Yöntem makalesi

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

DOI:

10.3791/52320

⸱

24 Haziran 2015

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Antwerp

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel nörobilim teşvik sisteminin cevabına gerçek zamanlı olarak bağlıdır uygulanan geliştirme ve roman uygulama ve genellikle karmaşık, kapalı devre protokolleri, artan bir ilgi tanık olmaktadır. Son uygulamalar optogenetics 3 kullanılarak kortikal inme aşağıdaki nöbetlerin kontrol etmek için, farelerde 1 ve Zebra balığı 2 hem de motorlu yanıtları incelemek için sanal gerçeklik sistemlerinin uygulanması arasında değişir. Kapalı döngü teknikleri önemli bir avantajı doğrudan erişilebilir değildir ya da aynı anda deneysel verim en üst düzeye çıkarırken, bu tür nöronal uyarılabilirlik 4 ve güvenilirlik gibi çoklu değişkenler, bağlı olduğu yüksek boyutlu özelliklerini sondalama kapasitesi bulunur. Bu katkının ve hücresel elektrofizyoloji bağlamında, biz piramidal kortikal nöronlar, rec tepki özelliklerinin çalışmaya kapalı devre protokolleri çeşitli uygulamak nasıl açıklargenç sıçanların somatosensoriyel korteks akut beyin dilimleri yama kelepçe tekniği ile hücre orded. Hiçbir ticari olarak temin veya açık kaynak yazılım verimli Burada anlatılan deneyler için gerekli tüm özellikleri sağlar gibi, LCG 5 olarak adlandırılan yeni bir yazılım araç olan modüler yapısı bilgisayar kodu yeniden en üst düzeye ve yeni deneysel paradigmalar uygulanmasını kolaylaştırır geliştirilmiştir. Uyarım dalga kompakt meta-açıklamasını kullanılarak belirtilir ve tam deneysel protokoller metin tabanlı yapılandırma dosyalarında açıklanmıştır. Ayrıca, LCG çalışmaların tekrarı ve deneysel protokollerin otomasyonu için uygundur bir komut satırı arayüzü var.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, hücresel elektrofizyoloji, modern kapalı devre protokollere gerilim ve akım kelepçe deneylerinde kullanılan geleneksel açık-döngü evrim geçirmiştir. En iyi bilinen kapalı döngü tekniği belki nöronal membran gerilimi 8 belirlemek için yapay voltaj kapılı iyon kanallarının sentetik enjeksiyon etkin dinamik kelepçe 6,7 olduğunu, deterministik olmayan titreşen etkilerinin derinlemesine çalışma iyon nöronal yanıt dinamikleri 9 kanal, yanı sıra sinaptik zemin aktivitesi 10 gibi vivo- gerçekçi in vitro rekreasyon.

Ileri sürülmüştür diğer kapalı çevrim paradigmalar hücresel mekanizmaları altında yatan nöronal uyarılabilirliği araştırmak için, 4,12 kelepçe reaktif kelepçe 11, in vitro kendini sürekli kalıcı aktivite nesil incelemek ve yanıtı yer alıyor.

"ontent> Burada akut beyin dilimleri yapılan tüm hücre yama kelepçe kayıtları bağlamında kapalı döngü elektrofizyolojik protokolleri çeşitli uygulayarak sağlar güçlü bir çerçeve açıklanmaktadır. Biz yama kelepçe kayıtları vasıtasıyla somatik membran gerilimini kaydetmek için nasıl göstermek genç sıçanların somatosensoriyel korteks ve gelen piramidal nöronlar LCG, Teorik Nörobiyoloji ve Neuroengineering laboratuarda geliştirilen bir komut satırı tabanlı yazılım araç kutusunu kullanarak üç farklı kapalı döngü protokolleri uygulamak.

Kısaca, tarif edilen protokoller, aktif ve pasif zar özelliklerinin büyük bir set karakterizasyonu hakkında akım kenetli uyaran dalga formu, bir dizi ilk otomatik enjeksiyon bulunmaktadır. Bunlar uyarıcı bir dalga kalıplaşmış dizi onun cevabı özellikleri bakımından bir hücrenin elektrofizyolojik fenotip yakalamak için ileri sürülmüştür. Bir hücrenin e-kodu olarak bilinen (örneğin, bkz & #160; 13,14), elektrik yanıtların Bu tür bir koleksiyon objektif olarak elektriksel özellikleri temelinde nöronlar sınıflandırmak için çeşitli laboratuarlar tarafından kullanılır. Bu orantılı-entegral-türev (PID) ile, kontrol vasıtası ile ateşleme hızının kapalı halka, gerçek zamanlı kontrol içeren bir yeni tekniği sabit giriş-çıkış aktarma bağlantısı ile (eğri), analizini içermektedir in vitro preparasyonlar 10 ve bilgisayar tarafından simüle sanal bir GABAerjik interneuron vasıtasıyla, iki eş zamanlı olarak kaydedilen piramidal nöronlar, gerçek zamanlı olarak, üçüncü yapay bağlantılı olarak gerçekçi bir in vivo benzeri arka sinaptik aktivitenin ikinci dinlenme.

Buna ek olarak, LCG tek bir elektrot kullanarak dinamik kelepçe protokolleri uygulanması mümkün olmaktadır aktif elektrot Telafisi (AEC), 15 olarak bilinen bir teknik uygular. Bu istenmeyen etkileri telafi izin verir (artifacts) hücre içi uyaranlara teslim etmek için kullanıldığı zaman ortaya çıkan kayıt elektrot. yöntem kayıt devrenin eşdeğer elektriksel özelliklerinin parametrik olmayan tahmin dayanmaktadır.

Bu yazıda tarif edilen teknikler ve deneysel protokoller hali hazırda, geleneksel açık döngü gerilim ve akım kenetli deneylerinde uygulanabilir ve in vivo 17,18 gibi hücre dışı 4,16 diğer preparasyonlar ya da hücre içi kayıtları uzatılabilir. tüm hücre yama kelepçe elektrofizyoloji için kurulum dikkatli montaj istikrarlı, yüksek kaliteli kayıtlar için çok önemli bir adımdır. Aşağıda böyle bir deney düzeneği deneyci için zaten mevcut olduğunu varsayalım ve LCG kullanımını anlatan bizim dikkatimizi. Okuyucu optimizasyonu ve hata ayıklama hakkında ek ipuçları için 19-22 işaret edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol önerileri ve Anvers Üniversitesi Biyomedikal Bilimleri Bölümü Etik Kurul kurallarına uygundur. Bu protokol onaylı insani ötenazi teknikleri ile elde edilen genç Wistar sıçanların eksplante beyin, olmayan bilinçli malzemenin hazırlanmasını gerektirir.

1. Ekipman Hazırlığı

  1. Yükleme ve veri toplama ve stimülasyon sistemi yapılandırmak.
    1. Sinyalleri kaydetmek ve elektrofizyolojik amplifikatöre analog kontrol voltajlarını göndermek için comedi tarafından desteklenen bir veri toplama (DAQ) kartı ile donatılmış bir kişisel bilgisayar (PC) kullanın.
      NOT: Daha fazla bilgi için http://www.comedi.org ziyaret edin: Comedi en yaygın üreticilerin DAQ kartların çok sayıda destekleyen bir Linux modül ve kütüphane.
    2. Bir bilgisayar kontrollü yama kelepçe yükselticisi kullanımda olduğu durumda, amplifikatör adanmış bir yanı sıra, ikinci bir bilgisayar istihdamKontrol.
      Not: ikinci alışılmış bir işletim sistemi çalıştırmak da, ilave bilgisayar özel bir işletim sistemi ile gerçek zamanlı olarak çalışma olacaktır. Özel PC'ye uzak masaüstü uygulaması ile bağlanırken, bu koşullar altında, bu ekstra bilgisayara bağlı tek bir monitör, fare ve klavyeyi kullanmak daha uygun olur.
    3. Http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso gelen LCG ile gerçek-zamanlı Linux işletim sistemi içeren Live CD ISO görüntüsünü önceden yüklenmiş indirin ve boş bir CD veya USB stick "üzerine yakmak .
    4. Basitçe DAQ kartı içeren PC sürücüsüne takın ve başlatın. Alternatif olarak, Linux işletim sistemi (örneğin, Debian veya Ubuntu) çalıştıran bir PC üzerinde kendi online kaynak havuzundan LCG yükleyin. Kurulum prosedürü ile ilgili ayrıntılar için çevrimiçi kılavuzuna başvurun. manuel http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf adresinden online ulaşabilirsiniz.
    5. Canlı CD'den önyükleme: tis otomatik tam yapılandırılmış bir sistem yükleyecektir. Bunu yapmak için, bilgisayarın CD-ROM sürücüsüne LCG Live CD yerleştirin ve bilgisayarı CD'den önyükleme; Önyükleme menüsü görünür en kısa sürede gerçek zamanlı çekirdek (varsayılan seçenek) seçin ve sistem başlatılmasını bekleyin.
    6. Komut istemine yazarak DAQ kartı kalibre:
      sudo comedi_calibrate
      veya
      sudo comedi_soft_calibrate
      veri toplama kartı sırasıyla donanım veya yazılım kalibrasyonu, (gemide bilgi edinmek için komut sudo comedi_board_info kullanın) destekleyip desteklemediğini bağlı.
    7. Uygun analog-dijital ve dijital-analog dönüşüm faktörleri ayarlayın: Bu hücresel elektrofizyolojik amplifikatör kılavuzuna sahip erişimi gerektirir ve özellikle de dönüşüm faktörleri üzerindeki teknik özelliklerine.
    8. Ortam değişkenleri için, dosya /home/user/.lcg-env uygun sayısal değerlerini belirtmek için bir metin düzenleyicisi kullanın AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
      NOT: Bu amplifikatör tarafından oluşturulan girişi (AI) ve akım kelepçe (CC) ve gerilim kelepçe (VC) modları için çıkış (AO) kazançları ve bilgisayar tarafından sağlanan voltaj ve akım komutları veya gerilimler arasındaki dönüşüm faktörleri temsil sırasıyla.
    9. Alternatif olarak, kendi sistem dönüşüm faktörleri bulmak için, (lcg-bulmak-dönüşüm-faktörler) sağlanan LCG komut dosyasını kullanın.
      NOT: hesaplanan değerler lcg-bulmak-dönüşüm faktörleri bazı durumlarda sayısal kesik olması gerekmektedir veya dönüşüm faktörleri kesin değerleri yansıtacak şekilde yuvarlanır tahminler vardır.
    10. Kullanmak için, LCG-dönüşüm-faktörleri bulmak genellikle gelen headstage amplifikatör ile satın alınır "modeli hücreyi 'bağlayarak başlayın. Sonra Live CD çalışan ve kabuk isteminde aşağıdaki komutu girin olan Linux makinedeki bir terminal açın:
      lcg-bulmak-dönüşüm-faktörleri -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
      NOT: Her iki durumda da (yani, manuel /home/user/.lcg-env veya lcg-bulmak-dönüşüm-faktörlerin kullanımının değiştirilmesi), yakın ve değişikliklerin etkili olabilmesi için terminal açın.
    11. Birden headstages kullanılırsa, tüm kanallarda aynı değerlere dönüşüm faktörleri set; Bu mümkün değilse, daha iyi kullanıcı ihtiyaçlarına uygun yapılandırma dosyaları üretmek için lcg-uyarıcı veya nasıl birden çok dönüşüm faktörlerini nasıl kullanılacağını anlamak için LCG çevrimiçi el kitabına başvurun.

Somatosensoriyel Cortex adlı Akut Beyin Dilimleri 2. Hazırlık

  1. Elektrofizyoloji için çözümler hazırlanması.
    1. 125 NaCl, 2.5 KCl, (mM olarak) karıştırılması ile yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlanması 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glukoz, 2 CaCl2, 1 MgCl2. Azaltmak için 10x stok çözümleri hazırlayındeney günü hazırlık zamanı. Bir dilim hazırlanması ve kayıt için diğeri için kullanılacak olan 2 L, hazırlayın.
    2. Prosedürün başlangıcına öncesi en az 30 dakika boyunca% 95 O2 ve% 5 CO2 ile ACSF Doymuş.
    3. Mevcut kelepçe kayıtları için, (mM olarak) ihtiva eden bir hücre içi çözelti (ICS) kullanan 115 K-glukonat, 20 KCI, 10 HEPES, 4 ATP-mg, 0.3 Na 2 -GTP, 10 2 -phosphocreatine Na. Buz çözüm hazırlayın ve pipet tıkanma riskini ortadan kaldırmak için kayıtların başlamasından önce bunu süzün.
  2. Beyin çıkarma.
    1. % 4 İsofluranın bir indüksiyon odasında hayvan yerleştirme hayvan anestezisi ve hızla giyotin veya büyük makas kullanarak başını kesmek.
    2. Orta hat boyunca cildi kesin ve kulaklarına kaydırın.
    3. Makas ince çifti kullanılarak orta hat boyunca kafatası kesti. Inci mümkün olduğunca yakın bıçak tutune yüzeyi altta yatan beyin hasarı en aza indirecek şekilde. , Bir cımbız ile kafatası açın optik sinir ve beyin sapı sever ve yavaşça buz ACSF beyin açılan bir spatula kullanın.
    4. Serebellum ve bir neşter (bıçak 24) ile iki hemisfer ayırın.
    5. Iki hemisfer birinden fazla suyu çıkarın ve superglue bir damla kullanarak eğimli bir platform üzerinde tutkal. Hızla beynin üzerinde ACSF birkaç damla ekleyin ve vibratome odasına transfer.
      NOT: sagittal dilimleri hazırlarken, platformun açısı dilimleme işlemi sırasında piramidal hücrelerin dendritler zarar görmesini önlemek için çok önemlidir.
  3. Dilimleri hazırlanması.
    1. Beynin üzerinde bıçağı yerleştirin ve ilk 2,5 atın - 3 mm. Ise dilimleme işlemi için gerekli zamanı en aza indirmek, aynı zamanda dilim yüzeyine zarar sınırlamak için hız ve frekansını ayarlayın.
    2. 300 μ kalınlık ayarlamam ve dilimleme başlar. Bıçak korteks geçmiş gitmiş sonra, bir jilet veya hipokampus üzerinde ve ilgi kortikal alanın kenarlarında kesmek için bükülmüş bir iğne kullanın.
    3. 34 ° C - Çok-çukurlu inkübasyon odası içinde 32 ° C'de tutulan dilimler yerleştirin.
    4. Bıçak çekin ve 5 kadar puan 2.3.2 ve 2.3.3 tekrarlayın - 8 dilim kesilir. En iyi dilimler, genellikle kan damarlarının yüzeyine paralel olanlardır.
    5. En son dilim odasına yerleştirilir sonra 30 dakika boyunca inkübe dilimleri.

Katman 5 Piramidal nöronlar 3. Patch-kelepçe Kayıtlar

  1. Kayıt odasına bir dilim koyun ve sağlıklı hücrelere arayın. Bu hücreler genellikle alt kontrast, pürüzsüz bir görünüme sahip ve şişmiş değildir.
  2. Beynin yüzeyinden yaklaşık 600 mikron 1,000 bulunan, 40X büyütme lens ile mikroskop altında dilim inceleyin ve katmanda 5 hücrelerin arayın.
  3. Uygun bir hücre bulunduğunda, ICS mikropipet yükü üçte biri ve headstage yerleştirin.
  4. Canlı CD ​​veya önceden konfigüre Linux işletim sistemini çalıştıran kişisel bilgisayarda bir komut kabuğunu (örneğin, bash) başlatmak ve istemine şunu yazın komut lcg sıfır. Bu DAQ kurulu amplifikatör sürüş olmadığını garanti eder.
  5. 30 uygulanır - mikroskop yardımıyla, pipet tutucusuna boru ve bağlı ortak bir şırınga, bir pistona bastırarak pozitif basınç 50 mbar, dilim üzerindeki Pipet yaklaşık 100 um yerleştirin.
    NOT: tercihen mikromanipülatör yaklaşımı modunu kullanarak, hedef hücreye doğrudan bir yol sağlayan bir konuma pipet yerleştirin.
  6. Denetimlerinde elektrofizyolojik amplifikatör Oyunculuk, ofset pipet ve çıkış gerilim kelepçe modunda bir test darbe (10 mV) ayarlayın.
  7. Geri çekerek 30 mbar (pipet boyutuna bağlı olarak) - 10 basıncı azaltmakşırınga piston; nazikçe hücreyi yaklaşım ve video kamera monitörde görüntü gözlemleyerek bir çukur oluşması için kontrol edin. Her zaman direnç artışı test darbe Monitör, elektrofizyoloji amplifikatöre bağlı osiloskop görüntülenen akım dalga şekli izleyerek (alternatif pipet direnci izlemek için komut lcg mühür testi kullanabilirsiniz).
  8. Basıncı bırakın ve pipet direnci bir artış ve hücre üzerindeki bir 'çukur' oluşumunu fark ettiğinizde gerekirse conta oluşumunu yardım etmek pipet nazik negatif basınç uygulayın.
  9. Mühür formları iken, giderek mV -70 tutarak potansiyelini azaltır.
  10. 30 Pa - Bir gigaohm sızdırmazlık elde edildikten sonra, tutma akımı 0 ile olduğundan emin olun. Zarın kınlması ve bütün-hücre konfigürasyonunu kurmak için negatif basınç (emme) kısa darbelerle uygulanır. Alternatif olarak, (gerilim güçlü ve kısa darbeleri enjekte edebilirsiniz , yani kullanılan hazırlama ve cam pipet bağlı membran rüptürü) amplifikatör 'ZAP' komutunu kullanarak veya çok olumsuz hücreyi tutarak.
  11. Geçerli kelepçe moduna geçer ve istirahat membran potansiyeli sağlıklı bir hücrenin tipik olduğunu doğrulayın. Bir potasyum glukonat tabanlı çözüm kullanarak kortikal piramidal nöronlar için, bu değer genellikle arasında -65 ile -75 mV olduğunu.

Bir Neuron adlı Elektrik Tepki Özellikleri 4. Yarı-otomatik Karakterizasyonu

  1. Kullanıcının veri depolamak için bir dizin oluşturun. Bir komut dosyası tarihe göre klasörler oluşturur canlı LCG CD dahil bu işçinin yapmak için. Komut istemine, tip kullanmak için
    cd ~ / deneyler
    lcg oluşturun-deney-klasör PSP, in_vivo_like -s
    Bu, o hücrenin verileri kaydedilir bir klasör (ve alt 'in_vivo_like' a 'PSP' ve benzeri) yaratacak ve terminale adını basacaktırpencere; Bu gibi bir pipet direnci ve bu komut dosyası kullanılarak hücre tipi gibi ek bilgileri depolamak için de mümkündür.
  2. Komutunu kullanarak yeni oluşturulan klasöre dizini değiştirin
    cd ~ /
    klasör adı 20140331A01 gibi, komut lcg-deney-klasör oluşturmak ve mevcut günün zaman damgası (yani, yıl-ay-gün) tarafından görüntülenen biridir.
  3. Amplifikatör geçerli kelepçe modunda çalışmak üzere ayarlanmış olduğundan emin kabloların bağlı ve amplifikatör harici gerilim komutu varsa, etkin olduğundan emin olun.
  4. Komut lcg-ecodeat komut istemi girin. Bu hücrenin temel tepkisi özelliklerini karakterize kullanılan komutları bir dizi (yani lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampa, lcg-tau ve lcg-adım), çağırır. LCG-ecode kullanıcı iki parametreleri belirlemek gerektirir: Hücre tek bir başak temin etmek için kullanılan akım 1 ms süren darbe genlik ve mevcut RAM maksimum genliğip kendi rheobase bulmak için hücre içine enjekte edilir.
    Aşağıdaki komut sözdizimini kullanın:
    LCG-ecode --pulse amplitüdlü X --ramp amplitüdlü Y'nin
    sırasıyla 1 ms-uzun nabız ve akımın sürekli enjeksiyonu, cevaben hücre ateş yapmak için yeterli değerler X ve (pA olarak) Y seçeneği ile.
    NOT: Bu protokoller Aktif Elektrot Telafisi (AEC) 15 kullanmak için 'elektrot çekirdeğin' sayısal tahminini performans gerektirir. Gürültülü bir akım enjeksiyon çekirdek tahmin etmek için kullanılır ve kullanıcı çekirdeği oluşturan örneklerin sayısını onaylamak için istenir. Elektrot çekirdeğin anlamı ve nasıl çekirdek örneklerinin sayısını seçmek için ilgili ayrıntılı bilgi için bkz 15'e.

Simüle Sinapslar ve İn Vivo benzeri Arkaplan Faaliyet Simülasyon yoluyla İletkenlik 5. Enjeksiyon

  1. Simüle uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin Enjeksiyon
    1. Eğer kabuk komut isteminde aşağıdaki komutu yazarak, bir sonraki deneyi kurtaracak dizine değiştirin:
      cd psp / 01
    2. Geçerli dizine bir LCG yapılandırma dosyasını kopyalayın ve (bu örnek yapılandırma dosyası kaynak kodu ve canlı cd dahildir) kabuk komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak (bu örnekte Nano) bir metin editörü ile açın :
      cp ~ / local / src / kg / yapılandırmaları / epsp.xml
      nano epsp.xml
      NOT: Bu sadece birbirine bağlı farklı kurumlarla bir metin dosyasıdır. Daha fazla ayrıntı için Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakın.
    3. Gerekli düzenleme inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor ve bu dosyada outputConversionFactor kullanıcının kurulum maç edin.
    4. Com yayımlayarak 'tek elektrot dinamik kelepçe gerçekleştirmek için LCG tarafından kullanılan yöntem' aktif elektrot tazminat gerçekleştirmek için gereken elektrot çekirdek hesaplayınmand
      lcg-çekirdek
      Bu çekirdekte noktalarının sayısı isteyecektir. Elektrot çekirdek üstel çürüme kuyruk ucunu kaplayacak şekilde yine bir numara seçin.
    5. Komutunu kullanarak dinamik kelepçe deneyi gerçekleştirmek
      -c epsp.xml lcg-deneme
    6. Dosyaları listelemek ve komutunu kullanarak sonuçları görselleştirmek
      ls -l
      Son -f lcg-arsa-dosya
  2. Simüle inhibitör post-sinaptik potansiyellerin Enjeksiyon
    1. Bir klasör oluşturun ve kabuk komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak kendisine epsp.xml dosyasını kopyalayın:
      mkdir ../02
      cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
      CD ../02
    2. Bir metin düzenleyicisi kullanarak yapılandırma dosyasını düzenleyin: sinaptik ters potansiyelini değiştirmek ve aşağıdaki model sinaps Exp2Synapse sabitleri yükselir ve çürüme süresi:
      Parametreler>
      -80
      0.8e-3
      10e-3

      Metin editörü çıkın.
    3. Elektrot çekirdek hesaplamak ve kabuk komut istemine aşağıdaki komutları yazarak, 5.1 gibi deney gerçekleştirin:
      lcg-çekirdek
      -c ipsp.xml lcg-deneme
    4. Dosyaları listelemek ve kabuk komut istemine aşağıdaki komutları yazarak, sonuçları görselleştirmek:
      ls -l
      lcg-arsa-dosya -f
  3. In vivo benzeri zemin aktivitesi Simülasyonu:
    1. Daha önce kabuğun komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak, gösterildiği gibi, aşağıdaki deney kaydetmek istediğiniz dizini değiştirin:
      CD ../../in_vivo_like/01
    2. LCG kaynak dizinden, kabuk komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak yapılandırma dosyasını kopyalayın:
      cp ~ / local / src / kg / yapılandırmaları / in_vivo_like.xml
      nano in_vivo_like.xml
      Not: Bu dosya sadece öncekilerin birleşimidir; sırayla, baskılayıcı ve uyarıcı bir model sinapsların beslemek arka plan faaliyeti oluşturmak başak trenler oluşturmak iki Poisson nokta süreçleri.
    3. 5.1.3 açıklandığı gibi, kullanıcının kurulum için DAQ yapılandırma parametrelerini ayarlayın ve editörü çıkın.
    4. Elektrot çekirdek hesaplamak ve kabuk komut istemine aşağıdaki komutları yazarak, 5.1 gibi deney gerçekleştirin:
      lcg-çekirdek
      10 -i 3 -n -c in_vivo_like.xml lcg-deneme
      '-n 10' ve '-i 3' anahtarlar stimülasyon üç saniyelik aralıklarla 10 kez tekrarlanır gerektiğini göstermektedir.
    5. Kabuğun komut isteminde aşağıdaki komutu kullanarak ham izlerini görselleştirmek:
      lcg-arsa-dosya -f tüm

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki bölümlerde, biz L5 piramidal hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini karakterize etmek için bir yazılım araç LCG kullanmak ve bir dilim hazırlık in vivo benzeri sinaptik aktivite yeniden nasıl tarif var. Bir komut satırı arayüzü ve yarı otomatik protokolünün kullanımı elde edilen verilerin çıktı ve kalitesi üzerinde büyük bir etkisi olabilir deney, tekrarlanabilirliği ve verimliliğini lehine. Veri tutarlı bir şekilde kaydedilmiş olduğundan, ayrıca, belirli bir hedefe analiz uzatmak kolaydır. 1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu metinde gerçek zamanlı uygulanması için tam bir protokol olarak, kapalı döngü tek bir hücre elektrofizyolojik deneyler yama kelepçe tekniği ve LCG adında bir süre önce geliştirilen yazılım araç kutusunu kullanarak tarif edilmiştir. Kayıtların kalitesini optimize etmek için bu kayıt kurulum düzgün, topraklı ücretsiz ekranlı ve titreşim olması çok önemlidir: bu hücrenin, istikrarlı ve kalıcı tam hücreli erişimi garantiler birlikte stimülasyon protokolleri tüm bölümlerini otomasyonunu imkanı ile, hangi , deney hacmi mak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flanders Araştırma Vakfı FWO'dan (sözleşme n. 12C9112N'den DL'ye), Avrupa Komisyonu'nun 7. Çerçeve Programından (Marie Curie Ağı "C7", sözleşme n. 238214; BİT Geleceğin Gelişen Teknolojisi "AYDINLANMA" projesi, sözleşme n. 306502), Belçika Bilim Politikası Ofisi (sözleşme n. IUAP-VII/20) ve Antwerp Üniversitesi tarafından başlatılan Üniversitelerarası Cazibe Kutupları Programı nazikçe kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Doku dilimleyiciLeicaVT-1000S
Pipet çektirmeSutterP-97
PipetlerWPI1B150F-41,5/0,84 mm OD/ID, filamentli
Titreşim izolasyon tablasıTMC20 Serisi
MikroskopLeicaDMLFS40X Daldırma Objektif
ManipülatörleriScientificaPatchStar
AmplifikatörlerAxon InstrumentsMultiClamp 700BBilgisayar kontrollü
Veri toplama kartıNational InstrumentsPCI-6229Comedi Linux Sürücüleri Tarafından Desteklenir
Masaüstü bilgisayarDellOptiplex 7010 Towerİşletim Sistemi: gerçek zamanlı Linux
OsiloskoplarıTektronixTDS-1002
Perfüzyon PompaGibsonMINIPULS3R4 ile kullanılır Pompa kafası (F117606)
Sıcaklık kontrolörüÇok Kanallı SistemlerTC02PH01 Perfüzyon Kanül Manometresi
Testo510Opsiyonel
İnkübatörMemmertWB14
NaClSigma71376ACSF
KClSigmaP9541ACSF, ICS
NaH2< / sub>PO4< / sub>SigmaS3139ACSF
NaHCO3SigmaS6014ACSF
CaCl2SigmaC1016ACSF
MgCl2SigmaM8266ACSF
GlikozSigmaG7528ACSF
K-GlukonatSigmaG4500ICS
HEPESSigmaH3375ICS
Mg-ATPSigmaA9187ICS
Na2< / sub>-GTPSigma51120ICS
Na2< / sub>-FosfokreatinSigmaP7936ICS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  4. Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3(2011).
  5. Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
  6. Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
  7. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  8. Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
  9. White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
  10. Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  11. Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
  12. Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
  13. Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  14. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
  15. Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
  16. Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
  17. Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
  18. Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
  20. Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
  21. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  22. Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
  23. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
  24. Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
  25. Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
  26. Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
  27. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
  28. Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
  29. Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Closed loop ProtocolsDynamic ClampPatch Clamp TechniqueCortical NeuronsLCG Software ToolboxElectrophysiological ProtocolsBrain Slice PreparationSomatosensory CortexNeuronal ExcitabilitySynaptic Event Simulation

İlgili makaleler