Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller

12.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

4 Ocak 2015

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Bu makalede

Özet

Tümörün mikro mekanik sertliği invadopodia aktivitesini artırarak ve kasılma actomyosin ile malign davranış sürüş önemli bir rol oynar. Kullanma poliakrilamid jelleri (PAAS) invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri bükülmezlik matris yanıt olarak kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini incelemek için kullanılabilir.

Özet

Katı tümör dokuları güçlü kanser hücresi göç ve istila düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çapraz-bağlanmış dokular içinden invaziv göç proteolitik olarak hücre-dışı matrisi (ECM) indirgeme invadopodia adı aktin zengin uzantılar ile kolaylaştırılır. Invadopodia aktivitesi sertliği sinyalleri aktomizin kontraktilite yoluyla bu hücre içi yapıları düzenleyebildiğini göstermektedir ECM sertliği ve kanser hücresi kasılma kuvvetleri bağlı olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini farklı bükülmezliklerde poliakrilamid jeller (PAAS) göre invadopodia ve çekiş kuvveti testleri kullanılarak in vitro korele edilebilir. Kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini farklı bükülmezliklerde poliakrilamid jeller (PAAS) göre invadopodia ve çekiş kuvveti testleri kullanılarak in vitro korele edilebilir. İki tahliller arasında bazı farklılıklar vardır, ancak burada sunulan protokol inci PAAS oluşturmak için bir yöntem temin etmektedirHer iki deneylerinde kullanılabilir ve kolayca kullanıcının belirli bir biyolojik ve teknik ihtiyaçlarına adapte edilebilir edilebilir.

Giriş

tümör ilişkili ECM sertliği aktomizin kasılma 1-3 artırarak malign davranış sürüş önemli bir faktör olarak tespit edilmiştir. Bu etki ilk olarak göğüs kanseri hücreleri ile gösterilmiştir, matris sertliği diğer kanser türü bir rol oynayabileceğini tümör sertliğini gösteren kanser 4-8 çeşitli türetilen hücre invaziv özelliklerini değiştirmek için bulunmuştur. Invaziv göç sırasında çapraz bağlı dokulara nüfuz etmek, kanser hücrelerinin fokal ECM 9 aşağılamak için proteinazı lokalize invadopodia olarak bilinen aktin-zengin yapışkan uzantıların kullanılması. Invadopodia invaziv hücrelerinin bir işareti olarak düşünülen ve tümör hücre istilası ve metastaz 10,11 implike edilmiştir. Önceki çalışma matris sertlik invadopodia numaralarını düzenleyen göstermiştir ve miyozin II faaliyet ve mechanosensitive proteinler 12 ile ECM bozulmasını 4,12 ilişkili olmuştur. VerilmişTümör yoğunluğu ve kanser saldırganlık 13,14 arasındaki korelasyon, bu sonuçlar kanser hücrelerinin aktomizin kontraktilitesinde yoluyla işgali ve metastaz sürücü sert tümör dokularına yanıt verebilir bir mekanizma öneririz.

Nitro ECM sertlik ve in vivo doku yoğunluğunun kanser hücrelerinin 1,15-17 invaziv davranışını düzenleyen gösterilmiştir. Aktomizin kontraktilite, bu süreçte önemli görünmektedir iken, metastatik kapasite artışı ile ilişkilendirilmiştir ya da kasılma kuvvetleri 6,18-20 azalma olup olmadığı gibi mevcut çalışmalar çatışma. Ayrıca, bu güçlerin doğrudan invadopodia aktivitesini 21 arabuluculuk olmadığını bilinmemektedir. Biz son zamanlarda kanser hücresi kasılma kuvvetleri matris sertlik bağımlı ve invadopodia 5 ile ECM bozulma belirleyici olduğunu buldu. Bu sonuçlar hücresel kuvvetler invadopodia ac aracılık kanser ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedirtümör mikro-mekanik özelliklerine yanıt olarak bilirlik.

Kanser hücrelerinin 5 invaziv ve kasılma özelliklerini ilişkilendirilmesi için, daha önceden sertliği bağımlı invadopodia aktivitesi 4,12,22 araştırmak için kullanılmıştır, farklı sertliklere sahip PAAS oluşturmak için bir protokol yapılması. Kimyasal PAAS boyunca insan plazma fibronektinin çapraz olarak, bu modifiye edilmiş hidrojeller hücreler iki deneyde 5 aynı katılıkları deneyimli sağlamak için invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri hem de baz olarak kullanılabilir. Invadopodia deneylerinde, fibronektin matris bozulmasını tespit PAAS için Kaplanmış ECM bağlantı jelatin bir doğal bağlanma alanı içerir. Çekiş kuvveti deneylerinde, fibronektin hücresel çekiş kuvvetleri hesaplamak için kullanılan mikroküreli değiştirmeleri tespit doğrudan hücresel yapışma için bir ligand sağlar. Biz sert, yumuşak adlandırdıkları Bu yöntem sonuçları,normal ve kanserli dokuların 23 rapor mekanik özelliklerinin aralığını kapsayan hangi Pa 5 1023, 7307, ve 22.692 arasında, cam alt yemekleri bağlı ve elastik modüle, E sahiptir sert PAAS.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

PAAS Cam lameller 1. Hazırlık

  1. Düşük tüy bırakmayan mendil ile temizleyin 12 mm lamelleri.
  2. Alev 12 mm lamelleri ve cımbız kullanarak Bunsen beki alevi geçirerek her 35 mm cam alt çanak kuyucuklarda 14 mm lamel.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 N NaOH, 200 ul mikro tedavi edin.
  4. Aspire ve hava 30 dakika mikro kurulayın.
  5. Çeker ocak içinde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3-aminopropiltrimetoksilan 50-100 ul mikro tedavi edin. Bu kimyasal plastik tepki gösterir; Bu nedenle, cam pipet kullanın ve çanak plastik ile temasını engellemek için tamamen mikro doldurmak değil.
  6. 3-aminopropiltrimetoksisilan berrak hale gelene kadar yaklaşık olarak 10 dakika için ultra-saf su ile mikro-yıkayın.
  7. Saf su iki kez sıkmak şişe kullanarak mikro durulayın.
  8. Saf su, a 2 ml mikro yıkayın10 dakika boyunca orta hızda (yaklaşık 1 Hz) ayarlanmış bir rocker t oda sıcaklığı.
  9. Aspire ve hava 30 dakika mikro kurulayın.
  10. 30 dakika için orta hızda (yaklaşık 1 Hz) ayarlanmış bir rocker oda sıcaklığında 0.5% glutaraldehit solüsyonu 2 ml mikro tedavi edin.
  11. 10 dakika boyunca orta hızda (yaklaşık 1 Hz) ayarlanmış bir rocker oda sıcaklığında, aşırı saf su, 2 ml ile mikro yıkayın. 30 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  12. 30 dakika boyunca bir dik açıda (60 ° ya da daha yüksek) bir kuru mikro-.
    Not: Tabaklar bir desikatör içinde 2 ay boyunca saklanabilir.

Invadopodia Tahliller için PAAS 2. hazırlanması

  1. Yumuşak PAA (% 8 akrilamid ve% 0.05 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 200 ul,% 2 BIS 25 ul ve ultra saf su 574 ul (Tablo 1) bir araya getirir.
  2. Sabit PAA (% 8 akrilamid ve% 0.35 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 175 ve # 200 ul birleştirme181 l% 2 BİS ve ultra saf su 409 ul (Tablo 1).
  3. Katı PAA (% 12 akrilamid ve% 0.60 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 300 ul,% 2 BIS 300 ul ve ultra saf su 169 ul (Tablo 1) bir araya getirir.
  4. 15 dakika için çözümler degas. Sırasıyla, sert, yumuşak ve sert PAA çözümleri için, aşırı saf su içinde 1 mg / ml insan plazma fibronektinin 200, 215, ve 230 ul ekle. Tüm solüsyonlar için, 10 mg / ml akrilik asit, N-hidroksisüksinimid (NHS) ester 1 ul, 100 mg / ml amonyum persülfat 5 ul ve N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin (TEMED 2 ul Tablo 1). Nazik pipetleme ile karıştırın ve çözümleri kabarcıkları oluşturarak kaçının.

PAA
(1 mi) 		% 40
AA
(Ul) 		% 2
BIS
(Ul) 		Ultrapure
Su
(Ul) 		1 mg / ml
FN
(Ul) 		10 mg / ml
NHS ester
(Ul) 		100 mg / ml
APS
(Ul)
TEMED
(Ul) 		Elastik
Modül
(Pa)
Yumuşak 200 25 574 200 1 5 2 1023
Sert 200 175 409 215 1 5 2 7307
Sert 300 300 169 230 1 5 2 22.692

Tablo 1: Bileşen VOLUmes ve invadopodia deneylerinde kullanılan, sert, yumuşak ve sert PAAS için elastik modüle sonuçlanır. AA = akrilamid, FN fibronektin, APS = amonyum persülfat =.

  1. Her kuyucuklarda merkezine üzerine PAA çözeltisi 8.48 ul pipetle.
    Not: Bu birim teorik kalınlığı 75 mikron bir PAA verir.
  2. Yavaşça cımbız kullanarak kuyucuklarda olarak damlacık için 12 mm lamel Alevli tarafını düşük.
  3. Sandviç PAA çözüm 15-30 dakika süreyle polimerize izin verin. Artık çözüm kontrol ederek polimerizasyonu doğrulayın.
  4. Her yemeğin 1x PBS 2 ml ekleyin ve cımbız ile 12 mm lamelleri kaldırın.
    Not: 10x PBS laboratuarda yapılan ve 0.011 M KH 2 PO 4, 1.54 M NaCI, ve 0.056 M Na-2 HPO 4 oluşmaktadır.
  5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x PBS, 2 ml ile mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.

3. PÇekiş Gücü Tahliller için PaaS onarımı

  1. Yumuşak PAA (% 8 akrilamid ve% 0.05 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 200 ul,% 2 BIS 25 ul ve ultra saf su 566 ul (Tablo 2) bir araya getirir.
  2. Sabit PAA (% 8 akrilamid ve% 0.35 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 200 ul,% 2 BIS 175 ul ve ultra saf su 401 ul (Tablo 2) bir araya getirir.
  3. Katı PAA (% 12 akrilamid ve% 0.60 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 300 ul,% 2 BIS 300 ul ve ultra saf su 161 ul (Tablo 2) bir araya getirir.
  4. 15 dakika için çözümler degas. Sırasıyla, sert, yumuşak ve sert PAA çözümlerine 1 mg / ml insan plazma fibronektinin 200, 215, ve 230 ul ekle. Sonikasyon 30 saniye için 200 nm kırmızı flüoresan mikroküreler (580/605 nm uyarım / emisyon) 8 ul. Her çözüm için, 200 nm kırmızı floresan mikroküreler 8 ul ekleyin10 mg / ml akrilik asit, NHS esteri 1 ul, 100 mg / ml amonyum persülfat 5 ul ve TEMED (Tablo 2) 2 ul. Nazik pipetleme ile karıştırın ve çözümleri kabarcıkları oluşturarak kaçının.

PAA
(1 mi) 		% 40
AA
(Ul) 		% 2
BIS
(Ul) 		Ultrapure
Su
(Ul) 		1 mg / ml
FN
(Ul)
Mikro-küreler
(Ul) 		10 mg / ml
NHS ester
(Ul) 		100 mg / ml
APS
(Ul)
TEMED
(Ul) 		Elastik
Modül
(Pa)
Yumuşak 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Sert 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Sert 300 300 161 230 8 1 5 2 22.692

Tablo 2:. Madde hacimleri ve çekiş kuvveti deneylerinde kullanılan, sert, yumuşak ve sert PAAS için elastik modüle ortaya çıkan AA = akrilamid, FN fibronektin, APS = amonyum persülfat =.

  1. Her kuyucuklarda merkezine üzerine PAA çözeltisi 8.48 ul pipetle.
    Not: Bu birim teorik kalınlığı 75 mikron bir PAA verir.
  2. Yavaşça th Alevli tarafını düşürmekcımbız kullanarak kuyucuklarda olarak damlacık e 12 mm lamel.
  3. Sandviç PAA çözüm 15-30 dakika süreyle polimerize izin verin. Artık çözüm kontrol ederek polimerizasyonu doğrulayın.
  4. Her yemeğin 1x PBS 2 ml ekleyin ve cımbız ile 12 mm lamelleri kaldırın.
  5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x PBS, 2 ml ile mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.

Invadopodia Tahliller için ECM 4. hazırlanması

  1. 37 ° C'ye kadar jelatin solüsyonu (% 1 jelatin ve% 1 sukroz) ısıtın.
  2. 45 ° açıyla cam alt yemekleri tutarken mikro altından dikkatlice aspire sonra 1 dakika boyunca jelatin çözeltisi 150 ul PAAS davranın.
  3. 60 dakika boyunca kurutma optimize etmek için dik bir açı (60 ° veya daha yüksek), bir mikro-PAAS üzerindeki jelatin kalan ince bir tabaka kurutun.
  4. I soğutulmuş bir% 0.5 glutaraldehid çözeltisi 2 ml mikro tedavi30 dakika boyunca oda sıcaklığında, ardından 15 dakika boyunca ce.
  5. 5 dakika boyunca, bir 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  6. 1 dakika süre ile, bir sodyum borohidrit solüsyonu 2 ml mikro tedavi edin. Yavaşça jelatin yüzeyinde oluşturan kabarcıklarını çıkarmak için bankta yemekleri dokunun.
  7. Aspire 5 dakika için 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  8. 15 dakika boyunca 4 ° C'de 175,000 x g'de 50 ug / 1x PBS ilave edildi ve santrifüj bir FITC-işaretlenmiş insan fibronektin çözeltisi ile seyreltilir. Ya piyasada mevcut etiketli fibronektin satın almak veya aşağıdaki gibi etiket:
    1. Diyaliz tüpünden borat tampon maddesi (170 mM sodyum metaborat tetrahidrat ve 40 mM NaCI) ve yerine 10 ml fibronektin 5 mg eritin.
    2. Bir manyetik karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında çözülmüş FITC 6 mg borat tamponu, 200 ml borunun yerleştirilmesi ile fibronektin Etiketkaranlıkta 1.5 saat için en düşük ayarlanmış ve.
    3. İki hacim ile karanlık bir soğuk odada (4 ° C) 'de 3 gün boyunca düşük ayarlanmış ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde 1 x PBS, 500 ml diyaliz günde değiştirir.
    4. (1: 200) ile seyreltildi alikotları optik yoğunluğuna bağlı olarak hesaplayın FITC etiketli fibronektin konsantrasyonu 280 nm ve 493 nm olarak [OD 280 - (0.36 x OD 493)] / 1.4 kat 200 kat 2 seyreltme faktörü (hesaplarını mg / ml birimleri olarak elde edilen bir sonraki aşamada fibronektin konsantre gliserol) dir.
    5. Gece boyunca 4 ° C de karanlık bir soğuk odada düşük ayarlanmış ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde,% 50 gliserol çözeltisi, bir gece boyunca diyaliz).
  9. Karanlıkta 60 dakika boyunca oda sıcaklığında ve FITC ile işaretlenmiş fibronektin solüsyonundan 150 ul mikro tedavi edin.
  10. Cam alt yemekleri tutarken dikkatli mikro altından FITC etiketli fibronektin çözüm aspire45 ° 'lik açı ve daha sonra sterilizasyon için karanlık bir hücre kültürü kaputu 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 70 etanol çözeltisi ile cam alt yemekler doldurun. Ayrıca cam alt çanak kapaklarını doldurmak veya% 70 etanol batırılmış düşük tüy bırakmayan mendil ile silin.
  11. 5 dakika boyunca 1 x PBS ile doldurularak cam alt yemekler yıkayın. 15 dakikalık bir toplam 1x PBS ve 2 ml iki kez daha tekrarlayın.

Invadopodia Tahliller 5. hazırlanması ve Görüntüleme

  1. (1: DMEM ve% 5 düşük-protein serumu,% 10 fetal sığır serumu ve taze eklenen epidermal büyüme faktörü 20 ng / ml ile aynı miktarda RPMI 1640 1) cam alt yemek ve invadopodia ortamının 2 ml 25,000 kanser hücrelerini ekleme gece inkübe.
  2. Aspire hücreleri düzeltmek için 20 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında% 3.7 paraformaldehid, 2 ml ile mikro tedavi etmek ve.
  3. 1x PBS ve 2 ml iki pratik yıkamadan sonra, oda Tempe bir% 0.1 Triton X-100 çözeltisi, 2 ml ile mikro tedavi5 dakika süreyle karanlıkta rature hücreleri geçirgenliği.
  4. 1x PBS içinde 2 ml bir hızlı yıkamadan sonra,% 3 sığır serum albümini 60 dakika hücreleri engellemek için karanlıkta, oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi ile mikro-muamele.
  5. 60 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir çözüm engelleme: fare anti-cortactin antikoru (750 1), 150 ul mikro inkübe edin.
  6. 5 dakika boyunca 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  7. (: 1: 500) ve 546 falloidinle (1: 750) 60 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında çözelti bloke keçi 150 ul anti-fare antikoru 633 mikro inkübe edin.
  8. 5 dakika boyunca 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  9. Her kuyu doldurun ve 22 x 22 lamelleri ile karşılamak için montaj orta altı damla ekleyin.
  10. Resim cortactin aktin 632/647 nm'lik eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanılarak invadopodia tespit etmek ve556/570 nm, sırasıyla, bir geniş alan ters mikroskop ile, yüksek NA 40X yağa batırılmış objektif kullanarak. Benzer şekilde, görüntü fibronektin 492/518 nm'lik bir eksitasyon ve emisyon filtresi kullanılarak ECM bozulma tespit etmek.

6. Hazırlık ve Çekiş Gücü Tahliller Görüntüleme

  1. Cam alt yemekleri invadopodia ortamının 2 ml 15.000 kanser hücreleri ekleyin ve gece boyunca inkübe edilir.
  2. Cam alt tabaklarında Kültür ortamı basınçla aynı takviyeleri (% 5 düşük-protein serumu,% 10 fetal sığır serumu ve taze eklenen epidermal büyüme faktörü 20 ng / ml), Önceden L-15 ortamına 2 ml ile değiştirin 37 ° C -warmed.
  3. Bir ters mikroskop 1 saat boyunca yüksek nem ile 37 ° C'de önceden dengelendi ile bir çevre odasında cam alt yemekler inkübe edin.
  4. Hücresel pozisyonlarını işaretlemek için yüksek NA, otomatik evre bir geniş alan ters mikroskop 40X lens kullanarak görüntülerin dört setleri atın:
    1. Üzerine resim hücreleriFaz kontrast ("faz" resim) kullanarak PAAS p.
    2. PAAS üstündeki mikro kürelerinin birinci tabaka kadar hücreler biraz altında odaklanarak 560/645 nm'lik eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntü floresan mikrosferleri odağa geldiği (görüntü "stresli").
    3. Buna ek olarak, (belirteç olarak küreleri kullanılarak) PaaS altına odaklanmak ve ("alt" görüntü) bir görüntü almak. Not: Bu resim amacı Örnek Sonuçlar tarif edildiği gibi çekme gücü hesaplamaları için her pozisyondaki gerçek PAA kalınlığı elde etmek için z-pozisyonunu tespit etmektir.
    4. Bu görüntüler çoklu pozisyonlarda elde edilmiş sonra, yavaşça hücrelerin çıkarılması için% 10 Triton-X-çözeltisi 220 ul karıştırın. Daha önce tarif edildiği gibi ("sıfır" görüntü) her pozisyonda PAAS üstünde görüntü mikro-küreler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Invadopodia tahlilinde, invadopodia tipik olarak hücre gövdesi içinde birkaç noktalı yapı ile aktin ve cortactin gibi belirteçler (Şekil 1) bir sınırlama ile tanımlanır. Hem aktif bozundurucu ve bozmaz invadopodia sayılabilir ve bu yapıların FITC etiketli fibronektin (Şekil 1) 'deki flüoresan sinyal eksik siyah alanlar ile lokalize edilip ayırt edilir. Invadopodia el sayılır ve hücre başına ECM bozulma el hücre hatları olan bu siyah alanlar eşikleme belirlenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu invaziv ve kontraktil hücresel davranış ilişkilendirmek için invadopodia ve çekiş kuvveti testleri için temel olarak kullanılabilir PAAS imal edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır. PAAS, hücrelerin üzerindeki sertlik etkilerine bakmak ve çekme kuvvetlerinin 18,24,27 hesaplamak için kullanılmış olsa da, bu protokol matrise karşılık invazif ve kontraktil hücresel davranışları ilişkili aynı bükülmezliklerde PAAS göre paralel analiz geliştirme ilk mekanik özellikleri. Düzgün cam alt yemekleri lamelleri aktive...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu eser Ödülü Numarası K25CA143412 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü (Parekh) tarafından desteklenmiştir. Biz ek destek Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı tarafından sağlanan olduğunu kabul etmek istiyorum. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-AminopropiltrimetoksisilanSigma-Aldrich281778
Akrilamid (%40)Bio-Rad161-0140
Akrilik asit NHS esteriSigma-AldrichA806010 mg / ml çeker ocakta taze hazırlayın
Yaşam TeknolojileriA22283ayrıca rodamin
Amonyum persülfatBio-Rad kullanabilir161-07001x PBS Aqua Poly / Mount Polysciences'ta taze% 10'luk çözelti hazırlayın
18606mikro kuyuları doldurmak için 6 damla kullanın
BIS (% 2)Bio-Rad161-0142
Sığır serum albüminiRPIA300751x PBS'de çözeltiyi bloke etmek için% 3 yapın ve 4 & derecede saklayın; C
Lameller (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
diyaliz tüpüSigma-AldrichD977715 - 30 dakika boyunca borat tamponunda ön denge
DMEMCellgro10-013-CVinvadopodia ortamı yapmak için kullanın
DMSOSigma-AldrichD8418akrilik asit yapmak için kullanın NHS ester çözeltisi
Epidermal büyüme faktörüÖmrü Invadopodia ortamıiçin PHG0311
EtanolPHARMCO-AAPERE200ultra saf su ile %70'e kadar seyreltin
FBSThermo ScientificSH30070.03invadopodia ortamı yapmak için kullanın
FITCSigma-AldrichF7250ışıktan koruyun
JelatinPolysciences00639tipik olarak PBS'de 10 ml %1 sükroz / %1 jelatin çözeltisi yapın ve 4 ° C'de saklayın; C (jelatini kolayca çözmek için PBS'yi önceden ısıtın)Cam
alt tabaklar (35 mm lameller)MatTekP35G-0-14-Clameller kaplamasızdır
Gluteraldehit (%25)Polysciences019091x PBS ile seyreltin ila %0,5
Keçi anti-fare Alexa Fluor 633 antikoruYaşam TeknolojileriA21050
İnsan plazma fibronektinYaşam Teknolojileri33016-0151 mg / ml yapmak için 5 ml ultra saf su ekleyin; aşırı donma ve çözülme döngülerini önlemek için kullanıma dayalı hacimlerde
alikot KH2< / sub>PO4< / sub>EMD MilliporePX-1565-110x PBS stoğu yapmak için kullanın
Fare anti-kortaktin 4F11 antikoruEMD Millipore05-180
Na2< / sub>HPO4< / sub>EMD MilliporeSX-0720-110x PBS stoğu yapmak için kullanın
NaClRPIS2302010x PBS stoğu ve borat tamponu NaOH
(1 N)Sigma-AldrichS2770ultra saf su ile 0.1 N
Nu-Serum'a (düşük proteinli serum)BD Biosciences355500invadopodia ortamı yapmak için kullanılır
ParaformaldehitAcros416785000tipik olarak 1x PBS'de %10 stok yapın, çeker ocakta hazırlayın ve paraformaldehiti kolayca çözmek için birkaç ml güçlü NaOH ekleyin, ardından güçlü HCl ile pH 7.4'e geri getirin
PBS (steril)Cellgro21-040-CVhücre kültürü için kullanım
RPMI 1640Cellgro10-040-CVinvadopodia ortamı yapmak için
Sodyum borhidrürSigma-Aldrich4528821x PBS'de 1 mg / ml çeker ocakta taze hazırlayın
Sodyum metaborat tetrahidratSigma-AldrichS0251borat tamponu yapmak için kullanılır
SükrozRPIS24060tipik olarak PBS'de 10 ml %1 sükroz/%1 jelatin çözeltisi yapar ve 4 ° C'de saklar; C (jelatini kolayca çözmek için PBS'yi önceden ısıtın)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA160461x PBS'de% 10 stok yapar ve çekiş kuvveti testinde hücre çıkarılması için olduğu gibi kullanın veya boyama için 1x PBS ile seyreltin
DMSO Alexa Fluor 546 falloidin içinde , yapmak teknolojiler, yapmak için kullanılır, , seyreltilir, , ) kullanın , ,

Kaynaklar

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572(2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015(2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnvadopodya DeneyleriKanser Hücresi MigrasyonuECM RijiditesiFloresan MikroskobuCam Lamel AktivasyonuFibronektin KaplamaMikroküre Yer DeğiştirmeHidrojel Kalınlığı
Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.