Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Özet

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Özet

elektriksel uyarıların içine ışık dönüşümü dış retina oluşur ve çubuk ve koni fotoreseptör ve retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından büyük ölçüde gerçekleştirilir. RPE fotoreseptör ve ölüm ya da RPE hücrelerinin disfonksiyonu yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), insanlar yaş 55 ve üzeri kalıcı görme kaybının önde gelen nedeni karakteristik için kritik destek sağlamaktadır. AMD için bir tedavi tespit edilmiş olmakla birlikte, hasta göze sağlıklı RPE implantasyonu etkili bir tedavi olduğu ortaya çıkabilir ve RPE hücreleri, çok sayıda hali hazırda, pluripotent kök hücreleri elde edilebilir. RPE hücre teslim ve güvenliğine ilişkin birçok ilginç sorular hala hayvan modellerinde incelenebilir ve RPE enjekte için kullanılan kabul görmüş protokoller geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknik çeşitli çalışmalarda çoklu gruplar tarafından kullanılan ve ilk keskin iğne ile göz delik oluşturarak içerir. Bir blu ile daha sonra bir şırıngaHücre yüklü nt iğne deliğinden sokulur ve hafifçe RPE temas edene kadar vitröz geçirilir. Nispeten basittir ve çok az ekipman gerektirmektedir, bu enjeksiyon yöntemi kullanarak, hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu önemli miktarda önleyen ana RPE arasında kök hücre türetilmiş RPE hücreleri, tutarlı ve etkili bir entegrasyon sağlamak. Gerçek protokolünün bir parçası değildir, biz de enjeksiyon, ve nasıl hücreler in vivo görüntüleme yöntemleri kullanarak subretinal boşluğa enjekte edildi doğrulamak için neden olduğu travmanın boyutlarını belirlemek için nasıl açıklar. Son olarak, bu protokolün kullanılması RPE hücreleri ile sınırlı değildir; Bu retina altına doğru herhangi bir bileşik ya da bir hücre enjekte etmek için kullanılabilmektedir.

Giriş

Duyusal retina, nöronların, gliaların ve endotel hücrelerinin fonksiyonel katmanlarında düzenlenmiştir. Retinanın arkasındaki fotoreseptörler ışıkla aktive edilir; Fototransdüksiyon yoluyla fotonları, internöronlar tarafından rafine edilen ve beyindeki görsel kortekse iletilen elektrik sinyallerine dönüştürürler. Fototransdüksiyon, Mueller glia ve retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin koordineli çabaları olmadan gerçekleşemez. RPE, fotoreseptörlerin hemen arkasında tek bir tabaka halinde düzenlenir ve fotoreseptör fonksiyonu ve homeostazın ayrılmaz bir parçası olan çoklu ve çeşitli işlevleri yerine getirir. Aslında, RPE ve fotoreseptörler o kadar birbirine bağımlıdır ki, tek bir fonksiyonel birim olarak kabul edilirler. RPE'nin ölümü veya işlev bozukluğu, fotoreseptörler üzerinde yıkıcı ikincil etkilere neden olur ve yaşlılarda körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkilidir^1,2.

AMD için herhangi bir tedavi keşfedilmemiş olsa da, birkaç klinik çalışma RPE hücre replasmanının umut verici bir terapötik seçenek olabileceğini göstermiştir^3-13. Kök hücre teknolojisinin ortaya çıkmasıyla birlikte, fonksiyonel ve anatomik olarak somatik muadillerine güçlü bir şekilde benzeyen embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hES ve hiPS) in vitro olarak çok sayıda RPE hücresi üretmek artık mümkündür^14-26. Kök hücre kaynaklı RPE'nin, spontan retina dejenerasyonu olan sıçan ve fare hatlarında retina dejenerasyonunu önemli ölçüde yavaşlatmak için bizimki de dahil olmak üzere birçok bağımsız grup tarafından in vivo olarak işlev gördüğü gösterilmiştir^{16,18,21,22,25,28,29}. Klinik ve klinik öncesi destekleyici kanıtların bu kombinasyonu o kadar ikna edicidir ki, kök hücre türevli RPE hücreleri kullanılarak retina dejenerasyonunu önlemek için çeşitli klinik çalışmalar şu anda devam etmektedir^30,31.

RPE, hES ve/veya hiPS'den kolayca türetilebilir ve çeşitli türetme ve enjeksiyon teknikleri kullanılarak kemirgenlerin subretinal boşluğuna implante edilebilir^32,33. (Kullandığımız yönlendirilmiş farklılaşma protokolünü gösteren multimedya formatında bir yöntem belgesi için Westenskow ve ark.'ya bakınız)³⁴. İmplantasyon üzerine eksojen olarak verilen RPE hücrelerinin güvenliği, sağkalımı ve fonksiyonel kapasitesi ile ilgili kritik sorular vardır, bu nedenle kemirgenlerde subretinal enjeksiyon yapma yeteneği kritik bir beceridir^{16,18,21,29,36,37}. RPE'nin verilmesi önemsiz değildir ve alan en etkili enjeksiyon tekniğine bölünmüştür. Burada tanımladığımız protokol, RPE hücrelerinin bolusunu subretinal olarak vermenin basit ve etkili bir yoludur ve kök hücre kaynaklı RPE transplantasyonu için ilk klinik çalışmada kullanılmıştır³¹. (Okuyucu ayrıca Eberle ve ark. kemirgenlerde subretinal enjeksiyonların alternatif bir tasviri için. ³⁸)

Bu yazıda özetlenen teknik görselleştirilemez ve travma kaçınılmazdır (herhangi bir subretinal enjeksiyon tekniğinde olduğu gibi). Limbus damarlarının hemen altında bir delik açılarak ve taban tabana zıt retinanın altına bir hücre bolusu enjekte etmek için transskleral bir yol boyunca künt bir iğne sokularak gerçekleştirilir. Enjeksiyonu yapan kişi, künt iğne retinaya temas ettiğinde direnç hissedecektir. Bununla birlikte, hücreler enjeksiyondan sonra doğrudan görüntülenebilir ve indüklenen retina dekolmanı derecesi, RPE hücrelerinin geçici bir floresan işaretleyici ile işaretlenmesi ve bunların bir konfokal taramalı oftalmoskop (cSLO) ile tespit edilmesiyle belirlenebilir. Travmayı izlemek ve enjeksiyon bölgesini kolayca tanımlamak için bir optik koherens tomografi (OCT) sistemi de kullanılabilir.

Protokol

NOT: Tüm hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallara uygun olarak tedavi edildi.

Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1. (~ 20 dk)

1. Ön sıcak hücre ayrışma çözeltisi (tercihen serumu ile seyreltme yoluyla durdurulmuş olduğu bir), steril PBS ve kültür ortamı (Tablo 1).
2. Demontaj ve 15 dakika için su içinde parça kaynatılmasıyla bir kör iğne ile şırınga sterilize edin.

Enjeksiyon için RPE Hücreler 2. Hazırlık (30 dakika saat 1)

1. 37 ° C'de 5-8 dakika boyunca ön ısıtılmış hücre ayrışma çözeltisi kullanılarak RPE hücreleri ayırmak.
2. Hala bağlı olduğu herhangi bir serbest bırakmak için hafifçe kazıyın hücreleri.
3. Kültür ortamı büyük bir hacmi (15 ml tüp doldurmak) ayrışma çözümü inaktive ve onları saymak hücreleri seyreltin.
4. Pelet hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
5. Steril, önceden ısıtılmış PBS / ml 200,000 hücreleri (0.5 ul hacim içinde 100,000 hücre sağlamak için) hücreleri yeniden süspanse edin ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine transfer edin.
6. İsteğe bağlı olarak, bir canlı hücre geçici floresan markörü ekleyebilir ve 30-45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
7. Hücrelerden 0.5 ul, kör bir iğne şırınga yerleştirin. Kısa sürede hücreleri enjekte edilir.

3. Alt-retinal Enjeksiyon (~ Enjeksiyon başına 5 dakika)

NOT: Mümkünse Limbustan damarları görselleştirmek için çok daha kolay olduğundan, erişkin albino sıçanlar ile tekniğini öğrenmek. Daha kolay enjeksiyon yerinde görülmesini kolaylaştırmak için (hücreleri enjekte denemeden önce) öğrenme sırasında Hızlı Yeşil çözüm enjekte edilir.

1. Kemirgen anestezisi. 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin (20 ul / 10 g vücut ağırlık intraperitoneal enjeksiyon kullanınizofluoran inhalasyon üzerinde sekiz) bu kemirgen manevra ve inhaler içinde burnu ile göz içine enjekte etmek zor olduğundan.
   1. Hayvan derinden pençeleri birini kısma anestezi emin olun. O geri çekildiğinde ise, birkaç dakika daha bekleyin ve subretinal enjeksiyon başlamadan önce tekrar deneyin.
2. Enjekte edilecek göz tavan bakacak şekilde onun yüzüne kemirgen yerleştirin.
3. Göz soketi (geçici propitozisin) biraz dışarı açılır ve sadece kulak üstünde ve çene ile ve yavaşça göz kapaklarının deri paralel germek iki parmak ile başını tutarak daha erişilebilir hale böylece mikroskop altında cildi nazikçe germek çok göz hafifçe soketten açılır ki (Şekil 1C bakınız). Boğaz çok yakın kemirgen tutmayın.
4. 30 G keskin tek ön-sterilize iğne ile, gemiler isabet eğer, kanama olacak b (hemen limbusun altında bir delik yapmakönemli e ve daha sonra delik bulmak zor olabilir) ve bir açıyla iğne (Şekil 1D) ile lensi dokunmamak için. Meydana gelecek keskin (ya da künt) iğne veya acil katarakt oluşumu ile lensi dokunmaktan kaçının.
   NOT: Enjeksiyon iki kişi ile daha iyi çalışır. Bu şekilde bir kişi onlar delik olduğu odaklanmak korumak için keskin tek iğne ile ilk delik oluşturduktan sonra enjeksiyon yapan kişiye künt iğne ile şırınga iletebilirsiniz.
5. Kafasına kavrama korurken göz atılabilir keskin iğne geri çekin. Delik tam olarak nerede unutmayın.
6. Ya bir micromanipulator bir künt bir iğne ile ön-yüklü şırınga montaj veya elle tutarak, lensi dokunma ve hafifçe göz aracılığıyla itmek için değil yine dikkat çekici, delikten künt iğne ile şırınga ucu ekledikten sonra çok yavaşça duygu direnci (Şekil 1D) kadar.
7. Kminimumda tüm hareketleri eeping, dikkatle yavaş yavaş subretinal boşluğa RPE hücreleri enjekte.
   NOT: RPE / retinanın ayrılması bağlı olacak; Bu kaçınılmazdır. Bununla birlikte, daha temiz bir enjeksiyon dekolmanı en aza indirir ve büyük ölçüde yeniden takılması (Şekil 1E) şansını arttırır. Herhangi abartılı hareketler retina geri iğneyi hareket edebilir, ve yanlara hareketler retinaya zarar edebilirsiniz. bir enjeksiyon pompasının kullanılması isteğe bağlıdır fakat çok hassas bir teslimat sağlar.
8. Yavaş yavaş şırınga geri çekin. Göz nemlendirici uygulayın hidrate göz tutmak düşer.
9. Sternal yatma kavuşur kadar hayvan izlemeye devam edin. Gözetimsiz bırakmayın hayvan veya sternum yatma kavuşur kadar diğer uyarı hayvanlarla bir kafes iade etmeyin.

Sonuçlar

Biz bu yazıda anlatılan tekniği kullanarak hızlı ve tutarlı kemirgenler subretinal boşluğa RPE hücrelerinin bir süspansiyon sunabilirsiniz. Gerekli olmamakla beraber, travmalar büyük ölçüde Şekil 1A ve B, bir mikromanipülatör ile gösterilen düzeneği kullanılarak en aza indirilebilir. Geçici propitozlar Şekil 1C'de gösterildiği gibi, kemirgen tutun. mikromanipülatör veya elle yapıldığı takdirde adımlar aynıdır; Bu Şekil 1D karikatür tasvir edilir. Etiketli RPE hücrel...

Tartışma

Bu yazıda sıçanlarda ve farelerde süspansiyon RPE hücrelerinin subretinal enjeksiyonları gerçekleştirmek için nispeten basit bir yöntem tarif. protokol az travmalarda tercüme edecek tekniği ile öğrenmesi kolay ve daha deneyim (Şekil 3, bu iyi enjeksiyon birini temsil) bir mikromanipülatör (Şekil 1A) kullanıldığında, özellikle. Herhangi bir travma, bir cSLO ve Ekim sistemi (Şekil 2) varsa in vivo izlenebilir. Yüksek çözünürlük ve daha az gürültülü görüntüler ist...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-Merkaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Hücre Görüntüleyiciler	VWR	89260-222	Kasa x 1
CellTracker Yeşil CMFDA	Moleküler Problar	C34552	50 & mikro; g x 20
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Hızlı Yeşil	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Jel Damlalar Orta ila Şiddetli Kayganlaştırıcı Göz Damlası	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Şırınga x 1
Hamilton İğne 33 G, 0.5", nokta 3 (304 paslanmaz çelik)	Hamilton	7803-05	İğneler x 6
Nakavt DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Değiştirme	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamin 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Manyetik Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Mikromanipülatör	Leica Biosystems	3943001	Manipülatör x 1
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
İğnesiz Kayar Uçlu Şırınga BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Paketi x 1
Özel Kullanım İğneleri BD  (30 g, 1 inç)	VWR	BD305128	Kutusu x 1
TripLE Ekspres Enzim (1X), fenol içermeyen kırmızı	Gibco	12604013	100 ml x 1