büyük dalgalanmalar gözlendi. Sürekli besleme sistemlerinin kullanılması, glikoz seviyelerindeki dalgalanmaları ortadan kaldırdı ve toplu beslemeli statik ve SSB kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında hücre büyüme oranlarını iyileştirdi. Hesaplanan besin tüketimine dayalı olarak besleme hızının ayarlanmasıyla büyüme oranlarında ek artışlar gözlendi, bu da kültürde üç hafta boyunca fizyolojik glikozun korunmasına izin verdi. Bu yöntem diğer hücre tipleri için de uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantasyon için uygulanabilir ve fonksiyonel insan hücrelerinin çok sayıda oluşturmak için, kültür koşullarının düzenlenmesi zorunludur. 3 - metabolik atıkların birikimi ile birlikte besinlerin tükenmesi, hücre ürününün 1 kalitesini azaltır yaşlanması ve metabolik değişikliklere önemli sebeplerindendir. Bu prosedür kültürünün süresi boyunca fizyolojik aralığında 4 glikoz düzenleyen ayarlanmış oran perfüzyon besleme sistemi ile birlikte karıştırılan bir biyoreaktör kullanarak küresellerde kültür memeli hücrelerinin bir yöntemi gösterir. Bu çalışmaların amacı için, fizyolojik aralığı 100 ila 200 mg / dl olarak tanımlandı. Aynı yöntemleri diğer besin ve laktat gibi metabolik atıkları regüle etmek için kullanılabilir.

küçük hacimlerde statik kültürler (1-30 mi), genellikle experime hücre hatları korumak ve ayırt laboratuar ortamında kullanılanntal amaçlar. Hücre pasajı düzenli aralıklarla gerektiğinde komple ortam değişiklikleri ile gerçekleştirilir. En "klasik" kültür ortamı, besin sınırlamalar riski olmadan daha az sık ve orta değişiklikleri sağlamak için, yüksek glukoz konsantrasyonuna (bu çalışmalarda kullanılan DMEM 450 mg / dL) sahiptir. Ancak, bu toplu beslenme yöntemi hala, sık manipülasyon gerektiren hücre ortamında değişkenlik tanıtır ve kontaminasyon 5 riskini artırır - 9. Karıştırılan süspansiyon biyoreaktörler (SSB) daha iyi karışmasını sağlamak ve 3,10 işleme azalmış - 20, ama statik kültürler gibi, besin ve atık ürün düzeylerinde potansiyel zarar verici dalgalanmalar katkıda manuel orta değişiklikler gerektirir. SSB kültürlerin perfüzyon besleme sürekli infüzyon ve orta kaldırılması, fakat hücre büyümesi besin seviyelerindeki büyük değişikliklere göre bu sorunların bir sorun olmaya devam azaltır. düzeltilmiş besleme ra kullanımıTahmini hücre gereksinimlerine göre besin kullanım hesaplamalarından te hücre canlılığını optimize etmek için gerekli kararlı hücre ortamı sağlamak ve 21 işlev görebilir - 24.

25 özel pluripotent hücrelerin kültür ve genişleme için memeli hücrelerinin ölçeklenebilir SSB kültürler için yöntemleri tarif literatür büyük bir gövde var - diğerleri ile 32, adacık (beta) hücreleri 17,33,34 odaklanmış, ya da biyolojik ürünlerin 24 üretim, 35-38. Bu araştırılmıştır hücre tiplerinin bir çok sferoid kültürlerde yetiştirilebilir ve kullanılan hücre tipi için özel prosedürler sürekli bir besleme sisteminin uygulanması öncesinde optimize edilmelidir. 43 - Bu gösteri, bir perfüzyon besleme yöntemi bir karıştıran bioreaktör 39 sferoidler olarak yetiştirilen beta hücre hattı genişletmek için kullanıldı. Bu tarifnamede tarif edilen metod sağlarhedeflenen kültür koşullarını elde etmek için off-line glukoz ölçümlerine dayanarak oranı ayarlamaları beslenme basit uygulama. Bu yöntem ile besleme oranı ayarlama fizyolojik glukoz seviyesi artar, hücre verimleri gösterilir korumak için. Memeli hücreleri, enerji üretimi için, önemli bir besin, glikoz bağlıdır, bu yüzden, bu hücre hattının kullanılması bir çok kültürlenmiş memeli hücrelerine 44 bir modeli temsil etmektedir. Buna ek olarak, bu hat glukoz 45, kronik yüksek düzeyde duyarlı olan beta hücreleri, daha karmaşık örnek teşkil etmektedir. Bu çalışma için, β-TC6 hücreler, in vivo olarak Langerhans adacıklarında ortalama büyüklüğü yaklaşık kültür içinde parçacıklarının oluşturulması için bırakılmıştır. Perfüzyon biyoreaktör sistemi 17 - tüketimi glikoz ayarlanmış bir besleme oranı ile 19,21,46, canlılığı değişiklik olmaksızın, fizyolojik koşullar ve yüksek hücre verimi muhafaza ile sonuçlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Hattı ve Bakım

  1. Elde β-TC6 hücreleri (ya da diğer arzu edilen yapışkan memeli hücre çizgisi). Çalışmanın hazırlık, kültür, geçit ve sağlayıcı talimatlarına göre hücrelerin cryopreserve.

2. Sürekli Besleme Sistemi birleştirin

NOT: - 19,21,47 - 49 aşağıda yöntemi sürekli besleme sistemi tasarımı literatürde 17'de açıklandığı benzer sistemler dayanmaktadır. Burada kullanılan sistemin montaj önceki yayında 3'te detaylı olarak tarif edilmektedir.

  1. orta rezervuar, peristaltik pompa, karıştırılmış biyoreaktör, atık haznesi ve özel olarak tasarlanmış boru / örnekleme seti: beş ana bileşenden oluşmaktadır besleme sistemi için gerekli bileşenleri toplayın.
    1. 1 L'lik bir cam şişe, 2 L'lik bir cam şişe kullanarak atık haznesi ve stirre kullanarak, orta hazne kurulması(Raf sürümü kapalı) 250 ml'lik bir hacim cam reaktörü kullanılarak d biyoreaktör.
    2. orta alışverişini kontrol etmek için 8 kanallı pompa kafası olan bir dijital peristaltik pompa veya benzer pompayı kullanın.
    3. pass-through limanları steril filtreler aracılığıyla havalandırma sağlamak ve rezervuarlar ve Biyoreaktörlerde arasındaki orta transferi için izin vermek için paslanmaz çelik boru ile sert ve otoklavlanabilen plastikten rezervuar ve modifiye biyoreaktör kapaklarını imalatı. Alternatif olarak, çeşitli satıcılardan akış limanları ile özel kapakları satın alın.
      NOT: biyoreaktör kapak isteğe bağlı enstrümantasyon ve izleme sondalar (örn oksijen monitörü) için ek geçiş noktalarını içerebilir.
    4. 40 um ila 60 arasında bir ortalama gözenek boyutu aralığı gözenekli cam havalandırma tüplerden imal edilen bir çıkış borusunu (OT) ve tadil edilmiş SSB kapak% 40 bir gözenek yoğunluğu takın. Alternatif olarak, kültürün belirli ihtiyaçlarına göre başka çıkış borusunu seçin.
      NOT: SeçOT gözenek boyutu (Daha fazla bilgi için bölüm 6 ve yayın 3'te açıklandığı gibi) kültürde hücre agrega bırakarak, sadece orta ve hücre enkaz kaldırmak için.
  2. poliviniliden florür (PVDF) boru konnektörleri ve dayanıklı peristaltik pompa tüp otoklav perfüzyon boru setleri birleştirin. Bölüm uzunluğu bileşenleri arasındaki mesafeye bağlıdır.
    NOT: Uzun süreli deneyler için dayanıklılık ve güvenilirlik sağlamak için boru çeşitli seçerken özel dikkat gösterin.
  3. bir besleme hattı, atık hattı ve örnek bir çizgi: üç bölümden ayarlanır boru monte edin.
    1. İki boru çapları (L / S 14 L / S 13) ile besleme hattını birleştirin. orta hazneye biyoreaktör mesafe span birincil borular için L / S 14 kullanın ve uygun PVDF adaptörleri kullanarak pompa bölümü için boru uzunluğu ortasında / S 13 L kısa bir uzunluğa yerleştirin.
    2. Standart PVDF hortum dikenli Tubi kullanınng adaptörler kısa pompa bölümü (L / S 13) boru her iki tarafında L / S 14 boru, iki parçayı birleştirecek şekilde.
      Not: Alternatif olarak, boru tüm uzunluğu daha küçük çaplı L / S 13 boru olabilir ve pompa bölümü bütünlüğü söz konusu olduğu zaman tüm boru uzunluğu değiştirilebilir.
  4. Daha büyük çaplı (L / S 16) boru kullanılarak atık giderimi için ikinci boru bölümü monte edin ve pompalama bölümü için ortada L / S 14 boru kısa bir bölüm yerleştirin. besleme hattı montaj PVDF hortum dikenli adaptörler kullanarak, ya da alternatif olarak istenen pompa hortumu boyutunun sürekli uzunluğu kullanılarak ve gerektiğinde değiştirilmesi gibi bu aynı şekilde yapılır.
    Not: aynı pompa ve pompa kafa besleme devresinin ve atık devresi için kullanıldığında, atık çıkarma boru hatları, pompa bölümü besleme hattı pompa bölümü daha büyük bir çap olmalıdır. Bu kaldırma pompası oranı besleme hızından daha hızlı olmasını sağlar ve güçlü önlemek olacaktırkültür hacminin büyük değişiklikler ial ve taşma tehlikesini azaltır.
  5. bir örnek toplama düzeneğinin boru setinin son bileşeni bir araya getirin.
    1. Bu prosedür port sistemini örnekleme monte özel bir tarif eder; Seçenek olarak ise, steril bir numune alma noktası çeşitli satıcılardan temin edilebilir.
    2. T-tipi PVDF konnektörü ile birbirine bağlı üç kısa (~ 6 cm) L / S 14 boru uzunlukları ve boru uzunlukları iki iki küçük hortum kelepçeleri gelen set inşa.
    3. kenetlenmiş uzunlukları birine gaz havalandırma için steril bir gaz filtre takın ve diğer steril bir örnekleme şırınga bağlantı için kullanılır (steril gazlı filtreleri gibi birçok steril filtre olmayan sterilizasyon aşağıdaki bir biyo-güvenlik kabini ilave edilmesi gerekebilir otoklavlanabilir).
    4. biyoreaktör kapağına takılı bir paslanmaz çelik numune konnektörüne üçüncü ucunu.
    5. başlamadan önce biyoreaktör bağlıyken örnekleme düzeneğini OtoklavDeney (aşağıda 3. adıma bakın).
    6. sürekli besleme işlemini bozmadan gerektiği gibi biyoreaktör steril numune toplamak için bu derleme kullanın.

3. Otoklav Tüm Malzemeler

  1. otoklav sterilizasyon için tüm biyoreaktör bileşenleri hazırlayın.
  2. sterilizasyon için bileşenleri tek tek topluyoruz. (Adım 2.1.1 monte) Orta ve atık depoları, (2.1.1 monte) 250 ml spinner şişesi, gerekli modifiye kapaklar (2.1.3 monte), (2.1.4 anlatılmıştır) çıkış borusu, üç boru setleri ( ) sürekli beslenmesi için gerektiği gibi bölümlerde 2.2 through2.5), çıkış borusu (monte.
    1. Kapağın üstüne özel monte örnekleme noktasını (bölüm 2.5), ya da diğer örnekleme noktasını tüm bileşenleri ile eğiren şişeyi monte edin ve çıkış borusu sıkıca (bölüm 2.1.4 açıklanmıştır) dönen şişeden içinde takılı olduğundan emin olun, ve eklemek .
    2. oto ile tüm spinner şişesi düzeneğini sarınbandı belirten clave sarma malzemesi ve otoklav. şal ​​Hermetik emin olun. Not: unwrapping ne zaman ve inkübatör içinde tüp setleri olmayan bağlandığında alüminyum folyo veya benzeri bir malzeme konektörü sterilliğinin muhafaza edilmesi amacıyla biyoreaktör kapağın her bir erişim noktası bireysel uçlarını kapatmak için kullanılabilir / biter.
    3. orta ve atık rezervuarların modifiye kapakları monte ve daha sonra ilgili cam şişe eklemek. alüminyum folyo kullanarak bunları Kapak ve bant belirten otoklav.
    4. son montaj yardımcı olmak için otoklav şal ve bant ile - Bireysel boru setleri (2.5 bölüm 2.2) sarın. unwrapping zaman alüminyum folyo veya benzeri malzeme konnektörü steril korumak için ayarlanmış her tüp bireysel uçlarını sarmak için kullanılabilir / biter.
    5. Bir standart kuru otoklav döngüsü kullanılarak sarılarak ürün kapta (örneğin, "ağırlık" ~ 30 dakika ya da daha fazla 121 ° C'de 15 psi ayarlama).
      NOT: Steril takmayınOnlar teyit sürece önce otoklav için filtreler otoklav güvenli olması için.

4. Sfero Oluşumu

NOT: Bu teknik literatürde 17'de tarif edilenlere benzer - diğer memeli hücre kültürlerinin 52 - 19,21,50. sterilizasyon aşağıdaki Tüm prosedürler bir laminer akış kaputu yapılan ve hücre kültürü için steril koşulları sağlamak için steril eldiven kullanılarak yapılmalıdır.

  1. Yeterli hücre miktarları kadar (satıcı tarafından açıklanmıştır) standart yapışık kültürlerinde tüm koşullarda, kültür ve genişletmek β-TC6 hücreler için biyoreaktörler istenilen sayıda tohum elde edilir.
    1. Şekil 1'de gösterildiği ve 2. bölümünde açıklandığı gibi çıkış borusu ile sürekli besleme biyoreaktör monte ve örnekleme kapağına örnekleme noktasına bağlamak. NOT: çıkış borusu ve örnekleme noktası montaj bioreact eklenmelidirsürekli besleme başlayıncaya kadar ya da önceden sferoid oluşumuna sürekli beslenmesi için, kültür ortamının üzerinden yukarı doğru çekilmelidir.
    2. otoklav modifiye SSB derleme sterilize (3. bölümde anlatılmıştır).
    3. dönücü Şişenin kapakları, orta ve atık gemilerin uygun yerlere steril delikleri (0.22 mikron ya da daha küçük steril filtreler) takın.
      Not: Bu buhar kabarcığı önlemek ve inkübatör (% 5 CO2), çevre ve biyoreaktör arasındaki gaz alışverişi sağlamak için önemlidir. Gaz değişimi bikarbonat tamponlu ortam kullanıldığında, doğru pH'ı korumak için gereklidir.
  2. 2 için mekanik çalkalama yardımıyla oda sıcaklığında, (ağ / hac) tripsin 0.53 mM EDTA çözeltisi% 0.25 kullanılarak hafif tripsinizasyon ile hücreleri toplamak - 3 dakika ve yaklaşık 1.3 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta biyo-reaktörlere tohum 200 ml kültür ortamı içinde.
    1. kuluçka belirlenen şişeler Taşı veBio-güvenlik kabininin içine.
      NOT: Tüm hücre kültürü ve manipülasyonlar uygun steril tekniği kullanarak bir Biyo-Güvenlik kabinesinde yapılmalıdır.
    2. aspire şişelerinden alınan kültür ortamı çıkarın.
    3. Şişe içine, (Ca ++, Mg ++ ya da olmadan), fosfat tamponlu tuzlu su içinde 5 ml pipetle ve yüzeyde hücreler boyunca durulama ile hücreler yıkanır, ve daha sonra PBS aspire.
    4. Toplanır, her bir kaba (tipik olarak yaklaşık 10 x 175 cm2 T balonları) için tripsin-EDTA çözeltisi 3 ml ekleyin.
    5. biyo-güvenlik kabini 3 dakika - elde edilen hücrelerin 2, oda sıcaklığında inkübe izin verin.
    6. Şişe yüzey hücreleri gevşetin ve şişeye (serumu) kültür ortamının 6 ml ekleyerek hücreleri toplamak ve 50 ml'lik bir tüp hücreleri aktarmak için elle hafifçe karıştırın. bir 50 ml tüp dolu olduğunda gerekli tüm hücreleri toplanıncaya kadar, başka bir 50 ml tüp kullanmak (yaklaşık bir 50 ml tüp her 5 T-175 matara için gerekli olacaktoplanmış).
    7. Yavaşça santrifüj (yaklaşık 50 x yerçekimi) toplanan hücre süspansiyonları pelet hücreleri.
    8. sağlam pelet bırakarak geri kalan ortam aspire.
    9. Kültür ortamı (serum içeren) pelet yeniden süspansiyon bir pipet kullanılarak ve aynı tüp içine tüm granül aktarılarak tek bir tüp içerisinde hücre toplayın.
    10. Literatürde 53'te tarif edildiği gibi tripan mavi boyama ile standart hemositometre kullanılarak hücre yoğunluğu sayın.
    11. Her durumda (1.3 x 10 6 hücre / ml bu gösteri için hedeflenen başlangıç hücre yoğunlukları idi) için SSB steril toplam hücrelerin istenilen sayıda ekleyin.
    12. (200 mi kültür hacmi bu çalışmalar için kullanılmıştır), istenen toplam kültür hacmi elde etmek üzere, bir pipet kullanılarak SSB (bu durumda fizyolojik aralıkta orta glikoz düzeyleri kullanılan arzu edilen glukoz konsantrasyonu) ortam ekleyin.
      NOT: SSB cu çalışmalar bu sürekli beslenen İçin ltures kültür ortamında (100 mg / dl) bir tadil edilmiş "düşük glukoz" versiyonu ile tohumlanmıştır. Bu kültürler ziyade bir "yüksek glikoz" orta ile başlayan ve glikoz tüketimi besleme başlamak için fizyolojik bir aralığı içine aşağı glikoz düzeyleri getirmek için bekleyen daha arzu edilen hedef glukoz konsantrasyonunda başlatmak için izin. Bu çalışmalarda beslemek için tüm diğer orta standart "yüksek-glukoz" ortamı (500 mg / dl) kullanılır.
    13. bir hücre kültür inkübatörü içinde bir karıştırıcı plaka hücrelerle SSB hareket ettirin.
  3. Sferoidler oluşturulması için izin vermek için,% 5 CO2,% 100 nispi nem ve 70 rpm'lik bir karıştırma hızı ile, 37 ° C 'de 3 gün boyunca besleme olmadan biyo-reaktörlerde kültür hücreleri.
    NOT: Hiçbir önemli bir çoğalma üç günlük sfero oluşumu süresince uyulmalıdır.
  4. sfero oluşumundan sonra, istenen kültür koşulları ile biyoreaktörler arasında parçacıklarının bölün.
le "> 5. Sürekli Besleme Kültür ve Düzeltilmiş Yem Oranı

  1. (- 4 2 adımlar), otoklav veya gaz bileşenlerin tümü sterilize ve steril teknikler kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabini monte edin.
  2. sfero oluşumundan sonra, inkübatör gelen SSB kaldırmak ve biyolojik güvenlik kabini sürekli besleme sistemi bileşenlerini bir araya.
    1. Ilk arzu edilen kültür ortamı ile taze ortam haznesine ve besleme hattının bir tarafına bağlanır. Ayrıca taze ortam deposu doğru steril bir filtre ile havalandırılmış olduğundan emin olun.
    2. steril olarak biyoreaktör besleme giriş ağzına besleme hattının bir tarafı bağlayın. Bir steril filtre besleme hattı ve biyoreaktör girmeden önce orta filtre biyoreaktör giriş portu arasına monte edilmelidir.
    3. biyoreaktör çıkış borusu ve orta atık haznesine atık hattını bağlayın ve atık haznesi düzgün bir steril ile Bacalı emine filtresi.
  3. (Bu muhtemelen gemi ve boru tüm taşımak için iki kişi gerekir) biyolojik güvenlik kabini dışında düzeneğini taşımak ve uzun vadeli kültürü için tüm bileşenleri söndürüldü.
    1. Küremsi oluşumu (37 ° C,% 5 CO2,% 100 nem ve 70 rpm), aynı kültür parametreleri kullanarak inkübatör içinde karıştırıcı plaka üzerine SSB koyun. NOT: çizgiler kapı conta ile yerine dışarı daha inkübatör yan deliklerden çalıştırmak için gereken eğer geçici biyoreaktör gelen boru kesimleri kesmek gerekebilir. Bu alüminyum folyo, otoklavlama öncesi (aşama 3) ile birlikte tüp setleri uçlarının sarma ve biyoreaktör inkübatör içinde olana kadar yem ve atık boru kesimlerinden biyoreaktör yan takmak için bekleyerek aseptik bir şekilde yapılabilir. biyoreaktör tüp hatları yerine konabilir, ve alüminyum folyo kuvöz içinde çıkarılabilir ve hızlı bir şekilde bağlanmış.
    2. dışarı inkübatör erişim noktası üzerinden tüp setleri kalan uçları (biyoreaktör kapağına bağlı olanlar) çalıştırın (içinden-pass), ya da inkübatör kapı contasının bir yarıktan.
    3. (Yakındaki bir biyogüvenlik kabini mümkünse de) kuvöz dışında, hızla taze orta rezervuar besleme hattı ve orta atık deposuna atık hattı bağlayın ve atık haznesi düzgün steril bir filtre ile Bacalı olduğundan emin olun. NOT: aseptik bir şekilde bunu (bu bağlantı biyogüvenlik kabini dışında yapılması gereken özellikle) mümkün olduğunca çabuk ilgili gemilere tüp ve damar konnektörleri alüminyum folyoyu çıkarın ve bağlayın.
    4. Yakındaki mini buzdolabı içinde (istenilen besleme ortamı ile dolu) taze orta rezervuar koyun. yem ve atık hatları inkübatör çıkmak ve kapanış her kapıları engellemeden buzdolabı girmek mümkün olduğundan emin olmak için kontrol edin. Ayrıca, besleme l kritiktirines buzdolabı veya kuvöz birinin kapı tarafından kapatıldı sıkışmak değildir.
      Not: Bu çalışmalar için kullanılan ortam, bu hücre tipi için satıcı tarafından tavsiye edilen standart yüksek glikoz (500 mg / dl) kültür ortamı olmuştur. Herhangi bir yüksek glikoz orta kültüre olan hücre tipi özel ihtiyaçlarına göre kullanılabilir. Besleme ortamının glikoz konsantrasyonu besleme sistemi makul yem oranlarını korurken kültürlerde yeterli glikoz düzeylerini korumak için yüksek glukoz orta besleme hızını artırarak dayanır olarak kültürde istenen konsantrasyona daha makul (2x veya daha fazla) daha yüksek olmalıdır .
    5. Sonraki atık orta rezervuar elverişli bir konumda inkübatör dışında tezgah üstüne konabilir.
    6. Sonraki, besleme hatları SSB taze orta hazneden orta pompa böylece doğru yönlendirmeyi sağlayan pompa kafası içine yem ve atık hatlarının "pompa bölümünü", ve atık hatlarını yerinSSB ve atık orta rezervuar orta pompalayacak.
  4. İstenen besleme hızı pompa açın.
    1. Literatürde 3 ve aşağıda verilen temsili sonuçlar bölümünde açıklanan düzeltilmiş besleme oranı denklemi kullanılarak besleme oranı hesaplayın.
    2. kültüründe arzu edilen glukoz konsantrasyonu elde etmek için gerekli olan yem oranını tahmin etmek için bir büyüme tahmini ile birlikte en son hücre sayısı bilgilerini (aşama 5'te tarif edilen prosedür) ve ortam glukoz ölçümleri kullanın.
      NOT: Hücre büyüme oranları ve glukoz tüketim oranları bu prosedürleri yerine getirmeden önce elde edilmesi gerekecektir.
    3. Hesaplanan besleme oranına göre pompa hızını ayarlama.
  5. (Tarif edilen yöntemle her üç gün) ilerleme hızı hesaplama tekrarlayın ve her örnekleme noktası için pompa hızını ayarlayabilirsiniz.

6. Hücre sayar, Canlılık ve Glikoz Konsantrasyon Ölçümleri

  1. İstenilen her üç gün, ya da her bir biyoreaktör numune toplayın.
  2. Yukarıda açıklanan özel örnekleme bağlantı noktasını kullanarak sürekli beslenen SSB kültürlerinden kültür örnekleri alır.
    1. biyoreaktör içinde sürekli beslenen SSB bırakarak, numune alma noktası un filtreli bağlantı (5 ml hacimli bir şırınga bu çalışmalar için kullanılmıştır) steril bir şırınga ekleyin.
    2. kültür ortamı içine aşağı örnekleme tüpü hareket ettirin.
    3. şırınga gidiyor tüp bölümü çözülme ve istenen toplam örnek hacmi çekilme.
    4. artık kültürde batık şekilde örnekleme borusu yukarı taşımak ve hava kaldırılıncaya kadar şırınga çekmeye devam ediyor.
    5. şırınga besleyen tüp kelepçe ve örnek içeren şırınga ayırmak, ve bir kenara koyun.
    6. hava ile ikinci bir taze steril şırınga ön yük ve örnekleme liman steril filtre tarafına takın.
    7. şırınga filtre tarafına gidiyor tüp çözülmesonra örnekleme noktası ve yavaşça steril filtre içinden şırınga hava atarak örnekleme noktasını temizlemek. Bu numune alma noktası kalıntı ortamın açık olmasını sağlar.
    8. Tüp filtresine gidiş yeniden kelepçe, steril şırınga ayırın ve atın.
  3. kültüründen hücre örneği içeren şırınga alın ve 10 ml'lik bir tüp içine sınırdışı. Bilinen hacimlerin Alt örnekleri bu tüpünden doğrudan alınabilir.
  4. hücre sayımları için, hücre bilinen bir hacmi çıkarın ve mikro santrifüj tüpüne transfer ve yavaşça 1 santrifüj - 2 dakika (yaklaşık 50 x yerçekimi).
  5. glukoz ölçümü için ayrı bir tüp süpernatantı aktarın ve tripsin-EDTA çözeltisi aynı hacimde pelet (% 0.25 (ağ / hac) tripsin, 0.53 mM EDTA) yeniden askıya ve standart bir hemasitometre ile kullanarak üç kere sayısı literatürde 53'te tarif edildiği gibi mavi boya tripan.
    1. orta (serumu) ekleyingerektiğinde seyreltme örneği.
    2. Hücreleri saymak ve canlı (boyasız) hücreleri kaydederek hücre canlılığı hesaplamak ve bağımsız ölü (boyanmış) hücreleri (canlılık% = canlı hücre / toplam hücreler).
  6. Kan şekeri metre ve tek kullanımlık test şeritlerini kullanarak üç nüsha olarak orta glikoz düzeylerini ölçmek.
    1. kan kültür ortamı ikame şekeri ölçüm talimatlarında anlatıldığı gibi glikoz ölçümleri alın.
    2. (Üç çoğaltır tavsiye edilir) (yukarıdaki sayım örneklerinden derlenen) test edilecek orta test şeridi batırın ve çoğaltır istenilen sayıda tekrarlayın.
    3. glukoz konsantrasyonları için taze orta ve atık orta hem de test edin.
      NOT: Bazı metre için, ölçümler daha düşük, 20 mg / dl (metre tespit eşiği), metre üretimde bir hata olarak gözlenebilir.

7. Sfero yerleşmesi Oranı Ölçümleri

  1. Bu cel sağlamakl kümeleri sürekli besleme sistemi tarafından kaldırılmış olan değil, geniş çaplı bir plastik pipet kendi sedimantasyon gözlemleyerek β-TC6 küremsi yerleşme oranını ölçmek.
  2. yukarıda tarif edildiği gibi SSB biyoreaktörlerde Kültür β-TC6 hücreleri sferoidler oluşturulur.
  3. Kültür, 3 gün sonra, 50 ml bir tüp içinde küremsi süspansiyon ve yeri 30 mi örnek alabilir.
  4. Yavaşça pipetlemeyin yukarı ve eşit süspansiyon içinde dağıtmak için geniş çaplı 25 ml pipet kullanarak aşağı, sonra pipet (örneğin, 20 ml işareti) bilinen bir düzeyde süspansiyon ile pipetlenmesini durdurmak ve sferoidler tüm zaman kayıt 5 cm yerleşmek.
  5. İstatistiksel güven ulaşmak için bu prosedürü yeterli kez tekrarlayın (genellikle n> 3).
    Not: Biyolojik çalışmalar için, bir p değeri en az 0,05 ölçümleri karşılaştırırken istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir. ortalamanın standart hatası raporlama hataları için kullanıldı ve iki un-eşleştirilmiş student-t testi kuyrukluSunulan veriler için koşulları mukayese etmek için kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta Glukoz Düzeyleri ve dalgalanmalar Standart SSB Kültürlerde Hücre Genişleme sınırla

Glikoz düzeyleri kültür dönemi 3 boyunca statik kültürler ve SSB kültürlerde dalgalanma. Bu dalgalanmalar, 21 günlük kültür döneminde, hücre sayısı arttıkça yoğunlaştırmak ve statik ve SSB kültürleri hem de hemen hemen aynı idi. Bu gözlemler önceki yayında 3'te sunulmuştur. glikoz düzeyleri her iki yöntem için kültür dönemi süresince süper fizyolojik olabilir. Bu kro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

58 - biyolojik maddelerin ve hücre terapileri için üretimi için memeli hücre üreten ürünlerin büyük ölçüde 55 kültür ve memeli hücreleri izlenmesini gerektirir. Dahası, bu uygulamalar tanımlanmış ve valide kültür koşulları için çağrı. Sadece bu gereksinimleri karşılamak olmaz araştırma teknolojilerini kullanarak hücrelerin hacminin artırılması. besin ve atık ürünlerin birikimi dalgalanmalara yol açması, Manuel ortam değişiklikleri hücre kalitesi, canlılığı ve verimi azaltır. Biyoreaktör ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, yararlı yorumları için Michael Garwood ve Sam Stein'a ve el yazması hazırlama konusundaki yardımları için Kristen M. Maynard'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
β TC-6 HücreleriATCC, Manassas, VACRL-11506Fare İnsülinoma hücre hattı (yapışık hücre tipi)
DPBS Ca Yok, Mgİnvitrojen Yok, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dulbecco'nun Modifiye Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAÜrün numaraları için aşağıya bakın 
DMEM Yüksek Glikoz (500 mM)Canlandırıcı, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM Düşük Glikoz (100 mM)Canlandırıcı, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (bu ortamın zaten piruvat içerdiğini unutmayın)
L-glutaminInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=arama-ürün
Sodyum PiruvatInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
Isı ile İnaktive Edilmiş Domuz SerumuGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Tripsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=arama-ürün
T-150 Doku Kültürü İşlem Görmüş ŞişelerCorning, Corning, NY430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Yaşam Bilimleri)
& categoryname=
NuAire Hücre kültürü inkübatörüPrinceton, MNUS Autoflow. Herhangi bir su ceketli CO2< / sub> düzenleyici hücre kültürü inkübatörü kullanılabilir.
SantrifüjSorvall RT 7 (Herhangi bir benzer tezgah üstü santrifüj kullanılabilir)
BuzdolabıHerhangi bir laboratuvar buzdolabı kullanılabilir (bu çalışmalar için küçük bir masa üstü versiyonu kullanılmıştır)
1 L Cam ŞişeCorning, Corning, NY1395-1LHerhangi bir satıcı kullanılabilir. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Yaşam Bilimleri)
& categoryname=
2 L Cam ŞişeCorning, Corning, NY1395-2LHerhangi bir satıcı
250 ml karıştırılmış biyoreaktör kullanılabilir Corning, Corning, NY4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Yaşam Bilimleri)
& categoryname=
Karıştırma PlakasıFisher Scientific11-496-104AHerhangi bir inkübatör güvenli karıştırma plakası kullanılabilir, herhangi bir satıcı
Doku Kültürü Kapları 100 mm ÇapNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 Herhangi bir satıcı kullanılabilir (Fisher Sci aracılığıyla sipariş edilir)
FALCON 50 ml Konik TüplerFalcon, San Jose, CA1256598Herhangi bir satıcı kullanılabilir
Özel Parçalar için Kullanılan Delran PlastikMcMaster CarrÇeşitliTercih edilen herhangi bir malzeme kullanılabilir, ancak Deran otoklav güvenli, reaktif olmayan ve işlenmesi kolay olduğu için seçilmiştir. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Özel kapaklar için Paslanmaz Çelik BoruMcMasterCarr ÇeşitliHerhangi bir satıcı kullanılabilir. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Sürekli Besleme için Özel Modifiye Delran Biyoreaktör KapaklarıÖzel yapımBenzer bir ürün üreten herhangi bir satıcıdan haberdar değilim
Sürekli besleme için Özel Modifiye Cam Şişe KapaklarıÖzel yapımBazı satıcılar (örn., Fischer Sci, Corning) aşağıdaki bağlantılarda benzer ürünler üretmektedir.
Masterflex Dijital Peristaltik PompaCole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25Herhangi bir hassas peristaltik pompa kullanılabilir. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
PVDF Boru Konnektörleri (çeşitli)Cole Parmer, Vernon Hills, ILbağlantıya bakınHerhangi bir satıcı kullanılabilir. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Pharmed BPT Boru L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16Herhangi bir satıcı kullanılabilir. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Silahlı BPT Borusu L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Herhangi bir satıcı kullanılabilir. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Silahlı BPT Borusu L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Herhangi bir satıcı kullanılabilir. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Millipore Millex GP PES membranı 0.22 & # 181; l steril şırınga filtresi (havalandırma ve orta filtrasyon için kullanılır)Fisher ScientificSLGP033RSHerhangi bir satıcı kullanılabilir
25 ml Dereceli PipetFisher Scientific13-678-11Herhangi bir satıcı kullanılabilir ve çeşitli boyutlar kullanılabilir
PipetleyiciFisher Scientific13-681-15EHerhangi bir satıcı veya benzer ürün kullanılabilir
HemositometreFisher Scientific02-671-6Herhangi bir satıcı veya benzer ürün kullanılabilir
Trypan BlueGibco - Yaşam Teknolojileri15250-061Herhangi bir satıcı veya benzer ürün kullanılabilir. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
Ters Işık MikroskobuLeicaHerhangi bir satıcı veya benzer ürün kullanılabilir
Tek Dokunuşla Ultra Kan Şekeri ÖlçümCihazı Fisher Scientific22-029-293Herhangi bir satıcı veya benzer ürün kullanılabilir (örn., Bayer)
Tek Dokunuşla Ultra ŞeritlerFisher Scientific22-029-292 Herhangi bir satıcı veya benzer ürün kullanılabilir (örn., Bayer)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
  2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
  3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611(2013).
  4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
  5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
  6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
  7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
  8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
  9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
  10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
  11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
  13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
  14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
  15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
  17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
  18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
  19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
  20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
  21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
  22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
  23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
  24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
  25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
  26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
  27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
  28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
  30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
  31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
  33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
  34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
  35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
  36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
  37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
  38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
  39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
  40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
  42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
  43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
  46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
  47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
  48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
  49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
  50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
  51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
  52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
  53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262(2007).
  54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
  55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
  56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
  57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
  58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
  59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
  60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
  61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
  62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
  63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Memeli H cre Geni letmeSferoid K lt rPeristaltik PompaKar t rmal Biyoreakt rGlukoz zlemeBesleme H z AyarlamasH cre Verimini Art rmaSteril rnekleme

İlgili makaleler