SDF-1α-Kitosan-Dekstran Sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve Karakterizasyonu

Özet

Bu protokolün amacı, bir kök hücre hedef arama faktörü olan SDF-1α'yı dekstran sülfat-kitosan nanopartiküllerine dahil etmektir. Elde edilen parçacıklar, boyutları ve zeta potansiyellerinin yanı sıra nanoparçacıklardan SDF-1α'nın içeriği, aktivitesi ve in vitro salım hızı için ölçülür.

Özet

Kitosan (CS) ve dekstran sülfat (DS), uygun koşullar altında karıştırıldığında polielektrolit kompleks bazlı nanopartiküller oluşturan yüklü polisakkaritlerdir (glikanlar). Glikan nanopartikülleri, proteinlerin in vivo olarak verilmesini kolaylaştıran ve hedeflenen dokuda tutulmalarını sürdüren protein faktörleri için yararlı taşıyıcılardır. Glikan polielektrolit kompleksleri, protein dağıtımı için de idealdir, çünkü birleştirme, proteinlerin inaktivasyon olasılığını azaltan sulu çözelti içinde gerçekleştirilir. Heparin bağlanma bölgesine sahip proteinler, dekstran sülfata kolayca yapışır ve sırayla bağlanma ile stabilize edilir. Bu parçacıklar ayrıca in vivo olarak verildiğinde daha az inflamatuar ve toksiktir. Aşağıda tarif edilen protokolde, bir kök hücre hedef arama faktörü olan SDF-1α (Stromal hücre kaynaklı faktör-1α) önce karıştırılır ve dekstran sülfat ile inkübe edilir. Polielektrolit kompleksleri oluşturmak için karışıma kitosan eklenir, ardından kompleksleri çinko köprülerle stabilize etmek için çinko sülfat eklenir. Elde edilen SDF-1α-DS-CS parçacıkları, boyut (çap) ve yüzey yükü (zeta potansiyeli) için ölçülür. Dahil edilen SDF-1α'nın miktarı belirlenir, ardından in vitro salım hızı ve kemotaktik aktivitesi partiküle bağlı bir formda ölçülür.

Giriş

Dekstran sülfat (DS) ve kitosan (CS), çoklu ikame edilmiş negatif yüklü sülfat gruplarına (DS'de) veya pozitif yüklü amin gruplarına (deasetillenmiş CS) sahip polisakkaritlerdir. Sulu bir çözelti içinde karıştırıldığında, iki polisakkarit, elektrostatik etkileşimler yoluyla polielektrolit kompleksleri oluşturur. Elde edilen kompleksler, sulu çözeltiden (çökeltiler) faz ile ayrılacak büyük agregalar veya suda dağılabilen küçük parçacıklar (kolloidler) oluşturabilir. Bu sonuçlara katkıda bulunan özel koşullar kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve yakın tarihli bir gözden geçirmede ayrıntılı olarak özetlenmiştir ¹. Bu koşullar arasında, suda dağılabilir parçacıklar üretmek için iki temel gereksinim şunlardır: zıt yüklü polimerler 1) önemli ölçüde farklı molar kütleye sahip olmalıdır; ve 2) stokiyometrik olmayan bir oranda karıştırılmalıdır. Bu koşullar, yük nötralizasyonu ile üretilen yük-nötr kompleksli polimerik segmentlerin parçacığın çekirdeğini ayırmasına ve oluşturmasına ve fazla polimerin dış kabuğu ¹ oluşturmasına izin verecektir. Bu protokolde tarif edilen glikan partikülleri, pulmoner doğum için tasarlanmıştır ve net negatif yüklü ve nanometre boyutlarında olacak şekilde tasarlanmıştır. Negatif yüzey yükü, parçacıkların ^2,3 hücresel alım olasılığını azaltır. Nanometre boyutundaki partiküller distal hava yollarından geçişi kolaylaştırır. Bu amaca ulaşmak için, bu preparatta kullanılan DS miktarı CS'den fazladır (ağırlık oranı 3:1); ve yüksek moleküler ağırlıklı DS (ağırlık ortalaması MW 500.000) ve düşük moleküler ağırlıklı CS (MW aralığı 50-190 kDa, %75-85 deasetillenmiş) kullanılır.

SDF-1α, kemotaktik aktivitesi aracılığıyla hedef arama işlevini uygulayan bir kök hücre hedef arama faktörüdür. SDF-1α, kemik iliğinde hematopoietik kök hücrelerin yerleştirilmesinde ve sürdürülmesinde ve yaralanma onarımı için periferik dokuya progenitör hücrelerin alınmasında önemli bir rol oynar ^4,5. SDF-1α, protein dizisinde, proteinin heparin/heparan sülfata bağlanmasına, dimerler oluşturmasına, proteaz (CD26/DPPIV) inaktivasyonundan korunmasına ve hücre yüzeyi reseptörleri ^6-8 aracılığıyla hedef hücrelerle etkileşime girmesine izin veren bir heparin bağlama bölgesine sahiptir. DS, heparin/heparan sülfat ile benzer yapısal özelliklere sahiptir; bu nedenle, SDF-1α'nın DS'ye bağlanması, doğal polimerik ligandlarınınkine benzer olacaktır.

Aşağıdaki protokolde, SDF-1α-DS-CS nanopartiküllerinin hazırlanmasını açıklıyoruz. Prosedürler, daha önce incelenmiş olan formülasyonlardan birini temsil eder ⁹. Protokol başlangıçta VEGF-DS-CS nanopartikülleri ^10'un araştırılmasından uyarlanmıştır. Aynı stok çözeltileri ve hazırlama koşulları ile kolayca ölçeklendirilebilen küçük ölçekli bir hazırlık tanımlanmıştır. Hazırlandıktan sonra, partiküller boyutları, zeta potansiyelleri, SDF-1α dahil edilme kapsamı, in vitro salım süresi ve dahil edilen SDF-1α'nın aktivitesi incelenerek karakterize edilir.

Protokol

1. SDF-1α Glikan Nanopartiküllerinin Hazırlanması

In vivo uygulama amacı nedeniyle, hazırlıkta kullanılan tüm kapları, pipetleri ve uçları sterilize edin.

1. UltraPure Water'da aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın:% 1 dekstran sülfat; 1 M NaOH (PES membranı ile steril filtrelenmiş); % 0.2 buzlu asetik asit içinde% 0.1 kitosan (art arda 0.8 ve 0.22 μm filtrelerden süzün ve daha sonra NaOH ile pH'ı 5.5'e ayarlayın); 0.1 M ZnS04;% 15 mannitol; ve 0.92 mg / ml SDF-1α (80 ° C'de alikotlarda saklanır, ve çözüldükten sonra 4 ° C'de tutulur).
2. Stok çözeltilerini 0,22 μm filtre membranları ile sterilize edin. Hazırlanan çözeltideki endotoksin seviyelerini limulus amebosit lizat (LAL) jel pıhtı testi ile değerlendirin. Seviyelerin <0.06 EU/ml olduğundan emin olun.
3. Manyetik karıştırma çubuğu içeren 1,5 ml'lik bir cam şişeye 0,18 ml UltraPure su ekleyin. Karıştırma hızını 800 rpm'ye ayarlayın. 0.1 ml% 1 dekstran sülfat ekleyin ve 2 dakika karıştırın. 0.08 mg SDF-1α (0.087 ml 0.92 mg / ml SDF-1α çözeltisi) ekleyin ve 20 dakika karıştırın.
4. Damla damla 0.33 ml% 0.1 kitosan ekleyin ve 5 dakika karıştırın. Karıştırma hızını maksimuma ayarlayın ve 0.1 ml şırınga ile (1 dakikadan fazla) yavaşça 0.1 ml 0.1 M ZnS4 ekleyin.
5. Karıştırma hızını 800 rpm'ye getirin ve 30 dakika karıştırın. 0.4 ml% 15 mannitol ekleyin ve 5 dakika karıştırın. Reaksiyon karışımını 1.5 ml'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. 10 dk.
   boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'da santrifüjleyin Not: Mannitolün varlığı, santrifüjlemeden sonra partiküllerin yeniden süspansiyonunu kolaylaştırır. Peletin kompaktlığına bağlı olarak, mannitol konsantrasyonu %0 ila %5 arasında değişebilir. Her santrifüjlemeden sonra partiküllerin tamamen yeniden süspansiyonu, son süspansiyondaki agregaları önlemek için kritik öneme sahiptir.
6. Süpernatanı aspire edin ve sıvının son damlasını yavaşça çıkarmak için bir pipet kullanın. 0.2 ml% 5 mannitol ekleyin. Peletleri 0.5 ml, 29 G iğneli şırınga ile askıya alın. 1 ml% 5 mannitol ekleyin. 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
7. Adım 1.6'yı tekrarlayın.
8. Süpernatanı aspire edin. Peleti 0.2 ml% 5 mannitol içinde yeniden süspanse edin. Partikül süspansiyonunu 4 °C.
   'de saklayın Not: Partikül süspansiyonu ayrıca -80 °C'de donmuş olarak saklanabilir veya liyofilize edilebilir. Süspansiyona %5 mannitol dahil edilmesi, donma ve çözülme işleminden sonra veya liyofilizasyon ve rehidrasyondan sonra partiküllerin toplanmasını önlemek için gereklidir. Mannitol, depolamadan sonra süspansiyonun santrifüjlenmesiyle çıkarılabilir.

2. Partikül Boyutu ve Zeta Potansiyelinin Ölçümü

Partikül boyutu ve zeta potansiyeli, Malzeme Listesinde belirtilen bir partikül analizörü ile sırasıyla dinamik ışık saçılımı ve elektroforetik ışık saçılımı ile analiz edilir.

1. Partikül boyutu ölçümü için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Biriktirme süreleri: 70; Tekrarlama süreleri: 4; Sıcaklık: 25 °C; Seyreltici: su; Yoğunluk ayarı: otomatik.
2. SDF-1α-DS-CS numunesini suyla seyreltin (10 kat seyreltme). 100 μl numuneyi Eppendorf küveti gibi tek kullanımlık bir UV küvetine yükleyin. Küveti hücre tutucusuna yerleştirin. Yoğunluk ayarının "Optimum"a (~10.000 cps) ulaşmasını bekleyin. Veri toplamayı başlatın.
3. Ölçüm tamamlandıktan sonra, çap (nm) ve polidispersite indeksinin kümülant sonuçlarını kaydedin. Tekrarlanan 4 okumanın her birinden elde edilen sonuçların ortalamasını alın ve standart sapmayı hesaplayın.
4. Zeta potansiyeli ölçümü için 10 kat seyreltilmiş partikül numunesinin 500 μl'sini bir akış hücresine yükleyin. Ölçüm için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Biriktirme süreleri: 10; Tekrarlama süreleri: 5; Sıcaklık: 25 °C; Seyreltici: su; Yoğunluk ayarı: otomatik. Zeta potansiyelinin (mV) sonuçlarını kaydedin. Tekrarlanan 5 okumanın her birinden elde edilen sonucun ortalamasını alın ve standart sapmayı hesaplayın.

3. Parçacıklarda SDF-1α'nın Miktar Tayini

1. Serbest formdaki SDF-1α'yı 1.3x Laemmli numune tamponunda 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 ve 0.05 mg / ml konsantrasyonlarına seyreltin. 6 μl SDF-1α-DS-CS numunelerini 40 μl 1.3x Laemmli numune tamponu ile seyreltin. (0.25 M Tris-HCl, pH 7.5, %8 SDS, %40 gliserol, 0.05 mg / ml bromofenol mavisi ve %8 2-merkaptoetanol içeren 4x Laemmli stok tamponu hazırlayın. Stok çözeltisini küçük parçalara bölün ve tek kullanımlık olarak -20 °C'de tutun.)
2. Numuneleri 100 °C'de 10 dakika ısıtın. Partikülleri tamamen ayırmak için numuneleri 10 dakikalık ısıtma süresi boyunca iki kez (her biri maksimum hızda 10 saniye boyunca) vorteksleyin. Numuneleri 2 dakika RT'ye soğutun. Su yoğuşmasını azaltmak için 10.000 x g'da 0,5-1 dakika santrifüjleyin. İyice karıştırmak için tekrar girdap yapın.
   Not: Bu noktada, numune çözeltisi görünür bir çökelti olmadan berrak olmalıdır.
3. %4-20'lik bir SDS jeline 10 μl numune / kuyucuk yükleyin. Elektroforezi 20 dakika boyunca 200 V'ta çalıştırın. Jeli Coomassie mavi protein boyası ile boyayın.
4. Bir moleküler görüntüleyici ve dansitometri analiz yazılımı kullanarak SDF-1α'nın protein bant yoğunluğunu inceleyin. Serbest SDF-1α standartlarıyla oluşturulmuş standart bir eğriye karşı parçacıklardaki SDF-1α miktarını hesaplayın.

4. İn Vitro Serbest Bırakma Testi

1. SDF-1α glikan parçacıklarını Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum (D-PBS) içermeyen fosfat tamponlu salini ile 1: 1 oranında (h / v) karıştırın.
2. Partikül süspansiyonunu 1,5 ml'lik tüplerde 0,05 ml'lik alikotlara bölün. Numuneleri tüplerin dibine yükleyin. Hava kabarcıkları sokmaktan veya sıvının yüzeyini rahatsız etmekten kaçının. Tüplerin üstünü Parafilm.
   ile kapatın NOT: Bunu yaparken, tüp karıştırıcı üzerinde müteakip yukarıdan aşağıya dönüş sırasında sıvı altta kalacaktır.
3. Tüpleri dönen bir mikro tüp karıştırıcı üzerinde 37 °C'de döndürün. Belirlenen zamanlarda tüplerden alikotları çıkarın ve numuneleri hemen 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatanları ve peletleri ayırın ve peleti 0.05 ml D-PBS ile sulandırın. Numuneleri -20 °C'de saklayın. Tüm numuneler toplandıktan sonra, yukarıda açıklandığı gibi bir SDS jeli üzerindeki süpernatanları ve peletleri inceleyin.

5. Migrasyon Testi

Bu test, SDF-1α'nın kemotaktik aktivitesini ölçer. SDF-1α'nın hücre yüzeyindeki reseptörü (CXCR4) ile etkileşimi, hücrenin SDF-1α gradyanına doğru göçüne neden olur. Bu tahlilde, hücreler bir üst kuyucuğa (bir alt kuyudan yarı geçirgen bir zarla ayrılmış) ve SDF-1α çözeltisi bir alt oyuğa yüklenir.

1. SDF-1α'yı (serbest veya partiküle bağlı form) migrasyon tamponu (% 0.5 sığır serum albümini içeren RPMI-1640 ortamı) ile 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14 ve 0.05 ng / ml'lik nihai konsantrasyonlara 3 kat seri seyreltmede seyreltin.
2. 24 oyuklu plakadaki bir kuyucuğa 0.6 ml seyreltilmiş SDF-1α çözeltisi veya sadece migrasyon tamponu (negatif kontrol) ekleyin. Bir kuyucuğa 0.57 ml migrasyon tamponu ekleyin (giriş hücresi kontrolü). 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Alt kuyucuğun üzerine Transwell (gözenek boyutu 5 μm, çap 6,5 mm) gibi geçirgen bir hücre kültürü eki yerleştirin. Transwell ekine 0.1 ml Jurkat hücreleri (5 × 10⁵) yükleyin. 0,03 ml'lik hücreleri doğrudan giriş hücresi kontrol kuyusuna yükleyin. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 2 saat inkübe edin.
3. Transwell eklerini çıkarın. Alt kuyucuklara göç eden hücreleri 4 ml'lik bir polistiren tüpe aktarın. Taşınan hücreleri bir akış sitometresi ile sayın.
4. Negatif kontrollerdeki sayıların çıkarılmasından sonra (yalnızca migrasyon arabelleği içeren kuyucuklara geçirilen hücreler) giriş hücresi sayısının (giriş hücresi kontrol kuyucuğundaki hücre sayısı x 100/30) migrasyonu yüzde olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Hazırlanan SDF-1α-DS-CS partiküllerinin boyutu ve zeta potansiyeli bir partikül analiz cihazı ile belirlenir. Şekil 1, boyut ölçümünün analizini göstermektedir. Dört tekrarlanan ölçümden elde edilen kümülatif sonuçlardan, SDF-1α-DS-CS partiküllerinin ortalama hidrodinamik çapı 661 ± 8.2 (nm) ve polidispersite 0.23 ± 0.02'dir. Zeta potansiyeli ölçümünün sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir. Tekrarlanan beş ölçümden, SDF-1α-DS-CS partiküllerinin zeta potansiyeli -24.8 ± 0.5 mV'dir. Yukarıda ba...

Tartışma

Yukarıda bahsedildiği gibi, DS-CS nanopartikülleri, polianyon (DS) ve polikasyon (CS) molekülleri arasındaki yük nötralizasyonu yoluyla oluşturulur. Yük etkileşimi moleküler çarpışma sırasında kolayca gerçekleştiğinden, polimer çözeltilerinin konsantrasyonu ve karıştırma sırasındaki karıştırma hızı, elde edilen parçacıkların boyutu için kritik öneme sahiptir. Genel bir eğilim, daha seyreltilmiş DS ve CS çözeltilerinin ¹⁵ ve daha yüksek karıştırma hızının daha küçük parçacıklarla sonuçlanmasıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dekstran sülfat	Fisher	BP1585-100
Chitosan, düşük moleküler ağırlıklı	Sigma	448869
Çinko sülfat heptahidrat	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure su	Canlandırıcı	10977-023
SDF-1 ve alfa;	Referans 8'e göre hazırlanmıştır.
Şırınga filtresi, PES membran 0.22 & μ m	Millipore	SLGP033RS
Manyetik Mikro Karıştırma Çubukları (2  x  7  mm)	Balıkçı	14-513-63
Cam flakon Kiti; SUN-SRi	Balıkçı	14-823-182
Delsa Nano C Partikül Analiz Cihazı	Backman Coulter
Eppendorf UVette Küvet	Eppendorf	952010069
4– %20 Mini-PROTEAN TGX Jel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Mavi Güvenli Protein Lekesi	Fisher	PI-24592
Moleküler Görüntüleyici VersaDoc MP 4000 Sistemi	BioRad	170-8640
Corning Transwell Geçirgen Destekler	Corning	3421
Accuri C6 Akış Sitometresi	BD Biosciences
Dulbecco' S Fosfat Tamponlu Salin	Sigma	D8537
Pyrogent plus kiti	Fisher	NC9753738