Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma

9.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52232

⸱

24 Kasım 2014

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster Immunology Research Centre, Institute for Infectious Disease Research, McMaster University

Bu makalede

Özet

Pamuk fareleri son derece heyecanlıdır ve güçlü bir kaç ya da savaş tepkisine sahiptir. Hayvanların stresini azaltmak için optimize edilmiş bir işleme yöntemi tanımlanmıştır, bu da pamuk farelerini klinik öncesi bir model olarak daha erişilebilir hale getirecektir.

Özet

Onkolitik virüsler, sağlıklı hücreleri sağlam bırakırken tümör hücrelerini hedef alma yeteneğine sahip yeni bir antikanser tedavisidir. Bu stratejinin başarılı olması için, son çalışmalar konak bağışıklık sisteminin tutulumunun gerekli olduğunu göstermiştir. Bu nedenle onkolitik viroterapi, immünkompetan bir model bağlamında değerlendirilmelidir. Ayrıca, tolere edilmiş hayvan modellerinde antitümör tedavilerin incelenmesi, klinik çalışmalarda görülen sonuçları daha iyi özetleyebilir. Solunum yolu virüslerini incelemek için yaygın olarak kullanılan pamuk sıçanları, meme karsinomu ve osteosarkomun sinjeneik modelleri iyi kurulmuş olduğundan, onkolitik viroterapiyi incelemek için çekici bir modeldir. Bununla birlikte, bu son derece uyarılabilir kemirgenler için uygun kullanım prosedürü hakkında yayınlanmış bilgi eksikliği vardır. Özetlenen taşıma ve yakalama yaklaşımı, deneyleri kolaylaştırmak için hayvan stresini en aza indirir. Bu teknik, araştırmacının kullanım sırasında sakin kalma ve prosedürleri zamanında gerçekleştirme becerisine bağlıdır. Son olarak, tutarlı subkutan tümör oluşumu için pamuk sıçan meme tümör hücrelerinin nasıl hazırlanacağını ve intratümöral ve intraperitoneal enjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz. Bu yöntemler, antitümör tedavisini incelemek için ilgili bir klinik öncesi model olarak pamuk faresinin gelişimini ilerleten çok çeşitli çalışmalara uygulanabilir.

Giriş

Onkolitik virüsler (OV) seçici olarak normal ve tümörlü hücrelerde 1,2 arasındaki biyokimyasal farklılıklar yararlanılarak tümör hücreleri içinde replike. Doğal olarak meydana gelen doğal tipte virüs ifade seçici oncolysis elde etmek için bir mutasyon gerekmez olanlar, seçici oncolysis elde etmek için tasarlanmış olmalıdır ki bu: Ovs iki türü vardır. Belirli bir tümör türü içinde mutasyonların koleksiyonu OV 2 normal hücreler üzerinde selektif büyüme avantajı doğasını belirler. kullanılarak Ovs güvenlik ve faydaları, klinik çalışmalarda 3-7'de gösterilmiştir. Onkolitik viroterapi alanında ilerlemelere rağmen iyi modeller Ovs antitümör etkinliğini değerlendirmek için gerekli olduğunu düşündüren, klinik öncesi ve klinik sonuçlar arasındaki boşlukları söz konusudur.

Sığır herpes virüs tip 1 (BHV-1) Herpesviridae ailesinin üyesi ve Alphaherpesviridae alt familyası olduğunu. BHV-1 başlatılmaktadırates kötü bir soğuk 8,9 benzeyen belirtiler geniş bir yelpazede tezahür, sığırlarda solunum hastalığı kompleksi bovin. BHV-1 gibi, heparan sülfat ve adiponektin-1, 10, HSV-1 tarafından kullanılan bağlanma ve giriş reseptörleri bağlar. Bununla birlikte, adiponektin-2 10 yerine CD155 bağlanır. BHV-1 verimli girerek, normal ve transforme hücreler sıçangil 3,4,10 çoğaltma başlatmak için mümkün olduğu şekilde çok dar bir konakçı yelpazesine sahiptir. Bu geleneksel fare modelleri kullanımı sorunlu hale getirir. BHV-1 onkolitik kapasite in vitro 11,12 gösterilmiştir. BHV-1 göğüs kanseri hücreleri ve meme kanseri başlatan hücrelerin 11,12 dahil olmak üzere histolojik kaynaklı çeşitli insan tümör hücreleri içinde replikasyonunu başlatır ve öldürmek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, BHV-1 ve anti-tümör kapasitesi İmmün kapsamında, in vivo olarak değerlendirilmesi gerekir.

İnsan Adenovirüs (Ad), hangi57 tanımlanan serotipi en yaygın insanlarda solunum hastalığa neden vardır. Onkolitik Ad vektorlerı çeşitli klinik denemeler 13-15 ilerlemesini ile anti-tümör etkinliği için değerlendirilmiştir. Umut verici klinik öncesi verilere rağmen, klinik sonuçlar beklentilerini kısa düştü. Virüsün 16,17 bağışıklık tepkilerinin zayıflatılmış sergileyen, ancak insan tümör ksenograft modelleri, tipik olarak, Reklam vektörlerin antitümör etkinliğini incelemek için kullanılır. Ayrıca, singeneik fare modelleri, Reklam enfeksiyona olmayan toleranslılar 17,18 pratik bu modelleri kullanarak konak bağışıklık tepkilerinin değerlendirme yapılırken.

konukçu bağışıklık sisteminin Ovs tümör hücre ölümünü 19 ortaya olan en etkili bir mekanizma olarak tanımlanmıştır. Ile tolerize edilmiş ve tolerize edilmiş olmayan tümörle birleşmiş antijeni arasında antitümör tepkiler (TAD) modelleri farklıdır ve büyük ölçüde OV tedavinin başarısını etkiler. HSV-1 OV KM100 (ICP0 n21220) 20,21 1814 VP16 bir murin Polyoma Orta T antijeni meme kanseri modelinde 22 tümör taşıyan farelerin% 80 tümör regresyonu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, HER-2 / neu modellerinde KM100 antitümör etkinliği, transgenik farelerde sinjeneik farelerde% 20 tam bir gerileme ve tümör staz arasında değişmiştir, fareler HER2 tolerans kazandırma. Birlikte bu veriler tamamen iyi tamamen tedavi başarısını belirlemek özellikleri anlamak için insan bağışıklık manzara özetlemek hayvan modelleri kullanılarak Ovs değerlendirilmesinin önemini vurgulamak.

(5 gözden gibi), Kuzey ve Güney Amerika yerli pamuk sıçan (Sigmodon hispidus), en sık RSV enfeksiyonuyla bir model olarak kullanılmaktadır. Bunlar 6,23 kompleks sığır solunum hastalığı ile bağlantılı patoloji özetlemek olarak pamuk fareleri aynı zamanda anti-BHV-1 aşı araştırmalarında kullanılmıştır. Pamuk sıçan Ayrıca, BHV-1 enfeksiyonuimmünojenik olan sürekli mukozal hem de sistemik bağışıklık tepkilerini 6,23-25 ​​uyarılması. Hücre hatları, spontan fibrosarkom ve meme bezi (fazla tercih) ve kemik (TÇHK ve VCRT) sırasıyla 26 ve osteosarkom elde edilmiştir. Pamuk fareler Reklam enfeksiyona yatkın olarak onkolitik Reklam vektörleri in vivo etkinliğini değerlendirmek ve insanlarda 27-29 benzer bir patoloji gösteren için kullanılmıştır. OVS öncesi klinik değerlendirme için immün sistemi baskılanmış modellerin kullanımı sadece tedaviye klinik yanıtlar daha az göstergesidir ancak onkolitik viroterapi 30,31 dikkate bağışıklık sisteminin rol almak için başarısız. Bu nedenle, singenik ve meme kanseri ve osteosarkom tümör-Tolerize pamuk sıçan modelleri, geleneksel kemirgen modelleri kullanılarak okudu olamaz gibi BHV-1 gibi OVS ve Ad öncesi klinik etkinliğini değerlendirmek için ilgili modellerdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: kullanılan protokoller Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi'ne göre McMaster Üniversitesi'nde kurumsal Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Deneyler McMaster Üniversitesi Merkez Hayvan Tesisleri'nde gerçekleştirildi.

1. Kültürleme fazla tercih Hücreler

  1. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde kültür fazla tercih hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. 37 ° C 'de, T-150 doku kültürü şişelerinden hücreler korumak ve% 5 CO2. Geçiş hücreleri% 90 konfluent tek tabaka (2-3 günde, Şekil 1) oluşturmak zaman.
  2. Ön sıcak 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), hücrelerin bölünmesi önce 10 dakika için 37 ° C su banyosu içinde 1 x tripsin ve orta.
  3. Aspire şişeden orta ve 1x PBS 5 ml hücreleri yıkayın.
  4. Duruladıktan sonra, PBS aspire ve inkübehücreler kadar 1x tripsin 2 ml hücre şişeye (yaklaşık 2 dakika) çözülür.
  5. Yumuşak ve (10 mi hücre süspansiyonu, toplam), 8 ml ortam içinde yeniden süspanse hücreler, hücrelerin yığınları parçalamak için yukarı ve aşağı pipet ve.
  6. Yan hafifçe yan ve kaya şişeye (T-150 25 ml toplam) 24 ml ortam içine 1 ml hücre süspansiyonu, tohumlama ile, bir T-150 şişesi içinde hücrelerin muhafaza edin. Bir sonraki bölünme kadar 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri koruyun.

2. fazla tercih Hücreleri Virüs Çoğaltma ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi

  1. Virüs Çoğaltma
    NOT: yerli viral promoterlerin kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir floresan etiketi sentezleyen Virüs yapılan, virüs enfeksiyonu vizüalizasyon ve floresans plaka okuyucusu kullanılarak yayıldı.
    1. Sayma için kuyu bırakarak kültür plakaları içine Tohum fazla tercih hücreleri,. Tohum hücreleri gibi onlar bir gün sonra% 80-90 konfluent olacak. 10 5 cel bir konsantrasyon kullanınls / ml (oyuk başına 100 ul) 96 oyuklu düz tabanlı plakalar içinde bir gün sonra, istenen konfluent üretilir.
    2. Bir sonraki gün, önceden sıcak 1x PBS, 1 x tripsin, 10 dakika önce deney başlamadan 37 ° C su banyosu içinde tam ve serumsuz ortam.
    3. Iyi yüzeyi üzerine sallanmasıyla 1x PBS, 5 ml iyi sayma ve durulama hücrelerden aspire ortamı.
    4. Durulamadan sonra, hücreler kadar 1x tripsin 2 ml PBS aspire ve inkübe hücreler şişeden (~ 2 dakika) çözülür.
    5. Bir hemasitometre kullanarak sayılabilir aralığı içinde bir hücre yoğunluğu vermek üzere tam orta uygun hacimde tekrar süspansiyon hücreleri. Doğru bir hücre sayısını sağlamak için, önce iyice yukarı ve aşağı pipetleme hemasitometre aşılamak için hücre süspansiyonu karıştırın.
    6. Enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) enfeksiyonu için gerekli virüs stokunun hacmini belirleyin.
      Birimleri Şekillendirme Gerekli Paque (pfu) = kaplama hücrelerinin sayısı * İçişleri Bakanlığı(Pfu / hücre)
      Virüs stokunun hacmi gerekli = gerekli pfu / virüs stok titresi (pfu / ml)
    7. Tüpler, serum barındırmayan ortam içinde, virüs inokulum hazırlayın. Hücrelere inokulum eklemeden önce vorteks veya pipetle iyice karıştırın.
    8. Bundan sonra DMEM +% 1 FBS bakım paylaşımı uygulama, 37 ° C de 1 saat süre ile hücreleri enfekte etmektedir.
    9. Tarama plakaları bir ve iki gün sonrası enfeksiyon (pi) GFP floresan görselleştirmek için.
  2. Virüs Sitotoksisite
    NOT: Bileşik ışığa gibi düşük ışık koşullarında resazurin sitotoksisite deneyi gerçekleştirin. Aynı içeren ortam, sadece eşiğe düzeltmek için dahil edilmelidir.
    1. 1x PBS resazurin,% 5 (h / h) çözeltisi hazırlayın. Pipetleme tarafından çözüm karıştırın.
    2. Hücrelerden aspire orta ve% 5 resazurin çözümü uygulayın. Iyi içeren ortamı sadece eşiğe düzeltmek için ekleyin.
    3. 37 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakılır C, sonrabu, bir floresan plaka okuyucu (eksitasyon 530 nm, emisyon 595 nm) kullanılarak floresans okundu.
    4. Eşiğe için düzeltme bulaşmamış kontrollere veri göreli analiz.

3. Konut ve Taşıma

  1. Konut ve Diyet
    1. Ev pamuk fareleri tek tek kemirgen yatak (1/8 "mısır koçanı yatak), artık zenginlik olarak 8 inç ve nestlets daha PVC boru (Şekil 2) bir bölümünü içeren polikarbonat sıçan kafeslerde de söndürme azaltmak için.
    2. Üstünlük kafesin oturmak ve kemirgen yiyecek ve su şişesi içeren bir güvenilir çelik sepet kullanın.
      NOT: Bu kafes kurulum büyük önem kafes varlığının ucuna karşı zenginleştirme tüpün yerleştirilmesi ile, hayvan güvenli ve kolay bir yakalama sağlayacaktır.
  2. Kullanma
    1. Hayvan tesis teknisyenleri tarafından mermi önce önce heyecan verici bunları önlemek için, sabah pamuk fareleri Kolubir prosedür.
    2. Tüm işlemler sırasında, koruma için kalın deri eldiven giyin.
    3. Hayvanlar öncelikle zenginleştirme tüplerinde kalır gibi, rutin temizlik sırasında yeni bir kafes içine sıçan aktarmak için kullanabilirsiniz. Alternatif olarak, işleyici kendi elini ulaşmasına izin biraz kafesi açmak, hayvan sonra sadece omuzlar üstünde cildi Eksfoliyant ve aşağı iterek ölçülü olabilir. Hayvan kendi dilini ısırabilir olarak Pratik bakım aşırı güç kullanmak değil.
    4. Sabırlı olun ve hayvanlar güçlü bir uçuş veya dövüş yanıt var ve çalışıyor ve kafesin dışına atlayarak yakalama önlemek için çalışacağız olarak istikrarlı bir elinizi kullanın. Derinin büyük oluşacak gibi Önemlisi, kuyruk hayvanlar dokunmayın.
    5. Tuzak doğrudan kullanım üzerindeki zenginleşme tüpler hayvanlar. Bu büyük ölçüde yaralanmaları ve kaçan azalır.

4. Yakalama ve Anestezi

  1. Ele geçirmek
    1. Koruma için kalın deri eldiven giyinTüm işlemler sırasında iyon.
    2. Hava ve bir kapak, kap ve gaz çıkış hortumunun (Şekil 3) takılan bir burun konisi sığacak kadar büyük bir indüksiyon odası için delikli bir büyük şeffaf plastik kap kullanın.
    3. Prosedür daha verimli hale getirmek ve izofluran, bir inhalasyon anestezik hayvanların maruz kalma süresini azaltmak için çiftler halinde çalışın. Emin bir araştırmacı olun (işleyicisi # açılması ve kafes çelik kapağını yerine ve indüksiyon odasının kapağı (1 işleyicisi #) sorumludur ve onların ortak indüksiyon odasına tüp ve ulaşım hayvanın yakalanması için sorumlu 2).
    4. Düz bir yüzeye yerleştirin ve kafesi dış kapağı çıkarın. Biraz çelik besleme tepsisini kaldırın ve kafes kenarları ve arka karşı paralel çok yavaş zenginleştirme tüp manevra. Gerekirse, hayvan ajitasyon önlemek için kafes açmadan zenginleştirme tüp manevra bir nesne kullanın (işlemekr # 1).
    5. Hayvan ajite olur ve tüp bırakırsa, hayvan dinlenmek ve bir kez daha tüp (işleyici # 1) yerleşmek için yeterli zaman tanıyın.
    6. Yavaşça ve kasıtlı kafes ile temas diğer ucunu tutarak, zenginleştirme tüp çelik kapak sağdaki kenarını kaldırın. Plastik kap (2 işleyicisi #) için yeterli bir alan, büyük olun.
    7. Bir yumuşak, hızlı bir hareketle, zenginleştirme tüp üstünlük plastik kap itin. Tüp hayvan bindirme kafesin yüzü kabın temas halindedirler. Mümkün (işleyici # 2) olduğunca çabuk adımlar 4.1.6 ve 4.1.7 gerçekleştirin.
    8. Çelik besleme tepsisini çıkarın ve # 2 (işleyici # 1) işleyicisi için plastik kap kapağı vermek. Süreç içinde sıkışıp hayvanın ekleri dikkatli olmak, kafes ve kabın yan arasındaki plastik kapağı kaydırın. Bu sonraki adım daha zor hale getirecek gibi kabı mühür etmeyin (işleyici # 2).
  2. Anesthesia
    1. Emin konteyner kapalı kalır emin olun ve indüksiyon odasına hayvan taşıma. Hızla odasında hayvan koyun ve bir sıvı hareketi (işleyici # 2) konteyner kapağı kaldırın. Açın ve hemen indüksiyon odası kapağı yerine (işleyici # 1).
    2. Indüksiyon odasına (/ dak 5 L) izofluran akışının açın ve hızlı bir şekilde gaz dolaşımını kolaylaştırmak için indüksiyon odasından çıkarmadan tüp ve kap, hayvanın slayt point hangi uyuşukluk belirtileri için hayvan izlemek.
    3. Sıçan tam anestezi olduğunda, çalışma yüzeyine taşıyın ve burun konisi (Şekil 3) içine burun ve ağız yerleştirin. Sıçan tam olarak güçlü bir ayak tutam tepkisiz olduğunda anestezi.
    4. Kuruluk ve aşınmaları önlemek için hayvanın gözleri veteriner vazelin oftalmik merhem yerleştirin. Bu pamuk fareleri yaralanma olursa enfeksiyona eğilimli olabilir büyük gözleri var gibi önemli bir adımdır.
    5. dikkatlice izlemek ve sabit solunum hızını korumak ve hayvanın burnu prosedürü boyunca uydurma burun konisi içinde kalmasını sağlamak. Uygun izofluran akış hızını ayarlayın. izofluran miktarı her hayvan değişecektir uyutmak için gerekli.
    6. Post-işlem, kendi kafesine hayvan dönün ve tam hareketlilik ve sternum yatma kavuşur sağlamak.

Subkutan Tümör Oluşumu için fazla tercih Hücreler 5. hazırlanması

Not: fazla tercih biri, tamamen T-150 şişesi (% 90 konflüans) yaklaşık 2 x 10 7 hücreleri elde edilir. Ihtiyaç duyulan hücre sayısı gerekli T-150 şişelerinde sayı tabanıdır. Elde edilir gerekli hücrelerin toplam sayısını sağlamak için ekstra şişeler Tohum ve hazırlık ve ekstra enjeksiyonlar için gerekli olan sırasında kaybedilen hücreleri karşılamak için. Hücre canlılığı uzatmak için mümkün buz üzerinde hücreleri tutun.

  1. Balon hücreleri, aspire orta hasat1x PBS, 5 ml d durulama hücreleri.
  2. PBS aspire ve hücreler, bir şişeye (yaklaşık 2 dakika) ayrışmasına kadar 1x tripsin 2 ml hücreleri inkübe edin.
  3. Yumuşak ve (10 mi hücre süspansiyonu, toplam), 8 ml ortam içinde yeniden süspanse hücreler, hücrelerin yığınları parçalamak için yukarı ve aşağı pipet ve. Ek matara hücreleri hasat devam edin.
  4. Bir konik tüp, 50 ml konik tüp başına yaklaşık 4, T-150s içine tüm hücre süspansiyonları havuzda toplayın.
  5. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 160 x g'de tüpü.
  6. Kültür ortamı basınçla bir hemositometre kullanılarak sayılabilir aralığı içinde bir hücre yoğunluğu vermek üzere bir PBS uygun hacmi (T-150 başına 10 ml PBS) hücre pelletini. Doğru bir hücre sayısını sağlamak için, önce iyice yukarı ve aşağı pipetleme hemasitometre yükleme hücre süspansiyonu karıştırın.
  7. Toplam hücre sayısını hesaplayın:
    Hücrelerin toplam sayısı = hücre sayımı (hücre / ml) toplandı X yeniden süspansiyon hacmi (mi)
  8. BelirlemekTüm enjeksiyonlar için gerekli olan hücre süspansiyonu hacmi. Deneme başına 2-3 ilave doz olun. Deri altına enjekte, 5 x 10 5 fazla tercih hücrelerinin toplam 3-4 gün içinde aşikar tümörler oluşturacaktır.
    Gerekli hücrelerin sayısı = 5 x 10 5 hücre x doz sayısı
    Birim hücre süspansiyonu gerekli (mi) = (* toplamı, püskürtme miktarının gerekli olan toplam hücreleri) /, (hasat edilmiş hücrelerin toplam sayısı)
  9. Pipet gerekli PBS içeren bir konik tüp içine, hücre süspansiyonu hacmi ve iyice karıştırın. Eppendorf tüpleri içine kısım tek enjeksiyonu (100 ul). Enjeksiyon işlemi sırasında buz şok koruyun.

6. Enjeksiyonlar

NOT: Bir süre başka izler hayvanın solunum hızı ve genel durumu ise anestezi altında iğne yapmak, iki araştırmacı olan prosedürleri uygulayın. Tüm enjeksiyonlar ve yeni bir iğne için insülin şırınga (29 g 0.3 mi, '1/2 x) kullanarakHer bir hayvan.

  1. Deri altı enjeksiyonları
    1. Yakalama ve hayvan (bölüm 4) uyutmak.
    2. Makası kullanarak enjeksiyon bölgesini tıraş. Pamuk sıçan kürk kalın ve enjeksiyonlar için pürüzsüz bir yüzey elde etmek için keskin bir düzeltici gerektirir. Bir pamuklu çubukla kullanarak% 70 etanol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin ve ilerlemeden önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
    3. Yavaş ve sürekli bir şekilde çizerek hücreleri ile yüklenebilir şırıngalar (29 g x 1/2 ", 0.3 ml) eklenmiştir. Kabarcıklar bazı kuvvet ile şırınga belirgin fiske iseniz. Kabarcıklar üst basarak kez sıvı kadar piston iğne üstünde olduğunu.
    4. (Cilt çadırlaşması olarak anılacaktır) enjeksiyon yerinde cilt kaldırın ve iğne konik tarafı yukarı yerleştirin. İğnenin kas enjekte önlemek için cilt altında serbestçe hareket edin.
    5. Eşit ve yavaş yavaş şırınga içeriğini boşaltınız. Aşağı iğne konik tarafı çekiniz.
  2. İntratümöral enjeksiyonlar
    1. Yakalama birhayvan (bölüm 4) uyutmak d.
    2. Bir pamuklu çubukla kullanarak% 70 etanol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin ve ilerlemeden önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
    3. Dik bir pozisyonda iğne tutarken yavaşça ve sürekli yukarı çizerek virüs inokulum ile yük şırıngalar (29 G 0.3 ml, '1/2 x). Kabarcıklar bazı kuvvet ile şırınga belirgin fiske iseniz. Kabarcıklar üst basarak kez sıvı iğne üstünde olduğu kadar, sonra Pistonun.
    4. Tümör içine iğne konik tarafı yukarı yerleştirin ve kısmen tümörün laserasyonunu önlemek için her hareketinden önce iğneyi çekilmesi, fan gibi desen iğne hareket ederken eşit ve yavaş yavaş şırınga içeriğini sınırdışı. Aşağı iğne konik tarafı çekiniz.
      NOT: Subkutan fazla tercih tümörler hızlı büyüyen 5-7 gün içinde yaklaşık 100 mm 3 ulaşan vardır. Ayrıca, nekrotik ve hemorajik merkezleri genellikle birkaç gün içinde tümörün yüzeyinde oluşan ve ca gerektirirreful izleme (Şekil 4).
  3. Periton içi enjeksiyonlar
    1. Yakalama ve hayvan (bölüm 4) uyutmak.
    2. Pamuklu çubuklarla kullanarak% 70 etanol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin ve ilerlemeden önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
    3. Yavaş yavaş ve sürekli yukarıya çizerek ilaç ile yük şırıngalar (29 G 0.3 ml, '1/2 x). Kabarcıklar bazı kuvvet ile şırınga belirgin fiske iseniz. Kabarcıklar üst basarak kez sıvı iğne üstünde olduğu kadar, sonra Pistonun.
    4. Karın sağ alt kadranda içine iğne takın. Kan ya da dışkı aspire değil emin olmak için tekrar pistonu çekin, bu iğnenin yanlış yerleştirme gösterir. Bu durum ortaya çıkarsa, iğneyi çıkartın ve yeni bir şırınga hazırlayın. İğne doğru yerleştirildiğinde, eşit ve yavaş yavaş şırınga içeriğini sınırdışı.

7. Tümör eksizyonu ve Nekropsi

  1. Toplayın ve al temizlemek% 70 etanol önce hayvanın ötenazi için birlikte l araçları.
  2. İstediğiniz yöntemle hayvan Euthanize, CO 2 inhalasyon (5-10 dakika / dak 2 L) tavsiye edilir. Vücut durumda herhangi bir anormallik için hayvan inceleyin.
  3. Bir diseksiyon gemide sırt yatma hayvan koyun ve% 70 etanol ile hayvan temizleyin.
  4. Alt karın cildi kaldırmak için cımbız kullanın. Makas kullanılarak deri ve kas yoluyla kesin ve hayvan uzunluğunu (çene anüs) çalıştıran bir medial kesi yapmak.
  5. İki kesim, yanal göğüs kafesi tarafı yukarı bir ve kalp ve akciğerler maruz sternum üzerinden bir yaparak göğüs kafesi kesin. Herhangi bir metastaz 27,29 akciğerin lobları inceleyin.
  6. Anormallikler için tüm organlarını incelemek ve renk, boyut ve tutarlılık içinde herhangi bir değişiklik kayıt. Gerekirse, iç dokuları incelemek için bir neşter ile organları insizyon. Özellikle, karaciğer, böbrekler, dalak ve mide yolu incelemek.
  7. Metastaz için lenf düğümleri kontrol edin ve 27,29 genişleme.
  8. Tümör toplamak için, cenah kesiler üstünde ve cilt cımbız ile vücuttan uzak çekilebilir şekilde tümör altında olun. Sıkıca cımbız ile cilt tutarken, dikkatli tümör ve dermis (Şekil 5) arasındaki keserek tümörü çıkarmak için bir neşter kullanabilirsiniz.
  9. Hemen% 10 nötr tamponlu formalin etiketli bir kap içinde tümör yerleştirin.
  10. Tümörün büyüklüğüne bağlı olarak, 1-2 gün izin (≤ 2 mm, küçük) ya da 5-6 gün histolojik analiz (Şekil 6) bölümler hazırlamadan önce sabitlemek için (> 2 mm geniş).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nedeniyle pamuk sıçanların son derece heyecanlı doğası, aşina olmak ve bir klinik öncesi hayvan modeli olarak kullanımı kolaylaştıracak hayvanların stresi azaltmak için optimize prosedürler kullanılarak için. Uygun kullanım tekniklerinin kullanımı da araştırmacı riskini en aza indirecektir.

Pamuk fareleri kullanırken sakin kalmak zorunludur. sıçanlar son derece heyecanlı ve onların kafesini kaçmaya çalışacaktır. Bir zenginleştirme tüpü ve kaçış girişimleri en aza indirecek nestlets kullanılm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Pamuk fareleri oldukça heyecanlıdır ve güçlü bir uçuş tepkisine sahiptir. Bu nedenle, hayvan üzerindeki aşırı stresi en aza indirmek için özel dikkat gösterilmelidir. Açıklanan kafes düzeni, zenginleştirme tüpünün yerleştirilmesi son derece önemli olmak üzere, hayvanların güvenli ve kolay bir şekilde yakalanmasına olanak sağlayacaktır. Kafesleri kurarken zenginleştirme tüplerinin boyut ve şekil gereksinimlerini karşıladığından ve kafese doğru yönde yerleştirildiğinden emin olun. Hayvan bakımına yardımcı olabilecek teknis...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu araştırmayla ilgili herhangi bir mali çıkar çatışması olmadığını kabul etmektedir.

Teşekkürler

Breanne Cuddington, Kanada Meme Kanseri Vakfı'ndan bir bursa sahiptir. Bu çalışma, Kanser Araştırma Derneği ve Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü'nden (eski adıyla Kanada Meme Kanseri Araştırma İttifakı) işletme hibeleri ile desteklenmiştir. LCRT hücreleri için Ann Tollefson'a (Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi) ve pamuk faresi muhafazası ve sedasyon konusunda teknik yardım için Dr. Kathleen Delaney ve Marion Corrick'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' S Orta Gibco11965-092Herhangi bir markayı kullanabilir 
1X Fosfat Tamponlu Salin ,
200 mM L-glutaminGibco'yu25030164Herhangi bir marka
100x Antibiyotik-Antimikotik  Gibco15240-062Herhangi bir marka
Fetal sığır serumuQuality Biological Inc. kullanabilir.110-001-101HIHerhangi bir marka
T-150cm 2< / sup> doku kültürü şişesiFisher Scientific14-826-80Herhangi bir markayı kullanabilir
1X TypLE ExpressLife Technologies12604-013
12 oyuklu hücre kültürü plakası, düz tabanlıFisher Scientific08-772-29Herhangi bir markayı kullanabilir, doku kültürü ile muamele edilmiş
olmalıdır alamarBlueLife Hücrecanlılığının belirlenmesi için alternatif bir reaktifDAL1025
Teknolojiler 8640 Teklad 22/5 Kemirgen diyetiHarlan 8640
1/8" mısır koçanı kemirgen yatağıHarlan7092
NestletsAncare-Hamurhaline getirilmiş işlenmemiş pamuk lifinden yapılmış, tozsuz ve otoklavlanabilir
50 mL Konik tüplerFisher Scientific14-432-22Herhangi bir markayı kullanabilir, steril olmalıdır
İzofluran USP, %99,9, inhalasyon anestezikPharmaceutical Partners of Canada Inc.M60302
%70 EtanolLaboratuvarda hazırlayabilir
%10 Nötr Tamponlu FormalinSigma-AldrichHT501128Herhangi bir markayı kullanabilir
NAPCO NapFlow 1200 Sınıf II A/B3 Biyogüvenlik Mikrobiyolojik Güvenlik Kabini (hücre kültürü başlığı)NAPCOModeli kullanılmış şu anda mevcut değilHerhangi bir markayı kullanabilir
Thermo Fisher Scientific Hassas Isıtmalı SuBanyosu Fisher Kullanılan BilimselModel şu anda mevcut değil Herhangi bir markayı kullanabilir
[header]
Reichert Parlak Çizgili HematitometreSigma-AldrichZ359629Herhangi bir markayı kullanabilir
Typhoon Trio BioAnalyzer Kullanılan GE Healthcare Yaşam BilimleriModeli şu anda mevcut değil Herhangi bir floresan plaka okuyucu kullanabilir
Tecan Safire2 Çok Algılamalı Mikroplaka OkuyucuTecanModeli kullanılmış şu anda mevcut değil Herhangi bir floresan plaka okuyucu kullanabilir
Allegra 6R tezgah üstü santrifüjBeckman Coulter366816Herhangi bir markayı kullanabilir
Masa Üstü Anestezi makinesiVetEquipModeli şu anda mevcut değil Herhangi bir markayı kullanabilir, taşınabilir olmalıdır
Wahl Fıstık Mini MakasıWahlHerhangi bir marka küçük makas kullanabilir
İnsülin şırıngaları 29 G x 1/2', 0,3 mLBD329464Herhangi bir markayı kullanabilir. İnsülin şırıngaları, sıçan yoluyla enjeksiyonları daha kolay hale getirdikleri için önerilir Sert cilt. 
Pamuklu çubuklarMedPro018-425Herhangi bir markayı kullanabilir
Keskin Uçlu Diseksiyon MakasıFisher Scientific8940Herhangi bir markayı kullanabilir
Diseksiyon Doku ForsepsFisher Scientific13-812-41Herhangi bir markayı kullanabilir
Laboratuarda hazırlayabilir sterilize etmek için filtreleyebilir kullanabilir

Kaynaklar

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123(2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Pamuk S an Tutma ve Ta maOnkolitik ViroterapiPreklinik De erlendirmeHayvan Stresinin Azalt lmasZenginle tirme T p Y ntemiAnestezi nd ksiyon OdasT m r H cresi EnjeksiyonuSubkutan T m r Olu umuntrat m ral Enjeksiyonntraperitoneal Enjeksiyon
Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.