Yöntem makalesi

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

16.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52227

⸱

30 Kasım 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Daha fazla analiz için çeşitli bileşenler elde etmek üzere tam kanın işlenmesi için bir metodolojinin ana hatlarını çiziyoruz. Klinik olmayan bir ortamda tam kan örneklerinin hızlı, yüksek verimli eş zamanlı işlenmesini sağlayan kolaylaştırılmış bir protokolü optimize ettik.

Özet

Olmayan bir klinik ortamda toplanması ve tam kan örneklerinin işlenmesi ve önceden var olan koşullar olmaksızın, hem toplum içinde yaşayan bireylerin değerlendirmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bu örneklerin hızlı işlenmesi önemli hücresel bileşenlerin bozulmasını önlemek için önemlidir. Eş zamanlı periferik kan mononükleer hücre (PBMC), DNA yöntemleri burada Dahil, RNA ve işleme ile bir metropol boyunca katılımcılara rıza evlerinde yapılan tek bir kan beraberlik serum izolasyonu, toplama 2 saat içinde başlamıştır. Biz 1600 üzerinde kan örnekleri sonradan başarılı DNA metilasyonu, genotipleme, gen ifadesinde kullanılan ve akış sitometri analizleri olmuştur verimli tutarlı, yüksek kaliteli malzeme, işlemek için bu teknikleri kullandık. Kullanılan yöntemlerden bazıları standart; tarif edildiği şekilde bir araya getirildiğinde, ancak, bunlar popülasyon ve / veya Topluma katılımcı örnekler etkili olarak işlenmesini sağlarNormalde bir klinik ortamda değerlendirilecek olmaz dayalı çalışmalar. Bu nedenle, bu protokol, genel nüfusun temsilcisi (ve buna bağlı veriler) örnekleri elde etmek için bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Birden fazla çalışmalar ve zihinsel (veya diğer) 1-4 Hastalıkları olmadan bireyler arasında kanda gen ifadesinin, DNA metilasyonu ve hücre alt kümesi farklılıkları nitelendirmiştir. Ancak bu çalışmalar, hastalıkla ilişkili farklar, hastaların tedaviye arayan olan hastalıkların genellikle daha ağır olmaları büyütülür olabilecek olan klinik elde edilmiştir. Nedeniyle "omik" yaklaşımlara gelişmeler, geçmiş on hastalık prevalansının toplum tabanlı tahminleri sağlamak amacıyla, topluluk ve / veya epidemiyolojik ayarlarından 5-7 den biyolojik numune alma ilgi bir patlama ve daha geniş bir resim gördü Bu zihinsel ve / veya bedensel hastalıkların çevresel belirleyicileri.

Bu bağlamda önemli bir zorluk toplanan numunelerin hızlı işlem için bir gerekliliktir. Tek-çekirdekli hücreleri, frequentl anahtar bağışıklık sistemi bileşenlerinin Parçalanmay, bir bireyin sağlık, toplama 8-10 2 saat sonra geri kazanım önemli bir azalma ile birlikte kan alımı üzerine hemen başlar değerlendirmek için kullanılan. Bu zorluğu gidermek için, insan tam kan birden fazla bileşen aynı anda büyük bir metropol bölgesinde yaşayan deneklerin evlerine elde edilen örneklerden izole edildiği optimize edilmiş bir protokol mevcut. Protokolü derlenmesi ve gelecek teknikler daha izolasyonu için izin halinde tüm "ekstra" fraksiyonların depolama dahil olmak üzere güncel teknikler, modifikasyonu üzerine kuruludur / analiz eder. Alternatif yöntemler veya kitleri burada açıklanan bireysel yöntemlerle, bu ana hatları yerine kullanılabilir ise bir yüksek verimli bir şekilde numune işleme için güvenilir ve etkili bir yol olduğu kanıtlanmıştır. Yüksek kaliteli parçalar (PBMC, DNA serumu ve RNA) taze kan, 2 gün (Şekil 1 içinde mevcut olabilir 2 toplama saat ve deney için hazır numuneler içinde üretilebilir).

Bu protokol toplum konut, Detroit Mahalle Sağlık Çalışmasında test için Detroit kentinin yetişkin sakinleri alınan örneklerin verimli işlenmesini sağlamak için geliştirilmiştir (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), bir toplum tabanlı post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) ve diğer ruhsal hastalıkların sosyal ve biyolojik belirleyicileri çalışma. Detroit TSSB yaygınlığı iki ulusal ortalamanın 11,12 daha fazladır. Bu popülasyonda TSSB biyolojik belirleyicileri belirlenmesi, bu kentsel nüfus ve diğer yüksek risk gruplarında (örneğin, askeri gazileri dönen), hem bozukluktan muzdarip olanlar yardım etmek uygun farmakolojik ve / veya bilişsel-davranışçı müdahaleler geliştirmek için yardımcı olabilir. Daha önce Detroit, Michigan Wayne State Üniversitesi'nde bulunan Laboratuvarımız, çeşitli türetilen taze doku örnekleri ele bizim uzmanlık dayalı işlenmesine için seçildikaynakların, gerekliliği toplama 2 saat içinde numune işleme başlamak için, ve tahsilat sitelere bizim yakınlık. Ancak bu eşsiz fırsat, hedefimiz her örnekten DNA, RNA, serum ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) büyük verim (örnek toplama 5 dalgaların üzerinde N = 1639 numunelerin toplam) için işleme optimize etmek oldu. Burada özetlenen işlemler dolayısıyla mikrodizide epigenetik, gerçek zamanlı RT-PCR dahil aşağı uygulamaların çok sayıda için malzeme (ortalama verim için bakınız Tablo 1) başlangıç ​​üreten bir klinik olmayan bir ortamda eş zamanlı olarak gerçekleştirilen ve analizler akım sitometri edilebilir.

figure-introduction-1
Şekil 1. Genel iş akışı. Burada gösterilen genel işlem rıza partic belirlenmesi kan örnekleri elde lojistik içerirkan ipants kendisini çizin. Yüksek kaliteli, fraksiyonlar (periferal kan tek-çekirdekli hücreleri PBMC DNA, serum, ve RNA), taze tam kan toplama 2 saat içinde üretilebilir ve deney için hazır numuneleri 2 gün içinde mevcut olabilir. Örnekler hemen test edilmesi değildir Dahası, bu metod ile hazırlanan fraksiyonlar, uzun süreli depolama için uygundurlar. Burada özetlenen tüm zaman çizelgesi tek bir gün (~ 5 saat toplam) tamamlanmış olabilir. Bununla birlikte, böyle bir gün, özellikle teknikleriyle büyük deneyim ile tek bir teknisyen için son derece emek-yoğun olacaktır. Böylece, en az iki teknisyen arasındaki Gün 1 prosedürleri bölünmesi ve Gün 2. RNA işleme tamamlayarak tavsiye bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Detroit Mahalle Sağlığı Çalışması inceledim ve Michigan Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm katılımcılar önce çalışmaya katılımları için aydınlatılmış onam koşuluyla.

1. Genel

  1. Düzgün son nokta verilerinin analizi yoluyla işe gelen tüm aşamaları belge. Aşamaları anahtarlama ve zaman izni örtüşen, aynı zamanda Gün 1 protokolleri uygulayın. Aşamaların sırası performans verimliliğini optimize yazılır. 1 sürecin genel bir bakış sağlar Şekil.
    Not: Terim, "katılımcı" bir rıza birey çekilen de tanımlanan kan örneği belirtmek için boyunca kullanılır. Parantez içindeki kere aşağıda eller zaman gösterir. Izleme levha ve numune günlüğü örnekleri sırasıyla ek Tablolar S1 ve S2 bulunabilir. Numuneler evlerde Phlebotomists tarafından toplanan(daha fazla ön-işleme detayları için Ek Bilgiler (SI bakınız) 1) kurye ile çalışma koordinatörü katılımcıları rızasıyla ve laboratuara taşınan olarak tanımlanan kişilerin.

2. Gün 1 Kur

  1. 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
  2. 56 ºC ısı bloğu önceden ısıtın.
  3. Günün teslimatları (katılımcı başına 2) için mikrosantrifüj tüplerin uygun sayıda içine 20 ul aliquoting ile proteazı (SI 2 bakınız) hazırlayın.
  4. Gerekirse, etikette belirtilen% 100 etanol eklenerek, tampon AW1 ve AW2 (DNA saflığını artırmak DNA izolasyon kiti sağlanan yıkama tamponları) kullanıma hazır olduğundan emin olun.
  5. 4 ° C'ye kadar buzdolabında soğutun santrifüj.
  6. Transfer spi üstündeki vida kapağını istinat sağlanan lastik septum kapaklı 1x PBS şişesinin kapağını takın ve bir transfer başak ile lastik septum delmekke buharlaşmasını önlemek için. RNA stabilizasyonu çözeltisinin şişe ile tekrarlayın.
  7. Tamponlar, santrifüj ve ısı bloğu hazırlanması sonrasında, örnek izleme kağıda vacutainer teslimat süresi belge (Tablo SI bakınız).

3. Gün 1: DNA PBMC'ler ve Lökosit RNA Processing, tam kan örneği (2 saat)

  1. Genel
    1. Kan beraberlik ve işleme başlama zamanı arasındaki gecikmeyi en aza indirmek için yeterli zaman tahsis. Kırmızı kan hücresi kontaminasyon artış ve mononükleer hücre kurtarma azalma önlemek için kan beraberlik 2 saat içinde Ficoll içeren vacutainers işleme başlayın.
    2. Ficoll jel degrade içeren 2 vacutainers, 2 K 2 Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) vacutainers ve yetişkin katılımcı başına 1 serum vacutainer koleksiyonu varsayalım. Laboratuvara vacutainers teslimi üzerine, bir teknisyen örneklerinin izleme levha simgeleyen kabul imzalamak zorunda. Dilenmekörnek günlüğünde bir vacutainer bazında belgelenmiş başlangıç ​​zamanı ile hemen işleme.
  2. Serum İzolasyon Aşama 1 (1 dakika)
    1. Örnek günlüğünde başlangıç ​​saatini Belge (Tablo SI 2). Santrifüj aerosol kapakları ile sallanan bir kova rotor kullanarak (katılımcı başına 1) 7.0 ml serum (kırmızı) vacutainer (fren ve hızlanma OFF) (biyogüvenlik seviye 2; BSL2 onaylı) 20 dakika, 1300 xg, 4 ºC için.
  3. DNA İzolasyon Aşama 1 (15 dakika)
    Not: Bu izolasyon prosedürü ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için, üreticinin protokolü 13 bkz.
    1. Başlama zamanını belgeleyin. Bir BSL2 hücre kültürü kaputu, daha sonra proteaz iki 20 ul alikotları (katılımcı başına 400 ul toplam) her birinin içine vacutainers birinin üstünden tam kan 200 ul ekleyin Ficoll jele 5 kez içeren Vacutainers ters çevirin. Kaputu proteaz + kan mikrosantrifüj tüpleri bırakarak, merkezkaç devamAşama 3.4.1 Vacutainers içeren Ficoll fugation.
      Not: akılda adım 3.4.1 yılında Vacutainers dönerken (yani, iki vacutainers her birinden 200 ul kaldırmak için gerekli olabilir) santrifüj dengeleme gerekliliği tutarak, en büyük toplama hacmine sahip vacutainer kullanın. Buna ek olarak, mavi vacutainers işlenmesi sırasında uygun bir ayrılma sağlanırken, vacutainer kalan kan seviyesi Ficoll katman üzerinde en az 2.5 inç olmamalıdır.
  4. PBMC izole edilmesi Aşama 1 (1 dakika)
    1. Başlangıç ​​saatini Belge vacutainers 8-10 kez içeren Ficoll .Invert (kırmızı kan hücresi kontaminasyon artış ve mononükleer hücre kurtarma azalma önlemek için kan beraberlik 2 saat içinde olmalıdır). (Fren ve hızlanma OFF) Santrifüj 30 dakika, 1600 xg, 22 ° C için aerosol kapakları (BSL2 sertifikalı) ile sallanan bir kova rotor kullanarak vacutainers (katılımcı başına 2).
  5. DNA İzolasyonu Aşama 2 (20 dk)
    1. Kaputun dönün ve proteaz + kan mikrosantrifüj tüpleri (adım 3.3.1) her birine 200 ul Tampon AL ekleyin. Cap, kaput gelen girdap 15 sn ve flaş sıkma çıkarın.
    2. Bir ısı bloğu 56 ºC, 10 dakika inkübe edin.
    3. Isı bloğu tüpleri çıkarın. Flaş sıkma. BSL2 kaputu geri dönün. 200 ul% 100 etanol ekleyin. Cap, kaput gelen girdap 15 sn ve flaş sıkma çıkarın. Geri kalan aşamalar, başlık dışına tamamlanabilir.
    4. Lisatı uygulayın (2 ml toplama tüpü) etiketli döndürme kolonuna (adım 3.5.3 30 dakika içinde). Aerosoller yoluyla çapraz kontaminasyonu engellemek için kapağı kapatın. Santrifüj 6000 xg, 1 dak.
    5. Filtratı içeren koleksiyon tüp atın ve yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin.
    6. , Jantı nemlendirme olmadan sütun 500 ul Tampon Aw1 ekle kapağını kapatın ve santrifüj 6000 xg, 1 dak.
    7. Filtre içeren koleksiyon tüpü atınte yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin ve.
    8. , Jantı nemlendirme olmadan sütun 500 ul Tampon Aw2 ekle kapağını kapatın ve santrifüj 20.000 xg, 3 dk.
    9. Filtratı içeren koleksiyon tüp atın ve yeni bir 1.5 ml toplama tüpü (değil kitine dahil) spin kolon yerleştirin ve santrifüj 20.000 xg, 1 dak.
    10. Filtratı içeren koleksiyon tüp atın ve yeni bir 1.5 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin (kitine dahil değildir).
    11. Her bir sütun 200 ul Tampon AE ya da su ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Santrifüj 6000 xg, 1 dak.
    12. Aynı toplama tüpüne akıtılarak adımı yineleyin 3.5.11.
    13. Katılımcı başına 2 sütun yıkandı DNA Havuz. Katılımcı başına toplam verim ~ 800 ul.
    14. Zaman verdiği zaman bir spektrofotometre kullanılarak örnekleri ölçmek.
    15. Specime her konsantrasyonu belgeleyen, 2 ml cryovials içine istediğiniz gibi Kısım DNAn günlüğü. Aktarım uzun süreli depolama için -80 ° C'da bir cryobox ve yeri cryovials. Dondurucu başlangıç ​​zamanını belgeleyin.
  6. Lökosit RNA İzolasyon Aşama 1 (30 dakika)
    Not: Biyogüvenlik Seviye 2 sertifikalı hücre kültürü kaputu gerçekleştirin. Bu izolasyon hakkında daha fazla bilgi için üreticinin talimatlarına 15'e bakın.
    1. Bir transfer başak K 2 EDTA vacutainer lastik septum delmek. Kılıfı saklayın ve adım 3.6.11 kullanılmak üzere kapağı vidalı. BSL2 standart uygulamaları takiben, kanla bulaşan patojenlere maruz kalmaktan kaçınmak için özen gösterin.
    2. Transfer başak üstüne beyaz slip konnektörünü bağlayın.
    3. Beyaz slip konnektörüne filtrenin giriş (alevlendi sonu) bağlayın, sonra gelen katılımcı kimliği ile filtreyi etiketleyin.
    4. Filtrenin çıkış (konik ucuna) bir kılıflı 25⅝ G iğne takın. Teslimattan önce filtre düzeneği önemli ve bu nedenle süreci hızlandırır hazırlanması,Filtreyi, ardından kılıflı iğne ekleme ve kullanılana kadar bir kültür tüp rafa montajını ayarlama, transfer başak beyaz slip bir bağlantının, tavsiye edilir.
    5. K 2 EDTA tüp sisteminin montajı takiben, güvenli (metal spatula sonuna kullanın) iğne kınından. Boş 10 ml tahliye kan toplama tüpüne (serum alıcı tüp) içine iğne bıçak ve K 2 EDTA vacutainer / filtre / alıcı tüp ters çevirin. BSL2 standart uygulamaları takiben, kanla bulaşan patojenlere maruz kalmaktan kaçınmak için özen gösterin.
    6. Filtrenin kama biçimli bölümler kan ayrılana kadar kan akmasına izin verin. Filtrasyon, yaklaşık 2 dakika sürer ve süzme sırasında test tüpü raf yerleştirilebilir.
    7. Aksamından filtreyi kaldırmak. Filtratı içeren tüp içinde iğne bırakın ve bir Sharps kapta tüm montaj atın.
    8. Içinde, 1x PBS şişe transfer başak bir 5 ml şırınga takınşişe vert ve 3 ml çıkarın.
    9. (3-5 saniyede damla) filtrenin girişine PBS ile şırınga takın ve filtreyi yıkayın. Akış yoluyla biyolojik çöp bidonuna toplayın. Dalgıç geri çekilmeden filtreden şırınga ayırın.
    10. Süzme ve bir PBS yıkama sonrasında, yeni bir 5 ml şırınga ve aşama 3.6.8 tarif edilen yöntem kullanılarak, RNA stabilizasyonu madde 3 ml çıkarın. Adım 3.6.9 deki gibi filtreyi temizleyin. RNA stabilizasyonu ajan filtre üzerinde kalmalıdır. Dalgıç geri çekilmeden filtreden şırınga ayırın.
    11. RNA stabilizasyon maddesi ile doymuş filtreyi bırakarak aktarma başak korudu kılıf ve vidalı kapaklı filtre giriş ve çıkışını kapatın. Filtre bu noktada saklanabilir. Madde 5.4.7'de için 5.3 adımları tamamlamak için zaman izin kadar -80 ºC (~ 2 saat) filtreyi saklayın.
      Not: toplandıktan sonra bir yıl kadar -80 ° C'de saklanan Filtreler düflüfl olmadan işlendiktenRNA kalitesi se.
  7. PBMC İzolasyon Aşama 2 (30 dk)
    1. Santrifüj (adım 3.4.1) den Ficoll içeren Vacutainers çıkarın ve BSL2 kaput devam ediyor. Vacutainers Şekil 2'deki gibi ayırma göstermelidir., Tablo 2 ye bakınız değilse.
    2. Vacutainer BSL2 kaputu iade edildikten sonra, tıpa kaldırmak ve mononükleer (net / beyaz) tabakasına yakın almadan serolojik bir pipet kullanarak üst, sarımsı, plazma tabakası (Şekil 2) 1.5 ml çekin. (- 1 katılımcı 2 vacutainers gelen Havuz -) cryovial 5 ml plazma aktarın. Toplanan Sesi açın. Depolama talimatları için adım 3.7.6 bakın.
      Not: En iyi ayırma ve en büyük PBMC verimleri önce kan toplama en az 12 saat oruç katılımcılar geliyor.
    3. U - Kalan plazma ve beyazımsı, mononükleer katman (Şekil 2 jel tabakası üzerinde her şeyi) aktarıntek konik tüp içine katılımcı başına Vacutainers içeren iki Ficoll her birinden tek çekirdekli katmanı havuzu, 15 ml konik tüp, serolojik bir pipet şarkı.
    4. 15 ml konik tüp toplam hacmi getirmek için 1x PBS ekleyin. Cap tüpü ve invert 5 kez. 15 dk, 300 xg, 22 ° C (fren ve hızlanma OFF) Santrifüj.
    5. Kaput Ficoll içeren vacutainers dönün ve çevresinde girdap ve Ficoll jel tabakası dışında gevşetin ve mümkünse kaldırmak için 5¾ "Pasteur pipet kullanarak kırmızı kan hücreleri (eritrositler) toplamak. Toplamak ve cryovial 5 ml eritrositlerde (~ 4.5 mi) aktarmak için bir serolojik pipetlemeyin kullanın. Toplanan Sesi açın.
    6. Hızı kontrollü dondurma kabına (adım 3.7.5 plazmayı aşama 3.7.2 ve eritrositlerde) hem de 5 mi cryovials aktarın ve bir cryobox aktarılır ve geri döndürülebilir, bu süreden sonra, en az 24 saat boyunca -80 ° C'de koymak Uzun süreli depolama için -80 ºC.
    7. Co Dönüşadım 3.7.4 yılında santrifüj tamamlanır ve pelet bozmadan PBS tüm ama ~ 500 ul aspire başlık için nical tüp. PBS ~ 200 ul, bu aşamada pelet yukarıda bırakılırsa PBMC verimi daha yüksektir.
    8. 10 ml hacim getirmek için taze 1x PBS ekleyin. Nazikçe pelletini. Cap tüpü ve invert 5 kez. 10 dk, 300 xg, 22 ° C (fren ve hızlanma OFF) Santrifüj.
  8. Serum İzolasyon Aşama 2 (10 dakika)
    Not: Bir BSL2 kaputu gerçekleştirin.
    1. Istediğiniz gibi 2 ml cryovials içine santrifüj (adım 3.2.1) Aşağıdaki serum vacutainer üst serum katmanını alikotu. Tipik verim 2,5 ml (Tablo 1). Sesi açın. Örneğin, cryovial 1 içine 200 ul aliquoting 4 cryovials, cryovial 2 içine 1000 ul kullanın ve sonra cryovials 3 ve 4 Kalan bölün.
    2. Uzun süreli depolama için -80 ºC bir cryobox ve yere cryovials aktarın. Dondurucu başlangıç ​​Belgezaman.
  9. PBMC İzolasyon Aşama 3 (15 dk)
    1. Pelet rahatsız etmeden, mümkün olduğu kadar süpernatant / PBS olarak santrifüj (adım 3.7.8) ve aspirat sonra, kaputun dönün. Orta 1 Dondurma 2,5 mi PBMC içinde pipetleme ile yeniden süspanse pelet (SI 2).
    2. Adım 3.9.1 hücre / orta çözümün Orta 2 (SI 2 bakınız) Donma 2.5 ml PBMC ekleyin. Vortex hafifçe.
    3. Kısım 0.65 ml mikrosantrifüj tüpü içine hücre çözeltisi 10 ul (daha fazla seyreltme gerekli olabilir). 0.65 ml mikrosantrifüj tüp içine% 0.4 tripan mavisi leke 10 ul ekleyin ve birkaç kez pipetleme karıştırın. Daha fazla detay üreticinin kılavuzuna 16 bakınız.
    4. Pipet karıştırma 3 dakika içinde hücre sayıcı içine odası slayt ve yer slayt sayma bir hücreye karışımı 10 ul. Yakınlaştırmak ve hücreleri odaklanır. PBMC saymak elde etmek için "Count Hücreleri" basın.
    5. Kısım, uygulanabilir iseCryovials aktarın ve 3.9.9: adım olarak PBMC numarası mililitrede 3.000.000 hücreleri (mc / ml) üzerindedir. En az 3 mc / ml her biri bir konsantrasyonda en fazla 5 cryovials saklayın PBMC'ler.
    6. Canlı PBMC 3 numaralı mc altında ise / ml, 5 ml canlı mc / ml çarpılarak toplam hücre sayısını hesaplamak. 3 mc / ml, en az bir boru olacak şekilde 4, 3, 2 ya da 1 ml bu sayı bölün.
    7. Santrifüj 300 xg (fren ve hızlanma KAPALI) 5 dakika hücreler / donma orta çözeltisi içeren konik tüp. Santrifüj işleminden sonra, (4, 3, 2 veya 1 ml), yukarıda hesaplanan hacim bırakarak dondurma ortamı (süpernatan) uygun hacimde aspire.
    8. Cryovial / 1 ml cryovials (1-4), uygun sayıda içine kalan süpernatan pelet ve kısım, en az 3 mc / ml yeniden süspanse edin. Nihai dondurma orta,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) /% 20 Fetal Bovine Serum (FBS) /% 70 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Belge komutunucryovial başına hücre sayımı KBB. Kontrollü bir oran dondurma kaba cryovials aktarın ve cryovials bir cryobox aktarıldı ve uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankı (buhar fazlı) koymak olabilir bu süreden sonra en az 24 saat süreyle -80 ° C'de koydu. Belge dondurucu başlama saati.

4. Gün 2 Kur

  1. Isı bloğu 80 ° C'ye kadar, bir nükleaz içermeyen bir tüp içinde nükleaz serbest 0,1 mM EDTA bir kısım (filtre başına 220 ul) ısıtın.
  2. Yıkama çözeltileri 1 ve 2 (SI 2 bakınız) hazırlayın.

5. Gün 2: Uzun Vadeli Örnek Depolama ve lökosit Filtre İşleme (3 saat)

  1. Bakış.
    1. Filtreye lökositlerin uygulamasının 6 ay içinde bu yordamı gerçekleştirin.
      Not: Genel olarak, 2. Gün işlem yaklaşık 3 saat sürer ve etiketli ise "Gün 2," anahtar gereksinim filtre işleme kısmı bir gün ne zaman yapılmalıdır kiLaboratuvarda meydana gelen hiçbir Gün 1 işlem yoktur.
  2. Uzun vadeli numune saklama (15 dk)
    1. Önce Gün 1 işlenmek üzere laboratuara yeni vacutainers teslimine, her gün bu yordamı gerçekleştirin. Uygun şekilde etiketlenmiş cryoboxes içine Gün 1 kontrollü hız donma kaplarda O / N saklandı cryovials aktarın ve uzun süreli saklama için -80 ºC veya sıvı azot (buhar fazı) bunları iade edin. Son nokta deneyleri için izleme örnek konumunu hızlandırmak için numune türü (örneğin, DNA, PBMC, RBCs, vb) dayalı cryovials düzenleyin.
  3. Lökosit RNA Filtreler İşleme (45 dakika).
    Not: Bu yordam hakkında daha fazla bilgi üreticinin talimatlarına 17 için bkz.
    1. RT Filtreyi getirin (yaklaşık 5 dakika çözülme).
    2. Kılıfını çıkarın ve filtreden kapağını kapatın. Piston bastırın, 5 ml şırınga pistonu geri çekin ve filtrenin girişine (alevlendi sonu) bağlayınRNA stabilizasyon ajanı sınırdışı biyolojik atık kabına filtre limanlarından.
    3. Etiketli bir 15 ml konik bir tüp içinde lizat toplanması, filtre boyunca olan çözelti temizlemek için piston bastırın, RNA izolasyonu için bir fenol ve guanidin izotiyosiyanat çözeltisi 4 ml yeni 5 ml şırınga yükleyin ve filtrenin girişine ekleyin (katılımcı başına 2).
    4. , Dalgıç geri, filtreden şırınga çıkarın filtresine yeniden takmak ve aynı 15 ml konik tüp içine filtre disk sıkışıp kalan numuneyi sınırdışı piston bastırın. Filtreyi ve şırınga atın.
    5. , Konik tüp 800 ul BCP ekle tüpü sıkıca kapatın ve şiddetle 30 saniye için hazırlık sallayın.
    6. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 2000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
    7. Taze etiketli 15 ml konik tüp (~ 2.5 mi) sulu (üst) fazı aktarın.
    8. Nükleaz içermeyen suyun sulu fazının 0,5 kat büyük bir hacim eklemeiyice karıştırın d. Daha sonra% 100 etanol içinde sulu hacme 1.25x ilave edin ve tekrar kanştınn.
      Not: 2,5 ml sulu hacim için, nükleaz içermeyen su 1.25 ml ilave karıştırın, daha sonra 4,7 ml% 100 etanol (2.5 ml x 0,5 = SONRA 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 mi, yeni su hacmi 1.25 ml nükleaz serbest su ilave SONRA 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml% 100 etanol). Bu adım, küçük RNA fraksiyonu içeren tüm RNA izolasyonuna izin verir. Izolasyondan küçük RNA'lar atlamak için bir yöntem kılavuzu 17 bulunabilir.
    9. 5 ml şırınga pistonu çıkarın ve yerine spin kartuşu takın. Bir vakum manifolduna kartuş / şırınga takımını takın. Dipli bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kesti içindeki vakum manifolduna daha güvenli bağlantı için, kartuş / şırınga takımını yerleştirin.
    10. Bu kartuşun içinden çekilir dikkatle fazla örneği ekleyerek, üzerinde vakum ile yavaş yavaş sıkma kartuşunun adım 5.3.8 numuneyi uygulayın.
      Not: Vakum iseMevcut, http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf de santrifüj yöntemine bakın.
    11. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Spin kartuşunu aktarın ve Yıkama 1. Santrifüj spin kartuşu / tüp düzeneği 5 750 ul ekleyin - 12,000 x g 10 sn.
    12. Tüpten Filtratı atın ve aynı mikrosantrifüj tüp Spin kartuşunu geri dönün.
    13. 12,000 x g'da 10 saniye - 5 yıkama 2 ve santrifüj sıkma kartuşu / tüp 750 ul ekle. Adım 5.3.12 gibi süzüntü atın. Aynı mikrosantrifüj tüpüne spin kartuşunu geri dönün.
    14. Adım 5.3.13 gibi Wash 2 ve santrifüj başka 750 ul tekrarlayın. Atın Süzüntü. Aynı mikrosantrifüj tüpüne spin kartuşunu geri dönün. Filtreyi kuru 1 dakika süreyle maksimum hızda sıkma kartuş / tüp santrifüj.
    15. Taze spin kartuşunu aktarın, 1.5 ul ependorf tüp etiketli.
    16. Nükleaz içermeyen 0.1 mM EDTA 200 ul ekleyin (80 & # ısıtılmışSpin kartuş filtre katılımcı başına (2) merkezine C) 176. 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    17. RNA elüte etmek için 12.000 xg'de 1 dakika boyunca santrifüj. Filtratı saklayın. Spin kartuşunu atın.
    18. Taze 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler, etiket içine iki, 100 ul kısma her 200 ul süzüntü bölmek ve buz üzerinde tutmak. Bu noktada, katılımcı başına 2 filtreler ile başlayan katılımcı başına RNA dört 100 ul hacimde verecektir.
  4. Dnaz tedavisi (1 saat)
    Not: Bu tedavi ile ilgili daha fazla detay, üreticinin protokolü 18 için bkz.
    1. (Hata pipetleme için hesap) Ben Tümbölenin + 1 başına DNaz I Tampon 10 ul ve 2 ul rDNase birleştirerek bir ana karışımı oluşturun.
      Not: dört numune için, 100 ul alikotları 50 ul DNase I Tamponu + 10 ul for rDNase I. kullanımı
    2. Kısım 12 adım 5.3.18 RNA alikotları her içine adım 5.4.1 master karışımı ul ve hafifçe karıştırın. 37 ° C'de inkübe edinIsı bloğu 30 dakika ° C.
    3. DNaz inaktivasyonu Reaktif vorteks ve her kana 11.2 ul ekleyin, iyice karıştırın. Inkübasyon sırasında 2-3 kez vorteks 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. 1.5 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin.
    5. Taze 1,5 ml tüp süpernatant (RNA) aktarın. Aynı katılımcıdan gelen Alikot burada toplanmış olabilir.
    6. Konsantrasyon elde etmek için bir spektrofotometre ile her bir örnek çalıştırın. RNA Kaliteli bir analizi Bioanalyzer (adım 5.5) kullanmanız önerilir.
    7. Istenildiği gibi cryovials halinde RNA alikotu. Bir Bioanalyzer analizi daha sonra analiz için bir mikrosantrifüj tüpe hemen kısım örnek 1.5 ul gerçekleştirilmez olacaktır. Konsantrasyonları ve dondurucu başlangıç ​​saati belgeleyin. -80 ° C'de saklayın örnekleri.
  5. Bioanalyzer analizi (1 saat)
    1. Üreticinin protokolü 19 izleyin. Çalışma tamamlandığında, veriler otomatik olarak depolanan, ancak w tekrar kaydetmek olduğunuDaha küçük, daha tanınabilir bir dosya adı i. Beklenen sonuçlar (Şekil 3): merdiven örnekleri 3 zirveleri (2 ribozomal zirveleri 44 saniye ve 50 saniye, sırasıyla ve 25 sn 1 erken işaretleyici zirvesinde) olması gerekir, 6 doruklarına olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu genel prosedür geni mikrodizi ve RT-PCR analizi ile ifade epigenetik değişiklikler saptanması ve hücre altküme varyasyonlar da dahil olmak üzere alt uygulamaların pek analiz için yüksek kaliteli malzeme üretmek gereklidir. Tablo 1 maddelerin ortalama verimini ve kalitesini gösterir süreçlerin her birinden. 3 lökosit RNA izolasyonu ve filtre işleme yöntemlerinin kaliteli çıktı bir örnek teşkil Şekil. Şekil 3 üst soldaki görüntü kapiler elektroforez kaynaklanan jel gör...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz başarıyla Detroit Mahalle Health Study 1.600'den fazla tam kan örnekleri işlemek için uygulanmış bir aerodinamik protokol tanımlanmıştır. Bu tekniklerin birçok mevcut literatürde mevcut olmasına rağmen, her adım arasında tam zamanlı değişiklikler dahil olmak üzere adım adım derleme başarıyla aşağı geniş bir uygulama yelpazesi ile biyolojik örneklerin çeşitli üretir optimize edilmiş, verimli protokol yansıtır, DNA metilasyonu, mRNA ifade ve immünolojik analizi dahil. Bu örnekler zaten ulusal toplantılarda 11...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Henriette Mair-Meijers'e ayrıntılara gösterdiği paha biçilmez özen ve kan alımlarının işlenmesine ayrılan saatler için teşekkür ederiz. Natalie Jameson Kiesling'in grafik tasarım uzmanlığı için minnettarız. Ayrıca, burada adı geçen üreticilerin (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) ürünlerinin kullanımını açıklandığı şekilde yayınlama onayını da takdir ediyoruz. Bu çalışma için finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri ödül numaraları DA022720, RC1MH088283 ve DA022720-05-S1 tarafından cömertçe sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
QIAamp DNA Kan Mini KitiQiagen51104Gün 1: DNA izolasyonu
Fosfat tamponlu salin (PBS)SigmaP5493-1LGün 1: PBMC izolasyonu
5 ¾ ” Pasteur pipetleriFisher13-678-6A1. Gün: PBMC izolasyonu
Fetal Sığır Serumu (FBS), ısıyla inaktiveedilmiş Yaşam Teknolojileri100821471. Gün: PBMC izolasyonu
Dimetil Sülfoksit (DMSO)SigmaD8418-500ml1. Gün: PBMC izolasyonu
RPMI Medium 1640, sıvıInvitrogen118751191. Gün: PBMC izolasyonu
%0.4 tripan mavisi lekesi InvitrogenT10282Gün 1: PBMC izolasyonu
Kontes Hücre Sayma OdasıInvitrogenC10283Gün 1: PBMC izolasyonu
Kontes Otomatik Hücre Sayacı veya mikroskop ve hemositometre gibi hücre sayma cihazıInvitrogenC10281Gün 1: PBMC izolasyonu
LeukoLOCK Fraksiyonlama ve Stabilizasyon Kiti Ambion1933Gün 1: Lökosit RNA izolasyonu
25  G x 5/8 inç iğnelerBecton Dickinson3051221. Gün: Lökosit RNA izolasyonu
Şırıngalar (5  ml)Becton Dickinson3096461. ve 2. Gün: Lökosit RNA izolasyonu
Denatüre Edici Lizis Solüsyonu Ambion8540GGün 2: Lökosit RNA izolasyonu
5  M NaClYaşam Teknolojileri247400112. Gün: Lökosit RNA izolasyonu
TRI ReaktifiAmbion97382. Gün: Lökosit RNA izolasyonu
Bromo-3-kloro-propan (BCP)SigmaB-96732. Gün: Lökosit RNA izolasyonu
spin kartuşları Ambion10051GGün 2: Lökosit RNA izolasyonu
0.1  mM EDTAAmbion99122. Gün: Lökosit RNA izolasyonu
DNA'sız KitAmbionAM19602. Gün: DNaz tedavisi
RNA 6000 Merdiveni Agilent5067-15292. Gün: Biyoanalizör analizi
RNA 6000 Nano Seri II Kiti Agilent5067-1511Gün 2: Biyoanalizör analizi
RNaseZAPAmbionAM8782Gün 2: Biyoanalizör analizi
Etanol >%99SigmaE7023-500ml
İzopropanol >%99 SigmaI9516-500ml
Nükleaz içermeyen ultra saf su Invitrogen9938
Pipet uçları (nükleaz içermez)Eppendorf22491253
Pipetleyici (serolojik)Eppendorf2223020-4
Pipetleyiciler (1  altındaki hacimler için; ml)Eppendorf3120000-054
Pipetler (serolojik)Fisher13-678-27E
Kontrollü oranlı dondurma kaplarıNalgene5100-0001
Cryobox'lar (2  ml ve 5  ml kriyoviyaller ve 1.5  ml mikrosantrifüj tüpleri)Fisher03-395-464
Test tüpü rafıThermo Scientific14-804-134
15  ml polipropilen tüplerFisher14-959-49D
1.5  ml ve 0.65 mikrosantrifüj tüpleriFisher07-200-534 ve 07-200-185
2  ml ve 5  ml kriyoviallerFisher10-500-26 ve 10-269-88F 
8  ml CPT vacutainerBD Biosciences3627612 tüp
6  ml K < alt > 2 < / alt> EDTA vacutainerBD Biosciences3678632 tüp
8.5 & nbsp; ml SST vacutainerBD Biosciences3679881 tüp
VortexerFisher2215365
Mikrosantrifüj tüpleri için ısıtma bloklu kuru banyo inkübatörüFisher11-715-1250
Hücre kültürü davlumbazı içinde kullanım için filtrasyon/vakum sistemiFisher01-257-87
Aerosol geçirmez kapaklı mikrosantrifüj tüpleri için sabit açılı rotorEppendorf22637002
için döner kova rotorlu ve aerosol geçirmez kapaklı soğutmalı santrifüj; mm vakumlar ve 15  ml polipropilen tüplerEppendorf226281572, birinin soğutulmasına gerek yoktur
Nanodrop 2000 (küçük hacimlerin doğruluğu için önerilir) veya başka bir spektrofotometrik cihazFisher13-400-411
Agilent BiyoanalizörAgilent TechnologiesG2940CA
Sıvı nitrojen tankıThermo Scientific11-676-56
Keskin alet kabıFisher22-037-970
Biyolojik atık kabıThermo Scientific1223P52
Biyogüvenlik Seviyesi 2  sertifikalı hücre kültürü başlığıThermo Scientific13-261-315
16 x 125 

Kaynaklar

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
  14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
  15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
  16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
  17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
  18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
  19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
  20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
  23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
  26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
  27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tam Kan lemePeriferik Kan Monon kleer H cresiDNA zolasyonuRNA zolasyonuSerum zolasyonuPlazma Ayr t rmaEritrosit ToplamaAk Sitometrisi AnaliziKlinik Olmayan OrtamToplum Tabanl rnekleme

İlgili makaleler