IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

EMSA başlangıçta, hedef DNA dizileri ^1,2 DNA-bağlayıcı proteinler arasındaki ilişkiyi incelemek için geliştirilmiştir. ilkesi, bu makalenin odak noktası RNA / protein etkileşimleri ³ için benzer. Kısaca, RNA, negatif yüklü ve poliakrilamid (ya da agaroz) jelleri içinde denatüre edici olmayan elektroforez sırasında anoda doğru hareket edecektir. Jel içinde göç yüküne orantılı olan RNA, büyüklüğüne bağlıdır. Belirli RNA bir proteinin bağlanması, serbest RNA ile karşılaştırıldığında karmaşık göç eder yavaş hareketliliğinin değiştirir ve. Bu molekül kütlesinde bir artışın, aynı zamanda yük ve muhtemelen konformasyonda değişikler kaynaklanmaktadır. Prob olarak etiketlenmiş RNA kullanımı "jel geriliği" veya "bandshift" kolay izlenmesine olanak sağlar. ³² P-etiketli RNA prob kullanımı çok yaygındır ve yüksek hassasiyeti sunar. RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA geçiş tespit edildiğindeOtoradyografi ile. Dezavantajları ³² P (14.29 gün), nedeniyle radyoliz prob kalitesinin kademeli bozulma kısa yarı ömrü vardır, bir radyoaktivite lisansı ve radyoaktivite çalışmaları için altyapı ve potansiyel biyogüvenlik kaygıları gereksinimi. Bu nedenle, bir RNA probu etiketlenmesine alternatif izotopik olmayan yöntemler, flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren görüntüleme ^4,5 radarından olanak florofor ya da biyotin ile, örneğin, geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin Sınırlamalar yüksek maliyet ve izotopik etiketleme ile karşılaştırıldığında genellikle azalır duyarlılık ve RNA / protein etkileşimi ile müdahale olmayan izotop etiket potansiyeli vardır. Denatüre edici olmayan poliakrilamid jelleri en EMSA uygulama için uygun olan ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Vesileyle, agaroz jelleri büyük kompleksleri analizi için bir alternatif oluşturabilir.

EMSA büyük avantajı basitlik, duyarlılık ve sağlamlığı birleştiren ⁴ olduğunu ^</ Sup>. Deney birkaç saat içinde tamamlanabilir ve karmaşık bir cihaz gerektirmez. RNA / protein etkileşimleri 0.1 nM veya daha az gibi düşük konsantrasyonlarda EMSA ile tespit edilebilir ve geniş bir bağlanma koşulları aralığında (pH 4,0-9,5, tek değerli bir tuzu konsantrasyonu 1-300 mM ve sıcaklık 0-60 ° C).

RNA / protein kompleksi oluşumu, filtre bağlama deneyi ile incelenebilir. Serbest bir RNA probu ⁶ geçerken bu, bir nitroselüloz filtresi RNA / protein kompleksleri tutma dayalı bir basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. EMSA ile karşılaştırıldığında, bu RNA sistemi birden çok bağlayıcı siteler, veya ham ekstrakt aynı sitede prob bağlanan birden fazla RNA bağlayıcı proteinler içermesi durumunda sınırlıdır. Birden fazla RNA / protein etkileşimleri filtre bağlayıcı tahliliyle tespit kaçış olsa da, onlar kolayca EMSA tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bazı durumlarda, görselleştirme arifesidirn, mümkün olduğunca, jeli üzerinde daha fazla geriliği elde EMSA reaksiyonuna, RNA bağlanan proteinlerden biri karşı bir antikor eklenerek birlikte geçirmek (örneğin, insan IRP1 / İRE ve IRP2 / İRE kompleksleri) iki RNA / protein kompleksleri ( "süperkayma") ^7.

EMSA yaygın demir metabolizması ^8-10 transkripsiyon sonrası düzenleyiciler olan IRP1 ve IRP2, incelemek için kullanılır olmuştur. Onlar birçok mRNA ¹¹ UTRs içinde İres, filogenetik korunmuş firkete yapıları bağlanarak çalışır. IRES ilk ferritin ¹² ve transferrin reseptörü 1 (TfR1) ^13, sırasıyla, demir depolanması ve alınması, proteinlerini kodlayan mRNA keşfedilmiştir. Daha sonra, İres eritroid özel aminolevulinate sentaz (ALAS2) ^14, mitokondriyal akonitaz ^15, ferroportin ^16, iki değerlikli metal taşıyıcı 1 (DMT1) ^17, hipoksi indüklenebilir faktör 2 bulundu 18, ve diğer mRNA'lar ^19-21. UTR'de 'TfR1 mRNA onun 3 birden İres içeriyor ise, UTR'de' prototip H ve L-ferritin mRNAlar onların 5 bir IRE'yi içerirler. IRE / IRP etkileşimleri özellikle sterik 43s ribozomal alt birim olan ilişkisini bloke ederek ferritin mRNA çeviri inhibe; Ayrıca, bu endonükleolitik klivaj karşı TfR1 mRNA'nın stabilize eder. IRP1 ve IRP2 payı geniş sekans benzerliği ve demir-aç hücrelerde yüksek İRE bağlayıcı aktivitesi sergiler. IRP2 proteozomal bozulmaya uğrar ise demirin bol olduğu hücrelerde, IRP1 onun İRE bağlama aktivitesi pahasına sitosolik akonitaz dönüştürür bir küban Fe-S, küme bir araya getirmektedir. Bu nedenle, İRE / IRP etkileşimi hücre demir durumuna bağlıdır, fakat aynı zamanda, _{H2O 2,} nitrik oksit (NO) veya hipoksi gibi diğer sinyalleri tarafından düzenlenmektedir. Burada, biz E ham hücre ve doku ekstrelerinden IRE-bağlama aktivitesinin değerlendirilmesi için protokol tarifMSA. Bu İRE dizisi aslında tarafından alt baş T7 RNA polimerazı site sens yönlenmede katılmasının bir plasmid DNA şablonu (I-12.CAT), in vitro transkripsiyonu ile üretilen bir ³² P-etiketli lH-ferritin İRE sonda kullanılan tavlanmış, sentetik oligonükleotidlerin ²² klonlanması.

Fareler ile Deneysel işlemler McGill Üniversitesi (protokol 4966) Hayvan Bakım Komitesi tarafından kabul edildi.

Kültürlenmiş Hücrelerde elde edilen protein ekstrelerinin hazırlanması 1.

1. Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) ile iki kez kültürlenmiş hücreleri yıkayın.
2. Kauçuk bir ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine buzla soğutulmuş PBS transfer süspansiyon 1 ml'lik plastik bir hücre kazıyıcı ile ya yapışmış olan hücrelerin Pençe.
3. 4 ° C'de 700 x g'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde spin. Aspire PBS.
4. 10 ⁷ hücre başına buz soğukluğunda sitoplazmik lizis tamponu içinde 100 ul (Tablo 1) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipet ve.
5. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
6. 4 ° C'da bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dk için spin.
7. Atın pelet. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine süpernatant aktarın ve buz üzerinde tutmak.
8. DetBradford tahlili kullanılarak ²³ - (10 ug / ml, genellikle 1) ermin protein konsantrasyonu.
9. Kullanılana kadar -80 ° C'de kısım ve mağaza hücre ekstrelerinden oluşabilir.

Fare karaciğer ve dalak elde edilen protein ekstrelerinin 2. Hazırlık

1. CO ₂ inhalasyon ile bir fare Euthanize.
2. Diseksiyon tahta üzerinde temiz bir pad üzerinde ötenazi hayvan yatırın. Makas ile karın açın.
3. Makas ve forseps kullanılarak karaciğer ve dalak ayır ve yaklaşık 50 ml buz gibi soğuk PBS içinde, her doku yıkayın.
4. Hemen bir neşter ile küçük parçalar halinde dokuları kesmek (örneğin: Yaklaşık 1-2 mm ^3).
5. Gecikme olmadan, taze cryotube dokuların parçaları koymak ve daha sonra sıvı azot içinde bunları dondurmak oturtun. Mağaza şekild dondurulmuş doku alikotlan kullanılana kadar -80 ° C'de ilave edildi.
6. 0.5 ml - 0.25 - (2 ila ³ mm, yaklaşık 1) dondurulmuş dokudan bir parça homojenizebuz soğukluğunda sitoplazmik lizis tamponu (Tablo 1) 10 saniye süreyle bir doku homojenleştirici ile.
7. 20 dakika boyunca buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve soğuk Homojenat aktarın.
8. 4 ° C'da bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dk için spin.
9. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine pelet ve transfer süpernatant atın. Buz üzerinde tutun.
10. Bradford tahlili ²³ kullanılarak - (10 ug / ul genellikle 1) protein konsantrasyonu belirleyin.
11. Kullanılana kadar -80 ° C'de kısım ve mağaza hücre ekstrelerinden oluşabilir.

Radyoaktif IRE-prob 3. Hazırlık

1. Kısıtlama endonükleaz Xbal (plazmid ug başına 1 U) DDE sekansının alt baş ayrıştıran ile 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek İRE içeren plazmid I-12.CAT ²² linearize. linearize plazmid, in vitro transkripsiyonu için, şablon olarak kullanılır.
2. Kurman, in vitro olarak 20 ul bir toplam hacim içinde transkripsiyon reaksiyonu. Tablo 2'de gösterilen stok çözümleri kullanın ve ekleyin: 1 ul çizgiselleştirilmiş plazmid şablonu, 4 ul transkripsiyon tamponu; ATP / TO / GTP karışımı 1 ul karışımı, 10 ul ^[32 P α-] -UTP, 2 ul ditiyotreitol, 1 ul RNaz inhibitör ve 1 ul, T7 RNA polimeraz ile karıştırıldı. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
3. 1 saat ²⁴ süreyle 40 ° C'de inkübe edilir.

Radyoaktif IRE-prob 4. saflaştırılması

1. Yukarı ve aşağı pipetleme 0.5 M EDTA, pH 8 Karışımı 1 ul ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonu bitirin.
2. Daha iyi çökelmesi için taşıyıcı olarak, 10 mg / ml tRNA 10 ul ekle. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
3. 3 M amonyum asetat, 82.5 ul ekleyin. Vorteks ile karıştırın.
4. Etanol içinde 273 ul ekle. Vorteks ile karıştırın.
5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
6. Oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dakika boyunca dönerler. Sil süpernatant.
7. Yıkama,% 70 etanol içinde 100 ul ile pelet.
8. Oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dakika boyunca dönerler. Sil süpernatant.
9. 10 dakika boyunca hava kuru topak.
10. Iki kez damıtılmış 100 ul içinde süspanse pelet daha önce H ₂ O otoklava
11. Kullanılana kadar -80 ° C 'de bir sıvı sintilasyon sayacı içinde radyoaktivite, kısım radyo-etiketli prob İRE ve mağaza ölçmek. Donmuş madde şişeleri 3 haftaya kadar kullanılabilir.

EMSA için yerli poliakrilamid jeli 5. N-

1. 1,5 mm ara parçasını ve tarak yardımıyla jel (16 x 16 cm) birleştirin.
2. Tablo 3'te gösterilen stok çözeltileri kullanmak,% 6 yerli poliakrilamid jel hazırlamak için 7.5 ml% 40 akrilamid karıştırın:. Bisakrilamid, 5x TBE 5 ml ve 37.5 mlçift ​​distile H ₂ O
3. % 10 taze hazırlanmış amonyum persülfat (APS) ve 25 ul tetrametiletilenediamin (TEMED) 0.5 ml ekleyin.
4. Hemen jel akrilamid çözüm dökün ve polimerize edelim. Yaklaşık 30 dakika boyunca bekleyin.
5. , Jel ile elektroforez cihazı monte 0.5x TBE ile tanklarını doldurmak ve güç kaynağı ile bağlayın.

6. Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Deneyi

1. 10 ul bir toplam hacim içinde hücreler ya da sitoplazmik lisiz tamponu (Tablo 1) dokudan elde edilen protein ekstresi, 25 ug seyreltin (düşük protein konsantrasyonları da kullanılabilmektedir). Buz üzerinde tutun. ^25: 4 atıl IRP1 (% 2 nihai konsantrasyon) aktif hale getirmek için 2-merkaptoetanol (2-Me) ile seyreltildi: Gerekirse, 1 ve 1 ul ekleyin.
2. 95 ° çift distile H radyoaktif işaretli IRE probu sulandırmak ₂ O 200.000 cpm / ul, ısı doğasını1 dakika için C ve en az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya.
3. Protein ekstresi Radyoetiketli IRE probu 1 ul ekleyerek bir EMSA reaksiyonu ayarlayın.
4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
5. Reaksiyona 50 mg / ml heparin 1 ul ekle (prob ⁹ ile non-spesifik protein etkileşimlerini inhibe etmek için) ve 10 dakika daha inkübasyona devam etmektedir. -80 ° C de hazır heparin çözeltisi (50 mg / ml) ve mağaza alikosu.
6. Uzun radyo-etiketli problar (> 60 nükleotid) kullanıldığında, 1 ul RNaz T1 (1 U / ul) ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir sondasına bağlanma, spesifik olmayan protein azaltmak için, RNA / protein daha iyi ayrılmasına izin vermek üzere Elektroforez sırasında kompleksi.
7. Yükleme tamponu (% 80 gliserol + bromofenol mavi) 3 ul ekleyin, karıştırın ve% 6 denatüre edici olmayan poliakrilamid jeli üzerinde yükü.
8. 130 V (5 V / cm) 60 dakika süre ile jel çalıştırın.
9. Transfer büyük bir filtre kağıdı ve kuru üzerine jel.
10. Bir film ortaya çıkarmak ve otoradyografi gelişir. Uygulama süresi 1 saat (ya da daha az) den O / N 'ye kadar çıkabilir.

Bölüm 3 ve protokol 4'te tarif edildiği gibi bir radyo-etiketli prob İRE, elde edilmiştir. prob dizisi 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG Cı UUCAA Cı AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 'idi; kalın nükleotidler kritik IRE özellikleri bir eşleşmemiş C kalıntısı ve döngü, temsil eder. prob özel radyoaktivite 4.5 x 10 9 cpm / RNA ug idi.

Aktivitesi İRE bağlayıcı demir sıçramaların etkilerini değerlendirmek için, sıçangil RAW264.7 makrofaj tedavi edilmediği veya hemin (demir kaynağı) veya desferrioksamin (demir kenetleme maddesi) ile muamele edildi. Lisatlar hazırlanmış ve İRE prob (8000 cpm / ug protein) EMSA ile analiz edildi. Örnek veriler, sırasıyla, sol ve sağ panellerinde otoradyogramlar arasında daha kısa ve daha uzun maruz kalma ile, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Murin IRE / IRP1 ve IRE / IRP2 kompleksleri, farklı hareketlilik ve iki ayrı bantları gösterirlermuamele edilmemiş hücrelere karşılık gelen, şerit 1 görülebilir. Demir takviyesi onları azalmış ise demir şelasyon derinden, (şeritli 3) IRP1 ve IRP2 (kulvar 2) hem IRE-bağlama faaliyetleri kaynaklı. Hatta demir ile muamele edilmiş hücrelerin ekstrelerinde% 2 2-ME bütünüyle harekete geçirilmiş olarak IRP1 (alt panel) ile ön tedavi,. Bu ütü pertürbasyonlar IRP1 stabilitesi çarpacak olmadığını gösterir ve aynı zamanda, bir yükleme kontrolü olarak görev yapar. Buna 2-ME, ön-muamele IRP2 ire bağlayıcı aktivitesi inhibe etti. Hızlı göç non-spesifik bantlar demir etkilenmez.

Sonra, vahşi tip karaciğerlerinde aktivitesi İRE bağlayıcı analiz Irp1 - / - ve Irp2 - / - daha önce bir standart ya da bir demir bakımından zenginleştirilmiş diyet (Şekil 2), bir hafta boyunca beslenirler fareler. Irp1 - / - ve Irp2 - / - fareler nezaketen Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg, Almanya) tarafından temin edilmiştir. Vahşi tip karaciğer ekstrelerinde, IRP1 IRE-bağlama aktivitesi ve IRE / IRP2 komplekslerinin büyük kısmı için sorumluydu pek vardıönceki gözlemlerle 26 ile uyumlu olarak görünür (kulvarlar 1, 2). - / - Fareler (kulvarlar 3, 4) IRP2 karaciğer Irp1 özleri kuvvetli İRE bağlayıcı aktivitesi sergiledi. Bu koşullar altında, hiçbir İRE / IRP1 kompleksleri gözlenmiştir. - / - Aynı şekilde, İRE / IRP2 kompleksleri karaciğer Irp2 ekstreleri oluşmuştur fareden (kulvarlar 5, 6). Hem IRP1 ve IRP2 hepatik IRE-bağlanma aktivitesi yüksek demir diyet ile fareler azalmış Besleme; Bu etki IRP2 (kulvarlar 7-12) daha dramatik oldu. Not vahşi tip veya Irp2 muamele edilmesinden sonra - bu açıkça otoradyogramlar kısa maruz kalma gözlenmiştir (2-ME IRP1 ire bağlayıcı aktivitesi, hemen hemen tüm İRE prob kaymış bir noktaya kadar geliştirilmiştir karaciğer ekstrelerinde - / Sol panelde).

- / - Fareler (Şekil 3) Son olarak, karaciğer ve vahşi tip ve HJV dalaklarında İRE bağlayıcı aktivitesi değerlendirildi. HJV - / - fareler nezaketen Dr. Carolina Andrews (Duke Üniversitesi, Kuzey Carolina) tarafından temin edilmiştir. Bu hayvanlar bir model temsilKalıtsal hemokromatozis 27, retiküloendotelyal makrofajlar demir kalırken aşırı demir, parankimal hücrelerde biriken, sistemik demir yükünün, bir hastalık 28 eksiği. Beklendiği gibi, HJV karaciğerleri - / - göstermiştir (demir yüklü hepatositlerle) fareler vahşi tipli (kuşak 1-4) kıyasla, aktivitesi İRE bağlayıcı azalmıştır. Tersine, İRE bağlama aktivitesi HJV dalaklarında yüksekti - / - fareler (demir eksikliği olan makrofajlar, 5-8 kuşak). Yine burada, 2-ME tedavi karaciğer özleri (sol panelde otoradyogramlar kısa pozlama bakınız) IRE prob neredeyse tamamen kaymasını teşvik.

Tablo 1. Sitoplazmik lisis tamponu.

1. çözüm gerekirotoklavlanmış ve oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Proteaz inhibitörleri, örneğin, 10 ug / ml löpeptin ve 0.1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), kullanımdan önce ilave edilebilir.
3. Taze, 1 mM dithiotheritol eklenmesi IRP2 aktivitesinin tespit edilmesi için tavsiye edilir.

In vitro transkripsiyon reaksiyonu için Tablo 2. stok çözeltileri.

<poliakrilamid jel elektroforezi denatüre edici olmayan güçlü> Tablo 3. Stok çözümleri.

5x TBE 1 L yapmak için, Tris bazı, 54 g borik asit ve 27,5 g, ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) içinde 20 ml kullanılır.

RAW264.7 makrofajlar faaliyetleri IRE-bağlama Şekil 1. Demir-bağımlı düzenleme. 10 7 hücre / 100 mcM hemin veya desferoksamin N ya sol işlenmemiş veya işlenmiş O idi. Sitoplazmik lizatları% 2 2-ME (alt yokluğunda (üst) veya varlığında, bir 32 P-etiketli İRE probu ile EMSA ile analiz edilmek üzere hazırlanmıştır). İRE / IRP1 ve ücretsiz İRE prob İRE / IRP2 komplekslerinin pozisyonları oklarla gösterilmiştir. Yıldız spesifik olmayan bir bant gösterir. Otoradyogramlar kısa ve uzun poz sol ve sağ paneller gösterilir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. analizi vahşi tip (wt) 'karaciğerlerinde aktivitelerini İRE bağlayıcı Irp1 - / - ve Irp2 - / -. Fareler 5 haftalık farelerin (n = 2, her bir genotip için), C57BL / 6 arka 29, hepsi standart ya da yüksek demir diyet (% 2 karbonil demir içeren) üzerine yerleştirilmiştir. Bir hafta sonra hayvanlar kurban edilmiştir. Karaciğer protein ekstreleri, bir 32 P-etiketli İRE probu ile EMSA ile analiz edilmek üzere hazırlanmıştır% 2 2-ME (alt) yokluğunda (üst) veya varlığında gerçekleştirilir. İRE / IRP1 ve ücretsiz İRE prob İRE / IRP2 komplekslerinin pozisyonları oklarla gösterilmiştir. Yıldız spesifik olmayan bir bant gösterir. Otoradyogramlar kısa ve uzun poz sol ve sağ paneller gösterilir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

- / -. Karaciğerlerde faaliyetleri ve yabani tip (wt) ve HJV dalak İRE bağlayıcı Şekil 3. Analiz farelerin (her genotip için, n = 2), 10 haftalık fareler, C57BL / 6 arka 30, tüm hayvanlar kurban edilmiştir. Karaciğer ve dalak protein ekstreleri yokluğunda (üst) veya varlığında, bir 32 P-etiketli İRE probu ile EMSA ile analiz edilmek üzere hazırlanmıştır2% 2-ME (alt). İRE / IRP1 ve ücretsiz İRE prob İRE / IRP2 komplekslerinin pozisyonları oklarla gösterilmiştir. Yıldız spesifik olmayan bir bant gösterir. Otoradyogramlar kısa ve uzun poz sol ve sağ paneller gösterilir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.