Yöntem makalesi

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

DOI:

10.3791/52358

⸱

10 Ocak 2015

 ,  , 
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2), Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA, RWTH Aachen University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eşzamanlı hücre içi biocytin dolgulu akut beyin dilim hazırlıkları iki (veya daha fazla) sinaptik birleştiğinde nöronlar (eşleştirilmiş kayıtları) yama kelepçe kayıtları kombinasyonu yapısal ve fonksiyonel özellikleri bir korelasyon analizini sağlar. Bu yöntem ile, bunların morfolojisi ve elektrofizyolojik yanıt şekli ile öncesi ve postsinaptik nöronların belirlenmesi ve karakterize edilmesi mümkün olur. Eşli kayıtlar bu nöronlar arasındaki bağlantı modellerini yanı sıra hem kimyasal ve elektriksel sinaptik iletim özelliklerini inceleyerek izin verir. Burada, biz nöron morfolojisi optimal iyileşme ile birlikte güvenilir eşleştirilmiş kayıtları elde etmek için gerekli prosedürlerin bir adım-adım tanımını verir. Biz kimyasal sinaps veya boşluk bağlantıları aracılığıyla bağlanan nöronların çiftleri beyin dilim hazırlıkları tespit nasıl anlatacağız. Biz nöronlar Dendrit kendi 3D morfolojisi elde etmek için yeniden nasıl açıklayacağımic ve aksonal etki ve nasıl sinaptik kişileri tespit ve lokalize. Biz de özellikle beyin dilimleri hazırlanması sırasında dendritik ve aksonal kesikler ile ilgili olanlar, bu güçlü bağlantı tahminleri etkileyebilir çünkü, eşleştirilmiş kayıt tekniği uyarılar ve sınırlamalar görüşecek. Ancak, eşleştirilmiş kayıt yaklaşımının çok yönlülük beyindeki nöronal belirlenen microcircuits sinaptik iletim farklı yönlerini karakterize değerli bir araç olmaya devam edecektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki sinaptik birleştiğinde nöronlar arasındaki Nöronal yongalar beyinde büyük ölçekli ağların yapı taşlarıdır ve sinaptik bilgi işleme temel birimleridir. Bu tür nöronal microcircuits karakterizasyonu için bir önkoşul morfolojisi öncesi ve postsinaptik nöronların ortağı hem de fonksiyonel özelliklerini, sinaptik bağlantı (lar) ve yapısı ve fonksiyonel bir mekanizma türü bilmektir. Bununla birlikte, sinaptik bağlantıların pek çok araştırmada, bir mikrodevre nöronların en az bir iyi anlaşılamamıştır. Bu genellikle sinaptik bağlantı çalışmalarda kullanılan nispeten belirsiz stimülasyon protokolleri kaynaklanır. Bu nedenle, presinaptik nöronların yapısal ve fonksiyonel özellikleri ya hiç ya da sadece oldukça küçük bir ölçüde tespit edilmemiş (yani, işaretleyici proteinlerin sentezlenmesi, vb). Belirteçler s tarafından hücre içi boyama ile birlikte eşleştirilmiş kayıtlarıbiocytin, neurobiotin ya da floresan boyalar gibi bakanın küçük nöronal mikro devreler çalışmak için daha uygundur. Bu teknik, tek, aynı zamanda, bir morfolojik olarak belirlendi sinaptik bağlantı pek çok yapısal ve işlevsel parametreleri incelemek sağlar.

İki nöron arasındaki sözde 'üniter' monosinaptik bağlantıları akut dilim hazırlıklarını kullanarak hem kortikal ve subkortikal beyin bölgelerinde 1-10 araştırılmıştır. Başlangıçta, sert Mikroelektronlar, bu deneylerde kullanıldı; Daha sonra, yama kelepçe kayıt daha düşük bir gürültü seviyesi ve geliştirilmiş zamansal çözünürlüğe sahip sinaptik sinyallerin kayıtları elde etmek için kullanılmıştır.

Bir önemli teknik ilerleme kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (IR-DIC) optik 11-14, önemli ölçüde mümkün t oldu böylece beyin dilim nöronlar görünürlüğünü ve kimlik geliştirilmiş bir mikroskobik tekniği kullanılması olduo görsel tespit sinaptik bağlantıları 15-17 kayıtları edinin. Genel olarak, eşleştirilmiş kayıtlar akut dilim hazırlıkları yapılır; Sadece çok az yayın vivo 18-20 sinaptik bağlı nöronların temin raporlama kayıtları vardır.

eşleştirilmiş kayıtların en önemli avantajı fonksiyonel karakterizasyonu ışık ve elektron mikroskobik düzeyde hem de bir morfolojik analizi ile kombine edilebilir olmasıdır (örneğin bkz., 7,16,21). Histokimyasal işleme sonra, sinaptik bağlı nöron çiftinin dendritik ve aksonal morfoloji izlenir. Daha sonra, bu parametreler daha sonra, belirli bir sinirsel bağlantının objektif sınıflandırılması için bir temel teşkil edebilir vs. uzunluk, uzamsal yoğunluğu, yönlendirme, dallanma modellerinin gibi morfolojik özelliklerini ölçmek mümkündür. Ayrıca, nöronal bağlant çalışmak için kullanılan en başka tekniklerle aksinevite, eşleştirilmiş kayıtları da üniter sinaptik bağlantıları için sinaptik temasların tanımlanmasına izin. Bu ışık ve elektron mikroskobu 16,21-27 bir arada kullanarak veya dendritik dikenler kalsiyum görüntüleme 28,29 ile doğrudan yapılabilir. Ancak, ikinci yaklaşım ile sadece uyarıcı değil inhibitör bağlantıları ele alınabilir o postsinaptik reseptör kanalları üzerinden kalsiyum girişini gerektirir.

Tanımlanmış bir nöronal mikrodevreli eşleştirilmiş kayıtları sinaptik iletim ayrıntılı bir analiz ek olarak sinaptik plastisite kuralları 30,31 çalışma izin veya örneğin - asetilkolin 32 ve adenozin gibi nörotransmitterlerin sinaptik iletim modülasyonu - agonist / antagonist uygulaması ile birlikte 33.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler Hayvanları Koruma, Alman Hayvan Refahı Yasası AB Direktifi (Tierschutzgesetz) ve Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği Federasyonu Kurallarına uygun olarak yapılmıştır.

Elektrofizyoloji 1. Set-up

Eşleştirilmiş kayıt başlamadan önce, bir elektrofizyoloji set-up inşa edilmelidir. Böyle bir set-up aşağıda verilmiştir monte nasıl kısa bir anahat:

  1. Mikroskop, manipülatörler ve diğer tüm ekipmanlar alınacaktır hangi bir anti-titreşim tablo takın.
    NOT: Titreşim veya hareketin başka türlü bu (kayıt elektrot yerine arama elektrot) pipetler bir değişiklik gerektirdiğinden sinaptik bağlantıları kayıt yaparken mümkün olduğunca küçük olması gerekir.
  2. Elektriksel gürültü azaltmak için titreşim önleyici masa etrafında bir Faraday kafesi yerleştirin. Faraday ca içindeki tüm donanımları bağlayınelektrik zemine ge.
  3. Üreticinin yönergelerine göre anti-vibrasyon masaya bir motorlu xy tablosuna dayalı bir motorlu odak ekseni ile bir mikroskop takın. Bu güvenilir o neokortekste translaminar bağlantıları olduğu gibi aynı görüş alanında olmayan nöronlar için mikroskop hareket etmesine olanak sağlar.
  4. Mikroskop kamera bağlantı noktasına bir video kamera takın ve dilim hazırlanması ve elektrotların hareketini gözlemlemek ve / veya dijital ekranları analog bağlayın. Sinaptik birleştiğinde nöronal hücre çiftinin, sırasıyla, bir düşük ve bir bakış elde etmek için yüksek-güç büyütme ve yakın çekim görüntü arasında geçiş olabilir, bir kamera kullanın. Bu aynı zamanda yama elektrot hareketini kontrol etmeye yardımcı olur.
  5. Banyo odası için bir girinti içeren bir örnek tablo kurun beyin dilim hazırlanması için (bir Perspex bloğundan in-house delinmiş). Bu örnek tablo bağlı olmamalıdırmikroskop, yani hava masaya tespit edilmelidir ve mikroskop altında manevra kabiliyeti olmalıdır.
  6. Montaj iki (veya gerekirse daha fazla) her üç boyutta hareket ettirilebilir yüksek hassasiyetli mikromanipülatörler. Manipülatörler yama-kelepçe pre-amplifikatör takın ve ana amplifikatör bağlayın.
    NOT: Gerekli ek manipülatörler, örneğin için ikiden fazla ön amplifikatörler, hücre dışı uyarım elektrotları, ilaç-taşıyıcı sistemleri, vb monte edilebilir ise
  7. Numune tablosunda banyo odasına yerleştirin. Bir çözüm girişi yükleyin ve çıkış ve perfüzyon sistemine bağlayın.
  8. / Dakika uygun dilim canlılığı için 6 ml - 4 arasında sabit bir akış hızında (Tablo 1 ACSF) yapay beyin-omurilik sıvısı ile kayıt odasının perfüzyon muhafaza edilmesi için bir peristaltik pompa kullanılır.
    NOT: ASCF türbülans ve dilim dolayısıyla hareketi neden olur ölçüde bu akış hızını aşmayın.
  9. Örnek masaya sıcaklık probu ve Ag / AgCl elektrot zemin için sahipleri yükleyin. Bu bölme içinde banyo örnek prob ve elektrodu izin vermek için gereklidir.
  10. Dilim hazırlık nöronların iyi bir görünürlük için mikroskop kızılötesi aydınlatma kullanın. Bu nedenle ışık dağılmasını ve görüntü bulanıklığı azaltır. Mikroskop '3D' gibi görselleştirme ulaşmak için diferansiyel girişim kontrast optik ile donatılmış olduğundan emin olun. Bu nöronlar yama yardım ve dilim (60 mm veya daha derin) derin nöronları hedef sağlayacaktır.
  11. Deneme sırasında, altta bir cam lamel ile deneysel odasında beyin dilimleri tutmak. Yüzen dilim önlemek için dilimin üstüne bir 'platin arp' koyun. Bir platin harp yapıştırılmış diş ipi ip ile U-şeklinde düzleştirilmiş platin telden yapılır.
  12. Opt sağlamak için 35 ° C - 32 arasındaki bir sıcaklıkta dilim perfüze ACSF tutunoksijenlenme ve pH proksimal kontrolü. Bu banyo odasına ACSF girişi yakın yüklü Peltier cihazı ile çözüm ısıtarak yapılabilir.
    NOT: ultra ince kapak yüksek sayısal açıklık ve kısa çalışma mesafesi bile mikroskop kondansatörler numune üzerinde odaklanmış böylece kayıyor. Bu dilim optimal aydınlatma gereklidir.
    Bir görüntü ve beyin dilim hazırlık eşleştirilmiş kayıtları için optimize bir elektrofizyoloji set-up açıklaması için Ref. 34 Şekil 4'e bakınız.

2. Beyin Dilim Hazırlık

  1. Hafif beyin dokusu izofluran (nihai konsantrasyon <% 0.1) ile alınmalıdır hangi hayvan uyutmak.
    Not: diğer anestetikler de kullanılabilir. Anestezi kullanımı, ilgili hayvan komitenin önerileri ve kurallara uymalıdır. Her zaman hayvan ekledikten sonra tahriş ya da stres altında olmadığından eminanestezik.
  2. , Hayvan decapitate kafatası açın ve Refs açıklanan prosedür. 34,35 kullanarak mümkün olduğunca çabuk beyin kaldırmak.
  3. % 95 O2 ve% 5 CO2 ile karbojen gazı karışımı ile gazlı soğutulmuş (4 ° C), yapay beyin-omurilik sıvısı içine beyin aktarın.
  4. Incelenmesi gereken bir beyin bölgesini izole edin.
    NOT: parametreler optimum koruma ve dendrit öncesi ve postsinaptik nöronların akson minimal kesme elde etmek için soruşturma altında her nöronal bağlantı ve gelişim aşaması için önceden tespit edilmelidir. Optimal disseke beyin dilim, presinaptik nöron akson dilim yüzeyine paralel olması gerekli değildir. Aksine, onlar sığ bir açı ile dilimler halinde işaret etmelidir. postsinaptik piramidal nöronların apikal dendrit için geçerlidir; Bu ışık mikroskobu altında kontrol edilmelidir. Bu yerel olmayan ya da t için özellikle önemlidirranslaminar sinaptik bağlantıları, yani. öncesi ve postsinaptik somata fazla 200 mikron ayrı ve dendritik ve aksonal kesikler olasılığı yerel bağlantıları için önemli ölçüde daha yüksek olması muhtemeldir nerede.
  5. Mikrotom odasına beyin aktarın. Ampirik bulgulara dayanarak, farklı hücre dışı dilimleme çözümleri hayvanın yaşına bağlı olarak kullanılmaktadır (; yararlı bilgiler de 'altında bulunabilir Tablolar 2 ve 3 bkz http://www.brainslicemethods.com/ ').
  6. Hedef bölge görünür kadar beyin Trim.
  7. Hayvan olgun olup olmadığını (3 hafta>) 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri - İyi bir hücre görünürlüğü ile dilimler elde etmek için, 300 kesti. Büyük ölçüde zarar hücre visib olmadan 800 mikron - Hayvan (1 2 st nd fareler ve sıçanlar için doğum sonrası hafta) dilimleri olgunlaşmamış ise ~ 600 kalınlığa kadar kesilebilirility.
    NOT: Bu 'olgunlaşmamış' dilim istikrarı geliştirmek ve uzun menzilli dendritik ve aksonal teminatların olası kesikler sayısını azaltacaktır.
  8. % 95 O2 ve% 5 CO2 karışımı ile gazlı dilimleme çözeltisi ile doldurulmuş bir inkübasyon odasına mikrotom bölmeden dilimleri aktarın. Deney türüne bağlı olarak, oda sıcaklığında ya da ~ 30 ° C de ya da en azından 30 dakika ila 1 saat boyunca inkübasyon odası içinde dilimleri tutun.

3. Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıt ve Biocytin Dolum

Sinaptik bağlantı türüne bağlı olarak üç farklı yaklaşım sinaptik birleştiğinde nöronlar bulmak için kullanılır. (En uyarıcı bağlantıları için beklendiği gibi) bağlantı olasılığı düşüktür, aşağıdaki gibi devam edin:

  1. Düşük bağlantı ile Nöronal bağlantıları
    1. Listelenen bileşimin bir iç çözeltisi ile yama pipet doldurunTablo 4 'de bütün hücre konfigürasyonunda yer alan kayıtlar için 3 arasındaki konsantrasyonlarda biocytin ekleyin -. öncesi ve postsinaptik nöronların iyi boyama sonuçları elde etmek için, iç (pipet) çözeltisine 5 mg / ml. (Nöron boyutuna bağlı olarak), 30 dakika - en az 15 için hücre içine yaygın biocytin olsun.
      NOT: Aşağıda belirtilen 'arama' pipetler kullanılan çözüm biocytin katmayın.
    2. Tam hücreli modunda varsayılan bir postsinaptik nöron yama. Uzun ve ince saplı yama pipetler kullanın. Bu hedef kapsamında pipet manevra kolaylaştırır ve elektrot dilim tanıtıldı oluşabilecek hareket eserler azaltır.
    3. 10 MΩ direnci ve küçük bir ipucu çapı - Sonra, 8 bir 'arama' yama pipet kullanarak bir hücre-bağlı yapılandırmada bir potansiyel presinaptik nöron yama. Bu pipetler ile 'gevşek' hücre-bağlı yama kurmak. Fill K + presinaptik bir hücre için arama süresince nöronlar depolarize vermemek için, Na + (Tablo 5) ile ikame edildiği bir iç çözelti ile 'arama' pipet.
      NOT: 'gevşek' mühür direnci GΩ aralığında değil ama genellikle etrafında 30-300 MΩ.
    4. Mevcut kelepçe modunda yaklaşık -30 mV -60 ila 'gevşek' mühür altında membran potansiyelini tutun. Potansiyel presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için - (2 nA 0.2) Sonra, büyük akım darbelerini geçerlidir. Gerilim tepkisi üzerine küçük bir tane sayısı olarak bu eylem potansiyeli dikkate alınmalıdır.
    5. Bir postsinaptik yanıt halsiz önlemek için 0.1 Hz stimülasyon frekansı ayarlayın. Beyin dokusu çok olgunlaşmamış ya da sinaptik bağlantı çok güvenilir olmaması halinde alt stimülasyon frekansları kullanın.
    6. Durumda 'postsinaptik' nöron test 'presinaptik' neu uyarılmasına yanıt vermiyorron, 'gevşek' mühür modunda yeni bir nöron yama. 30 MΩ kurulan> bir direnç ile mühür sürece 'arama' yama elektrot yerine etmeyin. Bu şekilde 30 potansiyel presinaptik nöronlara kadar test edin.
      NOT: gevşek yama kelepçe ile arama işlemi sırasında nöron zarar vermemek için, sadece hafifçe emiş tüm hücre yama pipet uygulanan karşılaştırıldığında arama pipet uygulanmalıdır.
    7. Bir gecikme ile bir EPSP / iPSP içinde 'gevşek' mühür modu sonuçlarında stimülasyon
    8. Biocytin içeren, düzenli iç solüsyonu ile dolu bir yama elektrot ile 'arama' yama pipet değiştirin. Bu kayıt yama pipet olun 4 bir dirence sahiptir - 8 MΩ; elektrot direnci olabilir alt soma boyutunu daha büyük.
    9. Presinaptik PatchBütün hücre, akım-kelepçe modunda nöron ve kayıt. Presinaptik nöronlar mevcut enjeksiyon yoluyla aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarmak ve postsinaptik yanıt kaydedin. Daha sonra off-line analiz için bir bilgisayarda veri depolamak.
  2. Yüksek bağlantısı ile Nöronal bağlantıları
    NOT: Bir yüksek bağlantı oranı (>% 30) ile nöronal microcircuits için sinaptik bağlantıları bulmak için farklı bir prosedür kullanın. Bu prosedür aşağıda özetlenmiştir ve sık sık uyarıcı bağlantıları 36 daha ortalama bir yüksek bağlantı oranı var inhibitör sinaptik bağlantı için kullanılır. Bağlantı oranı bu değerin altına düştüğünde bu kullanılmamalıdır.
    1. Tam hücreli modunda doğrudan bir presinaptik nöron yama. Sonra, bir potansiyel postsinaptik nöron yama aynı zamanda tüm hücre modunda. Her iki hücreler mevcut kelepçe kontrol altında olmalıdır. Presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli Elicit. Bir postsy için prospektif postsinaptik nöron Monitörnaptic potansiyeli.
    2. Durumunda nöron, presinaptik uyarısına yanıt gösteriyor düzenli iç çözeltisi ile dolu bir yama elektrodu kullanarak bütün hücre modunda yeni bir nöron yama değil. Bir bağlantı bulunursa, yama pipet değiştirmek ancak kayıt ile devam etmeyin. Sonra, adım 3.1.9 gibi devam edin.
  3. Gap-junction aracılığıyla Nöronal bağlantıları
    NOT: Elektrik (boşluk-kavşak) bağlantıları aramak için düşük olasılık bağlantıları için kullanılan bir değiştirilmiş versiyonu aşağıdaki yordamı kullanın.
    1. Bütün hücre yama kenetleme konfigürasyonunda bulunan bir sinaptik sonrası nöronu yama.
    2. 10 MΩ direnç - 7 bir 'arama' yama pipet kullanarak - Daha sonra, gevşek-mühür yapılandırmasında varsayılan bir presinaptik nöron (300 MΩ 30 düşük mühür direncini) yama. Bu pipet gevşek mühür uyarılması için modifiye yüksek Na + iç çözümü ile dolu olmalıdır.
    3. Inject 100-300 msn 'gevşek' mühür üzerinden uzun hiperpolarizan akım darbeleri; pipet komut potansiyeli yaklaşık -60 mV -70 ayarlanmış olmalıdır. 'Postsinaptik' nöron küçük hiperpolarizan yanıt bu uyarım sonuçları ise bir boşluk kavşak bağlantısı gözlemleyin.
    4. Bütün hücre modunda 'presinaptik' nöron Repatch ve yukarıda tarif edildiği gibi devam edin.
      NOT: akson ve dendritik süreçlerin iyi bir boyama sağlamak aşağıda verilen protokolünü kullanmak için. Bu protokol, aşağıda kısaca tarif edilmektedir, bununla birlikte, laboratuvarda kullanılan histokimyasal işleme ayrıntılı protokol Ref verilmiştir. 37.

4. Histokimyasal İşleme

  1. 0.1 M fosfat tampon içinde çözülmüş% 4 paraformaldehid içeren ufak bir şişede sinaptik bağlanmış nöronların çifti ile beyin dilim aktarın ve 24 saat süre ile dilim sabitleştirmek. Elektron mikroskobu için,% 2.5 Glutaraldehit kullanılarak dilim sabitleşmekaldehit ve% 1 paraformaldehit.
  2. Bir sonraki gün, herhangi bir fiksatif ihtiva eden normal fosfat tampon maddesi içine dilim aktarın. 10 8 kat - - 6 fosfat tamponu ile dilimleri yıkayın 15 dakika her aşırı Fiksatif kaldırmak için.
  3. Endojen peroksidaz reaksiyonu en aza indirmek için% 3 H 0.1 M fosfat tamponu içinde 2 O 2 çözeltisi, 20 dakika boyunca inkübe dilimleri. Güçlü kabarcık oluşumunu gözlemlemek. Başka bir kabarcıkları üretilir kadar reaksiyon devam edin. Kalan H 2 O 2 kaldırmak için (10 dakika her biri için) 8 kat - Sonra, 6 0.1 M fosfat tamponu dilimleri durulayın.
  4. Immünositokimyasal ve kromojenik reaksiyon
    Biocytin doldurulmuş nöronların Görselleştirme diaminobenzidin ile katalize edilen bir streptavidin-biyotinlenmiş yaban turpu peroksidaz reaksiyona dayanır; Bu bir yüksek uzaysal çözünürlüğü ile net bir leke üretir karanlık bir çökelti oluşturur. Aşağıdaki prosedürler, kromojenik reaksiyon için kullanılır:
    1. Imalatçının protokolüne göre ABC çözeltisi hazırlayın. (, Sadece ışık mikroskopi için Tablo 6) ve karanlıkta 30 dakika boyunca solüsyon tutmak 150 ul% 10 Triton X100 ile takviye 14.55 ml fosfat tampon maddesi ekleyin. Bu çözüm O'da / N kullanımdan önce dilimleri inkübe.
    2. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile bir çalkalama düzenine ve karanlıkta ABC çözeltisi dilimleri inkübe edin. Daha sonra, bir buzdolabında 4 ° C'de dilimleri O / N tutun. Ertesi sabah, bir saat daha oda sıcaklığında dilim inkübe edin.
    3. Bundan sonra, fosfat tampon maddesi içinde 10 dakika için her dilimleri en az dört kez yıkayın. Daha sonra, bir nikel-yoğun 3-3'-diaminobenzidin çözeltisi (Tablo 7), 2 ml karanlıkta 30 dakika süreyle bir çalkalayıcı içinde inkübe edilir. Diaminobenzidini taşıma ve sadece davlumbaz altında kullanırken çok dikkatli olun; bile çok düşük konsantrasyonlarda son derece kanserojen.
    4. 6.5 ul% 3 H 2 O 2 Ekle diaminobenzidinin içerenÇözelti. Kahverengi-siyah lekeli nöronlar açıkça görülebilir kadar ışık mikroskobu altında kromojenik reaksiyonu izleyin. Daha sonra, fosfat tampon maddesi içinde bir kaç kez yıkanmasıyla dilimleri hemen reaksiyonu durdurun.
    5. Yapıştırıcı, silan kaplı Histobond veya jelatinize standart nesne slaytlar üzerinde lekeli nöronlar Mount dilimleri.
    6. En az% 80 nem O / N oranı ile bir nemli oda içinde slaytlar tutun. Ertesi gün, dilimler hava ile kurutulur, bir 10 dakika daha sürdü. Bunları kurutmak amacıyla, - (% 100 20), etanol içinde artan konsantrasyonlarda çözelti içinde transfer slaytlar gömme önce.
      NOT: dehidrasyon işlemi aksi dendritik ve aksonal süreçlerde çarpıtmalar 37 meydana gelme olasılığı yavaş olmalıdır. Alternatif bir gömme işlemi seçilirse, örneğin gliserol bazlı Moviol olan, bir dehidrasyon gerekli değildir; Ancak bu nedenle homojen olmayan bir dilim sıkıştırma ve çarpıtılmış nöronal morfolojik sonuçlanması muhtemeldirgy.
    7. Son olarak, ksilolde 10 dakika inkübe ışık mikroskobu için bir hidrofobik gömme orta dilim embed ve üstünde ultra-ince lamelleri yerleştirin. Slaytlar, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurumasına izin verin.

5. Nöronal İmar ve Synaptic İletişim Yerelleştirme

  1. 60X / 100X immersiyon yağı objektif ve optimal uzamsal çözünürlük için yüksek sayısal diyafram ile Yoğuşturuculu bir ışık mikroskobu altında biocytin-etiketli nöronlar ile slaytlar inceleyin. Bu akson BOUTONS olun ve dendritik dikenler açıkça görülebilir.
  2. Sistemi izleme ticari bir nöron kullanılarak nöronlar veya sinaptik birleştiğinde nöron çiftleri Trace 3D nöronal rekonstrüksiyon elde etmek için (Belirli Malzemeleri / Ekipman Tablo). Hatta küçük aksonal veya dendritik teminat tespit etmek için sürekli görsel denetim altında elle izleme yürütmek. Sinaptik birleştiğinde nöronlardan eşleştirilmiş kayıtları için manuel izleme hala yöntemseçim, örneğin, öncesi veya postsinaptik nöronun ya bir aksonal profilin atıf önemli imar deneyim gerektirir çünkü.
  3. Gerekirse, aksonal boutons ve / veya dendritik dikenler sayılarını yapmak. Dikenler ya da omurga alt tipleri ve aksonal boutons örneğin, kortikal katmana veya alana göre belirli bir dağılım ve yoğunluk gösterebilir, çünkü bu nöronal hücre tiplerini karakterize yardımcı olabilir.
  4. Sinaptik birleştiğinde nöron çiftleri için, mümkün olan en yüksek büyütmede yakın apozsiyonları için presinaptik akson ve dendrit postsinaptik kontrol edin. Bir akson bouton gözlemleyin ve bir postsinaptik dendritik omurga ya da şaft farazi bir sinaptik temas olarak kabul edilebilir aynı odak düzlemi olduğunu. Yeniden bu kişiyi işaretleyin.
  5. Izleme programının uygun bölümünde üç mekansal boyutta küçülme için nöronal rekonstrüksiyon düzeltin.
    NOT: fiksasyon sırasında, histokimyasal işlemeve dehidratasyon önemli mekanik deformasyon ve daralma meydana; Bu akson ve dendritik uzunluğu ölçümleri etkileyebilir ve ciddi mekansal düzenleme deforme olacaktır. Gömme ortamı için Küçülme düzeltme faktörleri z-doğrultusunda 37 ~ x ve y yönlerinde için 1.1 ve 2.1 ~ vardır.
  6. Kantitatif morfolojik analiz için (Belirli Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız) nörofizyolojiye için bir veri analizi programı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eşli kayıtlar morfolojik tespit tek veya çift yönlü sinaptik bağlantıları derinlemesine karakterizasyonu için tercih edilen yöntem olarak gap junction (elektrik) bağlantıları (Şekil 1). Somatosensori namlu korteks tabakası 4 bir eşleştirilmiş kaydın bir örneği, Şekil 1A'da gösterilmiştir. Tek yönlü uyarıcı ve önleyici sinaptik bağlantıların (Şekil 1B, C) ​​karakterize edilebilir. Ayrıca eşleştirilmiş kayıtlar bir çift iki nöronlar öncesi ve birbirine postsinaptik olduğu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinaptik birleştiğinde eksitatör ve / veya inhibitör nöronlar Eşli kayıtlar nöronal microcircuits çalışma için çok yönlü bir yaklaşım vardır. Sadece bu yaklaşım bir nöron tipleri arasındaki sinaptik bağlantı tahmin izin değil, aynı zamanda bağlantı öncesi ve postsinaptik nöronların morfolojisi fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi veriyor etmez. Ayrıca, agonist ve / veya antagonist kolayca slice preparatlarda nöronlara uygulanabilir. Bu bir örnek için, sinaptik iletim 32 özellikleri kullanılarak veya bir ta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörobilim ve Tıp Enstitüsü, INM-2, Jülich Araştırma Merkezi'ndeki 'Nöronal Mikro Devrelerin İşlevi' Grubunun tüm üyelerine ve Psikiyatri, Psikoterapi ve Psikosomatik Bölümü, Tıp Fakültesi, JARA, RWTH Aachen Üniversitesi'ndeki 'Kortikal Mikro Devrelerin İşlevi' Grubuna verimli tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Barrel Cortex Function (BaCoFun) üzerine DFG araştırma grubu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AmplifikatörHEKAEPC 10 USBÜçlü, 2 - 3 ön amplifikatör
ile MikroskopOlympusBX51WI, 2 kamera bağlantı noktası, 4X objektif ve 40X suya daldırma objektifi
ile KameraTILL PhotonicsVX55kızılötesi CCD kamera
İş İstasyonuLuigs & NeumannInfrapatch 240motorlu bir x-y aşaması ve mikroskop için motorlu bir odak ekseni ile
MikromanipülatörLuigs & 2- 3 ön yükseltici için Neumann SM-5 x-y-z manipülatörleri
Faraday kafesiLuigs & Neumann
Titreşim önleyici masaNewport Spectra-Physics
PatchmasterHEKA
Microtome MicromInternationalHM650V
Mikropipet çektirmeHEKASutter P-97
Neurolucida sistemiNeurolucida ve Neuroexplorer yazılımları ileMicrobrightfield
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
  2. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
  3. Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
  4. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  5. Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
  6. Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
  7. Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
  8. Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
  9. Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  10. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
  11. MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
  12. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  13. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  14. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
  15. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  16. Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
  17. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
  18. Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
  19. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
  21. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
  22. Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
  23. Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
  24. Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
  25. Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
  26. Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
  27. Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
  28. Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
  29. Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
  30. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
  31. Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
  32. Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
  33. Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313(2012).
  34. Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
  35. Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
  36. Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
  37. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  38. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
  39. Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
  40. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
  41. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  42. Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
  43. Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
  44. Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
  45. Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
  46. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  47. Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
  48. Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
  49. Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382(2006).
  50. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
  51. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  52. Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
  53. Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
  54. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
  55. Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
  56. Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
  57. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Paired Patch Clamp RecordingsAcute Brain SlicesNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionBiocytin Filling3D Neuron ReconstructionElectrophysiological CharacterizationMorphological AnalysisChemical SynapsesElectrical Synapses

İlgili makaleler