Yöntem makalesi

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

DOI:

10.3791/52307

⸱

18 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar. Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir. Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastaya özgü hücre dizilerinin oluşturulması, tanısal veya translasyonel araştırmalar için paha biçilmez bir araçtır ve bu hücreler, hastanın tanısal incelemesi sırasında mevcut olan deri veya kas biyopsi dokusundan toplanabilir. Bu protokolde, primer hücre kültürü için küçük miktarlarda kas veya cilt dokusundan canlı hücre izolasyonu için bir teknik tarif ediyoruz. Ek olarak, birincil hücrelerden miyojenik hücre hatlarının ve fibroblast hücre hatlarının ölümsüzleştirilmesi için bir teknik sunuyoruz. Hücre hatları ölümsüzleştirildikten sonra, hastadan türetilen hücrelerin önemli ölçüde genişlemesi sağlanabilir. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, ilaç taraması ve genetik mutasyonun in vitro düzeltmesi dahil olmak üzere birçok alt uygulamaya uygundur. Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler tanı son 20 yılda önemli ölçüde gelişti. Genomik DNA artık rutin olarak balgam veya yanak sürüntüsünden izole edilirken, geçmişte kan alımı gerektiriyordu. Mevcut hızlı geri dönüş süresi ve gen diziliminin kolaylığı sayesinde, birçok hastalık mutasyonu ek testlere gerek kalmadan rutin olarak tanımlanmaktadır. Kas hastalığı teşhisi söz konusu olduğunda, son on yılda kas distrofisi veya miyopatiden sorumlu düzinelerce yeni genin tanımlanması, bu hastalıkların teşhis edilme şeklini önemli ölçüde değiştirmiştir 1,2. Şu anda, kas distrofisi ve konjenital miyopatinin nedenleri olarak tanımlanan düzinelerce gen vardır, ancak bu genlerin çoğunun hastalık ürettiği mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Özellikle, nadir hastalıklar hasta popülasyonlarının küçüklüğü nedeniyle bir zorluk teşkil etmektedir. Bu vakalar için olduğu kadar, daha yaygın hastalıklar için de, terapötik ilaçların patogenez mekanizması ve taranması ile ilgili çalışmaları kolaylaştıran stabil araçların üretilmesi oldukça arzu edilir.

DNA teşhisindeki dramatik ilerlemeye rağmen, primer metabolik veya kas hastalığından şüphelenilen birçok hastada primer tanıyı koymak için kas biyopsileri hala yapılmaktadır. Kas biyopsisi gerektiğinde, hasta için minimum ek morbidite riski ile ek tanı ve araştırma dokusu toplanması için fırsat sunar. Her doku örneği için bir dizi kullanım olduğundan, basit, verimli ve minimum miktarda doku gerektiren cerrahi doku kullanılarak birincil hücre kültürü için tekniklerin oluşturulması oldukça arzu edilir. Primer hücrelerin dokudan izolasyonunu ve canlı materyalin uzun süreli depolanmasını en üst düzeye çıkarmak için kas veya deri biyopsilerinin uygun triyajı gereklidir. Ek olarak, kök hücre araştırmaları ve ilaç taraması, hücre bazlı tahliller kullanarak birçok hastalık için tedavi geliştirmek için büyük umut vaat etmektedir 3,4.

Burada, insan kası veya deri biyopsilerinden birincil hücre izolasyonu için yöntemleri açıklıyoruz. Ek olarak, bir bireyden çok sayıda hücre üretmek için yararlı olan miyojenik hücrelerin ölümsüzleştirilmesi için bir protokol ekliyoruz. Bu hücreler, birincil dokudan elde edilen genel düşük hücre sayısı ile elde edilemeyen özel ilaç taramaları gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: insan dokusunun toplanması için protokoller gözden ve Kurumsal IRB komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Atılan, de tanımlanan insan dokusunun Koleksiyon Boston Çocuk Hastanesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi IRB Komiteleri tarafından onaylandı. Aşağıda tarif edilen yöntemler de tanımlanan gelen miyojenik hücre izolasyonu için uygulanmış olan, doku atılır. Tarif edilen yöntemler, razı hasta materyalinin toplanan dokuya uygulanabilir.

1. Hücre İzolasyonu

  1. Kas biyopsisi ve kas hücrelerinin saflaştırılması Ayrılma
    1. Doku miktarını hesaplamak için kas biyopsisi içeren plaka tartılır ve sonra tekrar ayrıldığı için, bir doku kültürü biyo-güvenlik başlığı içinde bir 10 cm doku kültürü plakası önceden ağırlık, vb.
    2. Ince steril neşter, kıyma kas dokusu kullanılarak ve kurumasını önlemek için doku steril 1x HBSS birkaç damla ekleyin.
    3. 3.5 ml di her ekleSpase II ve kas dokusu gramı başına kolajenaz D ile sindirilmiş olan. Bir steril 25 ml pipet ile birkaç kez kıyılmış doku ve enzim çözeltisinin Pipet. 15 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe ve bulamaç kolayca steril 5 ml pipet da geçene kadar doku sindiremez.
      Not: Doku ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Ek ayrıntılar için 'Temsili Sonuçlar' bölümüne bakınız.
    4. 329 xg (~ 1,100 rpm) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 ml'lik bir konik tüp ve topak hücreler üzerinde 100 um hücre süzgecinden ayrışmış dokunun, filtre edin steril büyüme ortamı 2 hacim ekleyin. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız.
    5. Steril büyüme ortamı içinde 1 hacim pelet yeniden süspanse edin ve 7 hacim alyuvar lisiz çözeltisini ekleyin. 40 mikron hücre süzgecinden çözüm Filtre, ardından t pelet329 x g hızında 10 dakika, oda sıcaklığı için de hücreler.
    6. Bir hemositometrede hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / 100 ul bir konsantrasyonda 1x HBSS,% 0.5 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir kenara koyunuz ~ negatif (lekesiz) kontrol olarak kullanılacak bir tek tüp içinde 250,000 hücre. FACS sıralama tarafından CD56 pozitif hücrelerin düzgün yolluk için gerekli propidium iyodür ve CD56 için kenara ek tek renkli lekeli kontrol tüpleri, ayarlayın. Sıralama kılavuzları hücre veya uygun kontrolleri sağlamak için çekirdek tesis uzmanları sıralama FACS dahil danışmak bakınız.
    7. Leke hücreleri, anti CD56 antikoru 5ul / 10 6 hücreleri ile sıralanacak. 30 dakika boyunca buz üzerinde (kontroller dahil) örnekleri inkübe edin.
    8. 10 mi 1 x HBSS içinde yıkayın örnekler ve pelet hücreleri soğutmalı santrifüj 329 xg (~ 1,100 rpm) 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika karıştırıldı.
    9. Sor için örnek 1 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür eklemeÖlü hücrelerin dışlanması için ted. Floresan aktif hücre sıralayıcı kullanılarak olmayan Miyojenik hücrelerden myojenik CD56 pozitif hücreler arındırın.
  2. Cilt biyopsisi ayrışma
    Not: kas biyopsilerinde, mevcut olmadığında, dermal fibroblastlar hastadan bir deri zımba izole edilebilir. Dermal fibroblastlar miyojenik hücre elde etmek amacıyla MyoD transdüksiyon dahil olmak üzere birçok çalışmaları için malzeme olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, dermal fibroblastlar, ileri çalışmalar için çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir iPS hücrelerini üretmek için kullanılabilir.
    1. Ulaşım ortamında laboratuvara deri biyopsisi taşıyın. Numune alındıktan sonra, en kısa sürede temel kültürünü gerçekleştirmek. Birincil kültür aynı gün tesis edilemez ise, oda sıcaklığında gece boyunca örnek saklayın.
    2. Laminer akış başlığı içinde steril bir 35 mm'lik petri deri biyopsisi aktarın.
    3. Steril 1 ile bir petri çanağı içinde deri biyopsisi durulayınx PBS kan ve enkaz kaldırmak için. Steril bir bisturi ile yağ dokusu çıkarın.
    4. 2 ml kollajenaz solüsyonu eklenir ve neşter ile dokusunu inceltmek, doku boyutuna bağlı olarak 1 saat ile 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. , 15 ml konik tüp ile sindirilmiş doku transferi iki fibroblast kültür ortamına 2 ml petri durulama ve aynı tüp içerisinde ortam toplanır.
    6. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle 200 x g'de topak hücrelere.
    7. Süpernatantı atın ve sonra tekrar, pelet hücreleri kollajenaz çıkarmak için fibroblast orta 3 ml pelet yıkayın. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız.
    8. Adım 1.2.7 kez daha tekrarlayın.
    9. Bir T25 steril doku kültürü şişesi üzerine 5 ml fibroblast orta ve plaka hücrelerinde pelet yeniden askıya. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir balon içinde inkübe edin.
    10. Önümüzdeki 1-3 gün içinde fibroblast eki ve büyüme için kültür değerlendirin.
      Not: Bazı küçük doku parçaları da plaka takmak olabilir ve fibroblastların bu doku parçaları dışarı göç.
    11. Fibroblastlar, yaklaşık% 80 konflüense kadar büyütülür kadar aynı koşullar altında kültür muhafaza edin.
    12. Tripsinizasyon ile fibroblastlar toplayın ve ek genişleme için taze kültür şişeler üzerine aktarın. Ca ++ ve Mg ++ serbest Kültürlerin 1x PBS içinde 3 kez yıkanarak trypsinization gerçekleştirin. 37 ° C'de 2 dakika için bir hücre (2 ml / T25 şişesi) ile Tripsin-EDTA (bakınız Materyaller Tablosu) ekleyin.
    13. Ek şişeler içine müstakil hücreleri bölün. Bazı doku parçaları orijinal T25 şişeler bağlı kalırsa, bu şişeye 5 ml taze kültür ortamı ekleyin ve daha fibroblastlar sürekli dışarı göç edecek.
      NOT: Genişletilmiş fibroblast kültürü P1 dondurulur ve gelecekteki deneyler için sıvı azot içinde saklanır.

AndMyogenic Hücreler 2. Ölümsüzleştirme

  1. , gece boyunca 4 oranında DMEM ve Medium 199 içinde 10 cm uzunluğunda bir steril doku kültür plakasında Levha 5000000 Phoenix ekotropik paketleme hücreleri (PE):% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1.
  2. 10 mM kafein ile desteklenmiş taze ortam 5 ml transfeksiyondan 30 dakika önce besleme hücreleri.
  3. Midi hazırlık (CDK4 veya hTERT plazmid) ve PolyJet plazmid DNA 2 ug homojen bir karışım ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Gecede PE hücrelere plazmid / polyjet karışımı ekleyin.
  5. Taze ortam ile besleme hücreleri (DMEM ve 4 arasında bir oranda orta 199:% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1). Oniki saat sonra, virüs içeren süpernatan toplamak ve 0.45 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ediniz.
  6. (G41 gece boyunca amfotropık paketleme hücre hattı PA317 5 enfekte süpernatan 1 ml kullanın ve ya 0.5 mg / ml neomisin ile seçildikten sonra stabil bir virüs üreten hücre hattı elde edilir8) CDK4 veya 0.5 mg / hTERT için higromisin ml.
  7. Sonra üç hasat için süpernatant her sabah, akşam ve sabah hasat, yakın konfluansa stabil ambalaj hücreleri büyüyerek viral üst fazlar çalışma hazırlayın.
  8. Viral süpernatanların, filtre edin ve doğrudan daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de 1 ml'lik numuneler ve deposuna kullanan ya da bölün. Viral süspansiyon her dondurulup çözülerek% 50 enfeksiyonu verimlilik kaybeder unutmayın. Ağartıcı yıkama viral parçacıkların dokundu her şeyi atmadan önce unutmayın.
    Not: kararlı PA317 virüs üreten hücre çizgisi dondurulmuş ve kalıcı depolama için -150 ° C 'de muhafaza edilebilir (orta dondurma,% 10 DMSO,% 90 serum).
  9. Plaka, FACS ile saflaştırılmış miyojenik hücre / göz% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6-çukurlu levhalarda 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda (1.1-1.9 adımlarda tarif edilmiştir). Hücreler viral enfeksiyon geçmeden önce plaka takılı olduğundan emin olun.
  10. F, süzülmüş 400 ul eklereshly gece boyunca (kontrol olarak 2 kuyu tutun) her biri altı plaka viral süpernatan ya da dondurulmuş alikotları üretti.
  11. 2.5 ml / oyuk taze kas madde (4 hücrelerin beslenmesi ile orta değiştirin: 0.02 M HEPES tamponu, 1.4 mg / L Vitamin B12,% 15 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş 1 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve Medium 199 0.03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / L, deksametason, 2.5 ug / L hepatosit büyüme faktörü ve 10 ug / L, temel fibroblast büyüme faktörü). Bir ağartıcı kap içinde viral partikülleri ihtiva eden ortam ve pipet atın. 3 gün sonra enfeksiyon kurtarmak 400 ug / ml neomisin (CDK4'ün enfeksiyonu) veya 300 ug / ml higromisin (hTERT enfeksiyonu) kullanarak seçimi için tedavi için aynı ortamda hücreleri bırakın.
  12. Kontrol çanak kalıp hücrelerin (1-2 hafta) kadar ilaç seçimi altında hücreleri koruyun.
  13. Hatta selecti sırasında; (EDTA tripsin% 0.05 ile% 60-80 confluency) Geçiş hücreleri birleşik haline gelmeden öncedönemi. Seçim ilaç ile desteklenmiş taze miyoblast ortamı ile birden çok 10 cm tabaklarda Replate hücreleri (2.11 tarif edildiği gibi). Heterojen bir nüfus olarak ölümsüzleştirdi seçilen hücreleri korumak veya tamamen homojen genetik geçmişini (her hücrede transgenin aynı ekleme) elde etmek klon.
  14. Aşağıdaki adımları kullanarak klonal seçim yapın:
    1. Küçük koloniler (10-20 hücreleri) oluşana kadar, düşük yoğunluklu (örneğin 10 cm yemekleri 300 ile 500 hücreler) hücreleri Tohum ve yaklaşık iki hafta boyunca onları korumak.
    2. Kurumasını hücreleri önlemek için sadece ince bir film bırakarak, bu noktada sıvı ortamı en iyi çıkarın.
    3. (Bir ucu silikon vakum yağ batırılmış) ile istenen her klon üzerinde klonlama halka yerleştirin ve tripsin / EDTA birkaç damla ekleyin.
    4. Hasat hücreleri dikkatli bir 1 ml ucu veya Pasteur pipeti kullanarak hücrelerin aspire ve en küçük multiwell pla aktararak yuvarlak hale kezte (96 ya da 48, 24 ya da 12 havuzlu plakalar).
    5. Yerel confluency önlemek için gerektiği gibi klonlar genişletin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 birincil doku ayrışma yer alan önemli bazı adımlar göstermektedir: dokusunun tam miktarı (Şekil 1A, B) steril doku kültürü petri tartılır. Doku bulamaç (Şekil 1C, D) elde edilinceye kadar Doku daha sonra ince steril neşter kullanılarak çekilir. Sindirim enzim ilavesinden sonra, primer kas dokusu ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Doku sindirimi ilerlemesi tipik Overdigestion ve hücre ölümünü önlemek için her 15-20 dakika...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Faydalı Kaynak olarak Hücreler

Hastalığın in vitro modellerde veya hastalık fenotipleri kurulurken miyojenik hücre popülasyonlarının izolasyonu ve kültürü son derece yararlıdır. Burada anlatılan Miyojenik hücre izolasyon prosedürü sonra, yayılır farklılaştırılmış, ya da hemen analiz edilebilir iskelet kas örneklerinde, gelen miyoblastların ve fibroblastların izolasyonu sağlar. Miyoblast yapısı ve fonksiyonu, hücre yaşamda kalması, hücre füzyonunun değerlendirilmesi değerlendirilmesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayın, bir Association Contre Les Myopathies (AFM) hibesi olan Cure CMD (proje 16297) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe numaraları K08 AR059750, L40 AR057721 ve 2R01NS047727) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman
Dokusu  kültür biyogüvenlik davlumbazıBaker Company, Inc.Model SterilGuard Hood
Tezgah üstü santrifüj, örneğin Beckman Modeli Beckman CoulterModel Allegra 6RHücre ayıklaması yapılacaksa, soğutmalı bir santrifüj tercih edilir
MikroskopNikonModel Eclipse TS100
Doku kültürü inkübatörü, bir CO2 kaynağına bağlıkaynak Forma Scientific Seri II
Floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı (FACS)Becton DickinsonModel Aria
Primer miyoblastların dokudan
Dispas IIRoche Uygulamalı Bilim#04942078001D 'de 2.4U/ml'lik bir çorap çözeltisi hazırlayın
;Roche Uygulamalı Bilimler#08888200110 mg/ml
1x Steril Hank'lik bir stok çözeltisi hazırlayın s Dengeli Tuzlu Çözelti (HBSS), kalsiyum ve magnezyum içermezGIBCO Life Technologies# 14185-052
Sığır serum albümini, fraksiyon VSigma# 05470FACS sıralaması için 1X HBSS% 0.5 BSA'lık steril ve nbsp; bir çözelti hazırlayın
Miyoblastlar için steril büyüme ortamı: Dulbecco' s Modifiye Kartal' % 30 fetal sığır serumu ile desteklenmiş yüksek glikozlu (4.5 g) s Orta (DMEM)GIBCO Life Technologies11965-092L-glutamin
RBC lizis çözeltisiQiagen158904
Propidium İyodür stoğu 10mg / mlSigmaP4170Tozu steril damıtılmış suda seyrelterek stok çözeltisini hazırlayın
Akış sitometrisi için anti-insan CD56antikoru Biolegend318310APC konjuge antikor, diğer etiketler mevcuttur
Primer miyoblastların
Ekotropik paketleme hücre hattı PECell BiolabsRV-101
Amfotropik paketleme hücre hattı PA3174Cell BiolabsRV-102
Domuz derisi jelatinSigmaG1890-500gSuda% 0.1 jelatin içeren bir stok çözeltisi hazırlayın. Çanağı 37 ° C'deki çözelti ile kaplayın; Bir saat boyunca C. Çözeltiyi çıkarın ve orta ekleyin.
PolyJet SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
mCDK4 ve hTERT içeren pBabe plazmitleriticari olarak mevcutStadler ve diğerleri, 2013
Qiagen plazmid midiprep kitiQiagen12143
Orta 199Yaşam Teknolojileri Orta 199 (31150022)
Dulbecco' s modifiye Eagle medium (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)Karışım 4:1 DMEM:199
Miyoblast büyüme ortamı: 4:1 Dulbecco' % 15 fetal sığır serumu ile desteklenmiş modifiye edilmiş Eagle medium (DMEM) ve Medium 199; 0,02 M HEPES tamponu; 1.4 mg/L B12 vitamini; 0.03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / L deksametazon, 2.5 & mu; g / L hepatosit büyüme faktörü ve 10 μ g/L beta fibroblast büyüme faktörü.Yaşam teknolojisi (DMEM, F199); Atlanta Biyolojik (FBS); İnvitrojen (Hepes); Fisher (Çinkosülfat); Sigma (Vit.B12, deksametazon); Chemicon uluslararası (HGF); Biyoöncü (betaFGF) #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). Ortam ve stok çözeltisi hazırlayın Vit. B12 (20mg / ml); Çinko Sülfat (60 & mikro; g/ml); Dex (55&mikro; g/&mikro; l) daha kolay kullanım için ayrı ayrı. HGF stok çözeltisi (5 & mikro; g / ml) ve FGF (20 & mikro; g / ml) son çalışma konsantrasyonunda her hafta taze olarak eklenmelidir.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
İmmün boyama için miyozin ağır zincir antikoruGelişimsel Hibridoma BankasıMF20Klonu MF20
Desmin İmmün boyama için AntikorThermo ScientificMS-376-S0Klon D33
At serumuInvitrogen26050-088
Primer cilt fibroblast izolasyonu için reaktifler
Taşıma ortamı: %10 fetal sığır serumu ve %0.2 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640RPMI ortamı 1640: GIBCO Yaşam Teknolojileri11875-093
İnsan primer fibroblast kültür ortamı: %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640Fetal sığır serumu: Thermo ScientificSH30071.03
Kollajenaz çözeltisi: 12.5 ml fibroblast kültür ortamında yeniden süspanse edilmiş ve filtre ile sterilize edilmiş kollajenaz tip 2 (100 mg)Worthington4176
Steril 1X Fosfat Tampon Salin (PBS) kalsiyum ve magnezyum içermezLonza17-516F
Primer miyoblastların
50 ml ve 15 ml steril konik tüplerGeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 mi); C3394-1 (15 ml))
Steril neşterlerAspen Surgical372610
HemositometreHausser Scientific1492
Steril 5, 10 ve 25 ml pipetlerBellco cam1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)Tekrar kullanılabilir pipetler kullanımdan önce yıkanır, pamuk tıkanır ve otoklavlanır
Steril doku kültürü uygulanmış plastik tabaklar (10 cmBD Falcon353003
; m ve 40 &mikro; m boyutu)BD Falcon352340 (40 ve mikro; m); 352360 (100&mikro; m)
  Myoblast ölümsüzleştirme
Steril 0.45 ve mikro; m filtrelerKırlangıçSLHV013SL
Klonlama halkalarıCorning#3166-8Kullanım öncesi ve sonrası temizlenecek ve otoklavlanacak
Fibroblast hücre hatları için malzemeler 
Steril 35 mm doku kültürü uygulanmış plastik tabaklarGreiner bio-one628160
Steril neşterlerDeRoyalD4510A
Steril T25 doku kültürü şişeleriTekno Plastik Ürün, TPP90026ABD'de MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
izolasyonu için reaktifler DMEM Kollajenaz içerir ölümsüzleştirilmesi için reaktifler değildir izolasyonu için malzemeler) Steril naylon hücreli süzgeçler (100 & mikromalzemeleri tarafından satılmaktadır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454(2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34(2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Etiketler

Kas Biyopsisi zolasyonuH cre Hatt l ms zle tirmePrimer H cre K lt rFACS Safla t rmaMiyojenik H cre DiferansiyasyonuCDK4 A r EkspresyonuhTERT EkspresyonuViral S pernatant retimiAntibiyotik Se ilimiKlonlama Halkas Tekni i

İlgili makaleler