Yöntem makalesi

Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

DOI:

10.3791/52351

⸱

10 Ocak 2015

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimize edilmiş insan periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) ex vivo tahlilleri kullanarak, yanıcı bir tütün ürünü preparatının, efektör PBMC'lerin reseptör aracılı hücre içi salgılanan sitokinleri ve sitolitik yeteneğini belirgin şekilde baskıladığını gösterdik. Bu hızlı tahliller, ürün değerlendirmesinde ve tütün maruziyetinin potansiyel uzun vadeli etkilerinin anlaşılmasında faydalı olabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diğer patofizyolojik değişiklikler arasında, sigara dumanı kronik bir maruziyetin, mikrobik enfeksiyonlar ve tümör insidansı içenlerin artan hassasiyet ile bağlantılı olan enflamasyon ve bağışıklık bastırılması neden olur. Ex vivo insan periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde reseptör aracılı bağışıklık tepkilerinin bastırılması (PBMC) duman bileşenleri ile tedavi mekanizmaları incelemek ve tütün ürünlerine maruz muhtemel uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için cazip bir yaklaşımdır. Burada, bakteriyel lipopolisakarit, bir Toll benzeri reseptör 4 ligand ile uyarılmış PBMC ile eks vivo tahliller yapmak için yöntemler iyi duruma getirilmiştir. Bütün duman koşullu ortam (WS-CM) etkileri, yanıcı bir tütün ürünü preparatı (TPP) ve nikotin ex vivo deneylerde PBMC'ler tarafından sitokin salgılanması ve hedef hücre öldürme etkisi incelenmiştir. Bu göstermektedir ki, salgılanan sitokinler, IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 ve IL-8 ve hücre içi sitokin IFN-47 ;, TNF-α ve MIP-1α WS-CM-maruz kalan PBMC'de bastırıldı. bir K562 hedef hücre öldürme deneyi ile belirlendiği gibi efektör PBMC sitolitik fonksiyon aynı zamanda, WS-CM maruz bırakılarak indirgenmiştir; Nikotin, bu deneylerde minimal bir etkiye sahip olmuştur. Özet olarak, eks vivo deneylerde TPPs etkilerini değerlendirmek için geliştirilmiş deneylerde, bir dizi mevcut ve bu yöntemler, hali hazırda ilgi konusu olan diğer ürünlerin test edilmesi için adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyovasküler hastalık (CVD), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve kanser gibi kronik 1,2 sigara içiminin olumsuz sağlık etkileri için bilgi noktalarının önemli bir vücut. Kronik sigara içiminin inflamasyon ve immün baskılanması neden olduğu bilinmektedir ve bu değişiklikler sigara içenlerde 3 mikrobiyal enfeksiyon ve kanser riskine katkıda bildirilmektedir. In vitro ve ex vivo teknikleri yararlıdır patofizyolojik etkileri moleküler temelini aydınlatılmasında sigara dumanı 4-9 (Tablo 1) ve çeşitli tütün ürünleri 10,11 ortaya çıkan yönetmelik yönlendirmek için önemli araçlar olarak kabul edilmektedir.

Örneğin, biz böyle bütün duman klimalı ortamda (WS-CM) ve toplam partikül madde (TPM) gibi yanıcı tütün ürünü preparatları (TPPs) çok daha sitotoksik ve zarar için olduğunu göstermiştirYanıcı olmayan TPPs veya nikotin 12,13 den DNA. Yayınlanan çalışma ile tutarlı olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs veya nikotin 12,13 olduğu bildirildi. Yayınlanan çalışma ile uyumlu olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs belirgin immunosupresyonun neden olduğunu bildirdi. Bu reseptör (TLR) -ligands gibi Toll- bastırılması ile kanıtlanmıştır, ex vivo modelde 14 PBMC'ler tarafından öldürülmesi (K562) sitokin salınımını stimüle, ve hücre hedefli. Sigara dumanı kaynaklı hastalık süreçlerindeki enflamasyon önemi göz önüne alındığında, sigara dumanı, bağışıklık düzenleyici etkilerini değerlendirmek için test koşulları daha fazla optimizasyon Bu raporda sunulan edilir.

Ex vivo tahliller tipik olarak hücre içi ölçülmüş ve sitokinler gibi tahliller 14 öldürme k562 hücresinin sitotoksik T ve NK hücrelerinin sitolitik fonksiyon salgılanan. deneyler, WS-CM ve nikotin ile PBMC'nin sonraki stimülasyonu ile ön inkübasyon söz konusuTLR ile s, 3 günlük bir süre boyunca agonistleri; son okumalar enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) kullanılarak ve / ya da akış sitometrisi uygulanır. Bu TLR-4 reseptörlerine bağlanmakta ve PBMC'ler, hücre içi sitokin ve sitokinlerin sekresyonu üretimi ile sonuçlanan uyaran bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) kullandı. Izole PBMC'ler, hücre ölümü deneyleri ve IL-8 miktar tayini için TPPs, aynı zamanda, bu yöntem immünomodülatör etkisini değerlendirmek için çeşitli deney adımları optimizasyonuna ek olarak. Bu yöntemler, diğer araştırma soruları için uygulanan ve düzenleyici bağlamda, tütün ürünler için özel olarak rafine edilebilir.

Tablo 1. in vitro raporları Yayınlandı ve ex vivo yöntemler tütün ürünü hazırlıkları varilus patofizyolojik etkilerini incelemek için kullanılan CS, sigara dumanı ortamı.; CSC, sigara duman yoğunluk; CSE, sigara dumanı özü; ELISA immünosorbent deneyi enzim-bağlı; GADPH, gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz; QPCR, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; RT, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; TS, tütün dumanı.

Yazar (Ders yılı) Schouwburgplein ve ark. (2004) Moodie ve ark. (2004) Oltmanns ve ark. (2005) Vayssier (1998) Witherden ve ark. (2004) Birrell ve ark. (2008)
Hücreler kullanılan İnsan bronş endotel hücreleri (BEAS-2B), insan nötrofil İnsan alveolar epitel hücreleri (A549) İnsan solunum yolu düz kas hücreleri (HASMC) İnsan premonocytic U937 hücreleri, insan monositleri Alveoler tip II epitel hücreleri (ATII) İnsan monositikhücre hattı (THP-1), insan akciğer makrofajlar
DYP kullanılan CSE CSC CSE TS CSE CS
Yöntem kullanılan ELISA, QPCR, göç, Elektrodevingenlik kayması Immunhisto kimya, elektroforez, Arrayscan seti, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforez Jel-mobilite kayma Işık mikroskobu, elektron mikroskobu, elektroforez, ELISA QPCR ELISA, E-toxate kiti (Sigma), p65, plaka deneyi (TransAM), elektroforez, çeşitli bağışıklık kitleri
Tedbir IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, göç Histon asetiltransferazlar histon deasetilazlar, NF-KB, IL-8, ul kB-α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaksin Isı şok / stres proteinleri (HSP / Hsp70), HF transkripsiyon faktörü NF-KB,TNF-α Yüzey Aktif protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α MAPK / JNK / ERK fosforilasyonu, cJun: DNA bağlama, glutatyon, p65: DNA bağlama
Sonuç CSE AP-1 aktivasyonu bastırılması yoluyla sitokin üretimini aşağı-düzenler. H 2 O 2 ve CSC farklı olarak, histon deasetilaz etkinliğini azaltmak, histon proteinlerin asetilasyonunu geliştirmek proinflamatuvar sitokin salınımını düzenler. Sigara dumanı, sigara dumanı TNF-α,% 20 CSE daha az, IL-8 salıverilmeleri, eotaksin inhibisyonu ve RANTES tarafından geliştirilmiş HASMC IL-8 salıverilmesini neden olabilir. TH Hsp70 ekspresyonu ve aktivitesi ve TNF-α serbest bağlanma NFkB'nin inhibe edilmesi ile ilişkili HF transkripsiyon faktörü, aktif. Azaltılmış ATII hücresinden türetilmiş kemokin düzeyleri ile uygun düşmek Alveolar onarım, sigara dumanı kaynaklı alveol hasarı ve amfizem katkıda bulunmaktadır. Veriler neden sigara arttı solunum yolu enfeksiyonları için mekanistik açıklama. Doğal tepkinin bastırılması, IL-8 bir artış eşlik etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Yazılı onam bu çalışmayı yapmak İyi Klinik Uygulamaları başına, IRB onayı altında yerel bir klinik araştırma birimi elde edilmiştir. Kan işleme, PBMC'ler ve diğer hücre kültürü izolasyonu mikrobiyolojik steril malzemeleri ve reaktifler kullanılarak steril koşullar altında gerçekleştirilir.

1. WS-CM Hazırlık

  1. Daha önce açıklandığı gibi 12 WS-CM oluşturun.
    1. 35-60-2, ml puf hacmi, saniyede puf aralığı, ve puf süresi: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Aşağıdaki sigara rejimi kullanan kırmızı fenol olmadan 1640 aracılığıyla dört 3R4F referans sigara dumanı geçirerek WS-CM hazırlayın sırasıyla saniye içinde. Her preparasyon bir 20 ml lik bir numuneyi oluşturur.
  2. Tarih, tamamlanmış zaman ve sigara adı ve numarası ile Etiket tüp (ler). -80 ° 500 ul tümbölenleri hemen sigaradan sonra tamamlanır C saklayın.
  3. Dondurulmuş WS hacimde analizDaha önce açıklandığı gibi 12 -CM nikotin, tütün özel nitrosamine ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar düzeylerini belirlemek için.

PBMC 2. izolasyonu

  1. (Tütün ürünlerinin olmayan tüketiciler) sağlıklı donörlerden taze kan toplayın Wake Forest Baptist Sağlık IRB 15 ayrı onayı altında aşağıda açıklandığı gibi taze kan PBMC'leri izole.
    1. Kan torbasının varmadan önce, 500 ml şişe, makas, izolasyon tampon ve Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) (RT), bir biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) hücre kültürü kaputu hazır. İzolasyon tampon ışıktan korunmalıdır.
    2. Baş aşağı kan torbasını tutun ve sadece borunun en az 3 cm bırakarak kenetlenmiş olan yerin altındaki tüp kesti.
    3. 500 ml şişe kapağını çıkarın ve şişe açıklığının üzerindeki tüp tutun. Kan torbası Pick up ve kan t içine çantasından serbestçe akmasına izin için tersçanta boş dek şişe. Kan hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için düz aşağı olarak karşı şişenin iç duvarına üzerine akmasına izin verin.
    4. Kana izolasyon tamponunda 5: 1 oranında bir şişeye yalıtım tamponu dökün. Sonu aşırı uç, 10 kere, sıkıca şişe kapağı ve yavaşça çevirin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, ışık ile kapalı inkübe hücre kültürü kaputu şişe bırakın.
    5. Bir ışık, saman renkli tabaka kan üzerine kuracaksınız. 50 ml konik tüpler içine 25 ml serolojik pipet kullanarak bu katmanı kaldırın. Kan bağışında konuya bağlı olarak, 300 ml - toplanan miktar 50 arasında değişebilir.
    6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'de tüpler santrifüjleyin.
    7. Koyu kan renkli pelet bırakarak, saydam süpernatant aspire. Pelet gevşek ama viskoz olacaktır.
    8. Pipet 15 ml konik tüpler içine izolasyon tampon 3 ml.
    9. Tekrar süspansiyon pelet, S toplanan saman renkli bir sıvı, her 50 ml DPBS 20 ml ilave2.1.5 TEP. Vortex iyice karıştırın, ve birden tüpler yeniden süspanse sıvıyı pekiştirmek için. Bu sıvı, kan hücreleri askıya içerir.
    10. Bir transfer pipeti, Aşama 2.1.8 yalıtım tamponu, 3 ml üzerine bir transfer süspansiyon kan hücreleri, 5 ml. İki ayrı katmanlar oluşturmak için yavaş ve nazikçe hücre süspansiyonu içeren 15 ml konik tüp eğin. Minimal ivme ile ve frensiz oda sıcaklığında 40 dakika için 400 xg'de tüpler santrifüj.
    11. 50 ml konik tüp içine PBMC'leri içeren ortaya çıkan bulutlu orta tabaka (buffy coat) kaldırmak için bir transfer pipeti kullanın. Bunun altındaki diğer açık katmanları çizim kaçının. Her biri 50 ml konik bir tüp içine en fazla 25 mi aktarın.
    12. Hücreleri yıkamak için (50 ml konik tüp, tüm kalan hacminin doldurulması için ya da daha fazla) akan soğuk tampon maddesi 25 ml ilave edilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de hücreleri santrifüjleyin.
    13. Tampon çalışan 10 ml pelletini. Bu PBMC içerir. Hücreleri saymak ve im kullanındolaylı olarak ya da yer dondurma buz üzerinde.

3. Dondurma ve PBMC'leri Çözülme

  1. Santrifüj 400 x g'de 10 dakika boyunca aşama 2.1.13 toplandı PBMC'ler.
  2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropil alkol ile dondurma doldurun. DİKKAT: izopropil alkol yanıcı ve akut toksik.
  3. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ihtiva eden RPMI 1640 ortamı (4 ° C) pelet yeniden süspanse edin. Bu RPMI 1640 donma ortamıdır. 5 x 10 7 hücre / ml içeren bir süspansiyon ile sonuçlanacaktır orta dondurma bir miktar ile pelletini. Donma için kullanılabilir hücre sayısı değişecektir.
  4. 2 mi cryotubes hücre süspansiyonu, 1 ml'lik numuneler koyun ve dondurma kapta cryotubes yerleştirin. O / N depolamak ve daha sonra cryotubes çıkarın ve depolamak aktarmak için -80 ° C'de bir dondurucuda cryotubes ile dondurma kap yerleştirin-190 ° C -150 ° C arasında, kriyojenik dondurucu.
  5. Derin dondurucudaki depolamadan alınan cryotube çıkarın ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde, hafifçe çalkalanarak bunun hızlı bir şekilde eritin.
  6. Hemen,% 10 FBS,% 1 Pen / Strep ve% 1 L-glutamin içeren 10 ml RPMI 1640 ortamında (4 ° C) bir 15 mL konik tüp içine cryotube eritilir PBMC'ler aktarın. çözülmüş cryotube içeriği maksimal hücre canlılığı 15 elde etmek mümkün olduğunca çabuk transfer edilmelidir.
  7. 10 dakika boyunca 400 x g'de PBMC'leri santrifüj.
  8. 5 ml RPMI 1640 tam orta ile pelletini tekrar ve hücreleri saymak.
  9. Böyle tripan mavisi dışlama yöntemi olarak kurulan yöntemlerle hücre canlılığı ölçün. % 95 - Genel olarak, bu yöntemle hücre canlılığı ile ilgili 90'dır. PBMC'ler şimdi deneylerde kullanmak için hazır.

4. Hücre Ölümü Tespiti

NOT: Burada listelenen Seyreltmeler bu stu amaçlıdırdy. seyreltikleri buna göre değiştirilebilir.

  1. 100 ul'lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM veya nikotin seyreltin / oyuk, aşağıda belirtildiği gibi.
  2. Aşağıdaki konsantrasyonlara WS-CM seyreltilir: 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM nikotin içeriğine göre) eş-nikotin birimlerin 2,5, 3, 4, ve 5 mg / mL 12.
  3. Aşağıdaki konsantrasyonlara RPMI ortamında nikotin seyreltilir: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 ve 3000 ug / ml. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu.
  4. , 1 x 10 6 hücre / çukur konsantrasyonu ile her komple RPMI ortamı içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle. hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak.
  5. Bu çalışmanın amaçlan için, yukarıdaki gibi plakalar iki takım hazırlanır. Levhaları kapatılır ve 24 saat ve 37 ° C'de 3 saat ve% 5 CO2 için, bir plaka, bir plaka inkübe edin. Gerektiği gibi zaman noktaları ayarlayın.
  6. Buz gibi soğuk çalışan tampon 200 ul hücrelerin tekrar asılı tutulmasından son olarak, 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks tarafından oda sıcaklığında hücreleri yıkanır ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın.
  7. / Oyuk 100 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa 7-aminoactinomycin D (7AAD) 5 ul ve ardından çalışan tampon 95 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin.
  8. Küme tüplerine çalışan tampon 100 ul ekle. Küme tüplerine plakanın her kuyudan hücre süspansiyonu tüm hacmi aktarın ve akış sitometresi ile örnekleri kazanır.
  9. Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi 7AAD-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir.

5. EC50 belirlenmesi

  1. WS-CM ve nikotin EC50 değerleri PBMC'lerin 7AAD pozitif boyama ile belirlenir.
  2. EC50 değeri konsantre olarak tanımlanmaktadırentration olan hücrelerin% 50, 24 saat tahlilinde artık yaşayabilir halde olmuştur ve değerler eş-nikotin birim / ml ug olarak ifade edilir.
  3. Bu çalışmanın amaçları için EC50 değerleri, sırasıyla, WS-CM ve nikotin 1.56 ug / ml ve 1650 ug / ml olarak tespit edildi.

6. Salgılanan sitokinler

NOT: Burada listelenen Seyreltmeler Bu çalışmanın amacı içindir. seyreltme, uygun olarak ayarlanabilir.

  1. / Göz konsantrasyonunda 100 ul'lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM seyreltilir 0.3, 1.56, eş-nikotin birimleri 3 ve 5 ug / ml olmuştur.
  2. Aşağıdaki konsantrasyonlara nikotin seyreltilir: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 ve 3000 ug / mL 'dir. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu.
  3. , 1 x 10 6 hücre / çukur konsantrasyonu ile her komple RPMI ortamı içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle.hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak.
  4. Plakası kapatılır ve 37 ° C'de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir.
  5. , 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks ve son olarak buz gibi soğuk 200 ul tampon çalışan ve yıkama adım bir kez daha tekrar eden süspansiyona, oda sıcaklığında hücreleri yıkayın.
  6. RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın.
  7. Her bir oyuğa 10 ug / ml LPS ortamı 200 ul ekle.
  8. Plaka Kapak ve 4 saat, 24 saat, 48 saat ya da 37 ° C'de 72 saat% 5 CO2 inkübe edilir. Gerektiğinde inkübasyon sürelerini ayarlar.
  9. 3 dakika boyunca 300 × g plaka Santrifüj.
  10. Adım 7 ve 8 'de tahlilleri yapmak için -80 ° C'de bir dondurucuda her bir ve deposundan süpernatan 175 ul al.

7. Sitometrik Boncuk Dizisi Testi

  1. CBA tahlilde adım 6.10 ve kullanım hazırlanan hücre süpernatantlar çözülme. Üreticinin talimatlarına göre sitometrik boncuk dizisi (CBA) deneyi gerçekleştirmek.

8. IL-8 ELISA

  1. IL-8 ELISA adım 6.10 ve kullanım hücre süpernatantlar çözülme. Üreticinin talimatlarına göre ELISA testi yapın.

9. Hücre içi Boyama ve Sitometrisi

NOT: Burada listelenen Seyreltmeler Bu çalışmanın amacı içindir. seyreltme, uygun olarak ayarlanabilir.

  1. / Göz konsantrasyonunda 100 ul'lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM seyreltilir 0.3, 1.56, eş-nikotin birimleri 3 ve 5 ug / ml olmuştur.
  2. Aynı plaka aşağıdaki konsantrasyonlara nikotin seyreltik: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 ve 4000 ug / ml. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevre hazar olduğunudous.
  3. / Oyuk 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda RPMI tam ortam içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle. hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak.
  4. Plakası kapatılır ve 37 ° C'de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir.
  5. Buz gibi soğuk çalışan tampon 200 ul hücrelerin tekrar asılı tutulmasından son olarak, 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks tarafından oda sıcaklığında hücreleri yıkanır ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın.
  6. Plaka RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın.
  7. Komple RPMI ortamı kullanılarak 2 ul / ml GolgiPlug çalışma konsantrasyonunu ve 10 ug / ml LPS hazırlamak ve her bir oyuğa 200 ul ekle.
  8. 37 ° C'de 6 saat ve% 5 CO2 plaka inkübe edin.
  9. Aşama 9.8 sonunda tampon (4 ° C) çalıştıran ve 300 ile iplik hücreleri yıkayın4 ° C'de 3 dakika boyunca x g.
  10. Her bir oyuğa Cytofix 100 ul ilave edin ve 4 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
  11. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de 1x Permwash (4 ° C) ile adım 9.9 de tarif edildiği gibi hücreler 3 kez yıkayın.
  12. Aşağıdaki antikorların birisi her birinden 5 ul her bir göze, ardından 45 uL 1x Sitoperm ekleyin her bir göze: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500 MIP-1α PE. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
  13. 1x Permwash (4 ° C) ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de tamponu (4 ° C) ile çalışan bir kez aşama 9.9 de tarif edildiği gibi hücreler iki kez yıkayın.
  14. % 2 paraformaldehit (4 ° C) 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. 12 × 75 mm tüpler içine hücreleri aktarın ve akış sitometresinde örnekleri analiz. DİKKAT: Paraformaldehyde akut toksik ve bir sağlık tehlikesi, aşındırıcı olduğunu.

10. K562 Killing Testi

Not: K562 hücrelerinin yetiştirilmesi gerekenRPMI tam ortam maddesi ile 37 ° C,% 5 CO2 de kültürde bu analizden önce% 80 kaynaşmaya kadar devam edilir.

  1. Flakon DMSO 18 ul ekleyerek suksinimidil esteri (KAKE) stok solüsyonu carboxyfluorescein 5 mM hazırlayın.
  2. / Oyuk her bir için arzu edilen eş-nikotin birimleri veya nikotin konsantrasyonları elde etmek için 100 ul'lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM veya nikotin seyreltin. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu.
  3. / Oyuk 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda RPMI tam ortam içine PBMC 100 ul ekle. WS-CM veya nikotin ile hücrelerin toplam hacim 200 ul / kuyucuk olacak.
  4. Plakası kapatılır ve 37 ° C'de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir.
  5. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 400 xg'de 10 DPBS ml ve santrifüj ekleyerek K562 hücreleri yıkayın.
  6. DPBS 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve K562 hücreleri sayın.
  7. KAKE worki hazırlayın1 ml DPBS için KAKE stok solüsyonu 1 ul ekleyerek ng çözümü.
  8. 2 x 10 7 hücreleri 1 - ihtiva eden K562 hücre süspansiyonu 1 ml'ye CFSE çalışma çözeltisi 1 ml ilave edilir. Vorteks ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tam inkübe edin.
  9. Hemen FBS 200 ul ekleyin. Vorteks ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tam inkübe edin.
  10. RPMI tam ortam, 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpü.
  11. RPMI Süpernatantı ve pelet kırmak ve RPMI tam orta 10 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve KAKE-etiketli K562 hücreleri saymak.
  12. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile plaka PBMC'ler yıkayın. Sıvı boşaltılarak süpernatant aspire. Kapağı yerine takın ve plaka alt vorteks. RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın.
  13. (: 1.5 x 10 6 PBMC'ler 100,000 K562s) PBMC levha ve ayrıca her i örnek oyuğuna 1:15 oranında CFSE etiketli K562 hücreleri ekleyin37 ° C'de 5 saat ve% 5 CO2 için ncubate.
  14. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücre karışımı yıkayın. Sıvı atarak süpernatant aspire. Kapağı yerleştirin ve plaka alt vorteks.
  15. Tampon çalışan 200 ul ekleyin ve adım 10.14 bir kez daha tarif yıkama adımı tekrarlayın.
  16. / Oyuk 100 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa 7AAD 5 ul ve ardından çalışan tamponu 95 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin.
  17. Her bir oyuğa çalışan tampon 100 ul ilave edin ve küme tüplerine plakanın her kuyudan hücre süspansiyonu tüm hacmi transferi ve akış sitometresi ile örnekleri kazanır.
  18. Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi 7AAD-pozitif ve CFSE-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonuçlar ortalama (dört verici numuneleri), ortalama ± standart hatası olarak sunuldu. işlem görmüş ve görmemiş kontrol numuneleri arasındaki Student t-testi, karşılık gelen kontrol Tüm tedaviler için Excel yazılımı hem de t-testi karşılaştırmaları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık ile tespit edildi: * P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005.

WS-CM ve nikotin maruz kalma etkisini ölçmek için PBMC, 3 saat ya da 24 saat boyunca farklı WS-CM konsantrasyonlarda ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ve biz daha önce TPPs PBMC'lerin tedavi ifadesi ve sitokinler ve hedef hücre 14 öldürme fonksiyonel önlemlerin salgısı dahil olmak üzere çeşitli yanıtları bastırdığını göstermiştir. Bir önceki çalışmada tarif deneysel yöntemler daha uzun kuluçka dönemleri gerektiren ve büyüklüğü 14 mütevazı idi. Temel için bu cazip ex vivo model potansiyel uygulamalarını göz önüne alındığında ve uygulamalı araştırma, bu çok aşamalı biyolojik deneylerde deney parametrelerinin herhangi optimize olabilir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Tıp Wake Forest Üniversitesi ile ortak araştırma anlaşması kapsamında RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) tarafından finanse edilmektedir. GL Prasad RJRT tam zamanlı çalışanı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 x 75 mm tüplerBD Falcon352058
15 ml konik tüplerCorning430790
2 ml mikrotüplerAxygenMCT-150-C-S
3R4F referans sigaralarKentucky Üniversitesi, Ziraat Fakültesi3R4F
50 ml konik tüplerCorning430828
500 ml şişeCorning430282
7AADBD Pharmingen559925
96 oyuklu düz tabanlı plakaTermo Nunc439454
96 oyuklu yuvarlak alt plakalarBD Falcon353077
Hücre kültürü davlumbazıThermo Scientific1300 Serisi A2
SantrifüjEppendorf58110R
CFSEMoleküler Problar Yaşam TeknolojileriC34554
Küme tüpleriCorning4401Yutulması halinde zararlı, kanserojen
Cytofix/Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028Yanıcı
DMSO (dimetil sülfoksit)Sigma-AldrichD8418
DPBSLonza17-512F
FBSSigma-AldrichF2442
FCAP DizisiBD Biosciences652099Yazılımı, CBA verilerini analiz eder
Filtre ünitesiNalgene156-4020
Akış sitometresiBD BiosciencesFACS Canto II8 renk, Ex 405 ve Em 785'te.
Akış sitometresi,BD Biosciences,FACS, CaliburEx 495 ve Em 785'te 4 renk.
Akış sitometrisi analiz yazılımıTree StarFlowJo
Dondurma kabıNalgene5100-0001DMSO, tahriş edici
GogliPlugBD Biosciences555029Kanserojen, tahriş edici, aşındırıcı
içerir H2< / sub>SO4< sub>Sigma-Aldrich339741
İnsan İnflamatuar Sitokin KitiBD Biosciences551811
IFN-&gama; V-500 AntikorBD Horizon561980cilt hassaslaştırıcı
IL-8 ELISA KitiR ve D SistemleriDY208
İzolasyon tamponuİzolenf, CTL Scientific Corp.1114868Yanıcı sıvı, tahriş edici
İzopropil alkolSigma-AldrichW292907
L-GlutaminGibco Life Technologies25030-081
LPSSigma-AldrichL2630
MIP1-&alfa; PE AntikoruBD Pharmingen554730Akut toksisite, oral
MonensinSigma-AldrichM5273
NaClSigma-AldrichS7653
NikotinSigma-AldrichN3876Akut toksisite, çevresel tehlike
ParafilmBemis" M"
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148Yanıcı, cilt tahrişi
Kalem/strepGibco Life Technologies15140-122
RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
Çalışma tamponuMACS Koşu Tamponu, Miltenyi Biotech130-091-221
Th1/Th2 CBA KitiBD Biosciences551809
TNF-&alfa; Alexa Fluor 488 AntikorBioLegend502915
Transfer pipetiFisher Scientific13-711-20
Tris BaseSigma-AldrichT1503
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
  2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
  3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
  4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
  5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
  6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
  7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74(2005).
  8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
  9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
  10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
  11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
  12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
  13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
  14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
  15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
  16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
  17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
  18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T t n r n Haz rlamaPeriferik Kan Monon kleer H creleriSitokin Salg lanmasHedef H cre ld rmeAk SitometrisiT m Duman Ko ulland r lm BesiyeriK562 H cre ld rme AnaliziH cre i BoyamaCFSE EtiketlemeLPS Stim lasyonu

İlgili makaleler