Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Basit Kritik ölçekli Femoral Hata Modeli

13.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52368

⸱

15 Mart 2015

 ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine at Scott & White Hospital, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Texas Medical Branch, 3Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M Health Science Center

Bu makalede

Özet

Biyomedikal araştırmalarda ciddi kemik yaralanmalarını taklit etmek için hayvan modelleri sıklıkla kullanılır. Küçük boyutları nedeniyle, farelerde stabilize kemik lezyonlarının kurulması çoğu araştırma grubunun yeteneklerinin ötesindedir. Burada, farelerde deneysel femur kusurlarını belirlemek ve analiz etmek için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Kemik rejenerasyon için dikkate değer bir kapasiteye sahipken, ciddi kemik travması genellikle düzgün bir şekilde iyileşmeyen hasara neden olur. Aslında, tüm ekstremite kemik kırıklarının onda biri, travma, hastalık veya hastanın yaşı nedeniyle tamamen iyileşmez. Kemik rejeneratif stratejilerini geliştirme yeteneğimiz, test hayvanlarında ciddi kemik travmasını taklit etme yeteneğine kritik bir şekilde bağlıdır, ancak büyük kemik lezyonlarının üretilmesi ve stabilizasyonu teknik olarak zordur. Çoğu durumda, ciddi uzun kemik travması, doğal olarak iyileşmeyecek bir kusur oluşturarak deneysel olarak taklit edilir. Bu, kemik kesitinin çapının 1,5 katından daha büyük bir kemik segmentinin tamamen çıkarılmasıyla elde edilir. Kemik daha sonra kırık kenarlarının uygun oryantasyonunu korumak ve hareketliliğe izin vermek için metal bir implant ile stabilize edilir.

Küçük boyutları ve uzun kemiklerinin kırılganlığı nedeniyle, farelerde bu tür lezyonların kurulması çoğu araştırma grubunun yeteneklerinin ötesindedir. Bu nedenle, uzun kemik defekti modelleri sıçanlar ve daha büyük hayvanlarla sınırlıdır. Bununla birlikte, fareler, genetik olarak değiştirilebilmeleri ve insan hücrelerini ve dokusunu reddetmeyen bağışıklık sistemi baskılanmış suşlar olarak yetiştirilebilmeleri açısından önemli araştırma avantajları sağlar.

Burada, standart laboratuvar ve veterinerlik ekipmanı kullanarak fare femorasında segmental bir kusurun oluşumunu kolaylaştıran bir teknik gösteriyoruz. Uygulamada, fiksasyon cihazının imalatı ve cerrahi implantasyon, eğitimli veteriner hekimlerin ve hayvan araştırma personelinin çoğunluğu için mümkündür. Örnek verileri kullanarak, model için kemik iyileşmesinin kantitatif analizi için metodolojiler de sağlıyoruz.

Giriş

Bu tedavi kırıklı hastalar için cerrahi, 500.000 prosedürleri kemik grefti 2 kullanımını içerir. ABD nüfusunun yarısı 65 1 yaşına göre bir kırık yaşadıklarını tahmin edilmektedir ve bu sayı giderek yaşlanan nüfus 3 artması bekleniyor . Kemik nedbe bırakmadan iyileşmesi kapasitesine sahip birkaç organlardan biri olmasına rağmen işlem 3,4 başarısız nerede, örnekleri vardır. Koşullar ve tedavi kalitesine bağlı olarak, uzun kemik kırıklarının% 2-30 sendikasız 3,5 sonuçlanan başarısız. Tanımı, psödoartroz, boy-kritik veya sendika üyesi olmayan kemik yaralanmaları üzerinde bazı tartışmalar var olmaya devam ederken, genellikle konu 6 doğal ömrü boyunca iyileşmeyen bir yaralanma anlamına gelir. Deneysel amaçlı, bu süre ortalama büyüklükteki bir kemik yaralanması tam iyileşme için gerekli ortalama süre kısaltılır. Sigara sendika kemik lezyonları num için ortayaerous nedenleri, ama önemli faktörler nedeniyle hastalık veya 7 yaş için kritik büyüklükte boşluk, enfeksiyon, zayıf anjiyogenez, tütün kullanımı, ya da inhibe osteoregenerative kapasitesi sonuçlanan aşırı travma vardır. Olmayan sendikalar başarıyla tedavi bile, bu yaralanma türüne ve 8 çalışan yaklaşımlara bağlı olarak, prosedür başına 60.000 $ aşan mal olabilir.

Orta durumlarda, otolog kemik grefti kullanılır. Bu strateji, yaralanma yerinde bir donor sitesi ve implantasyondan kemik iyileşme içerir. Bu yaklaşım, son derece etkili olmakla beraber, mevcut donör kaynaklı kemik hacmi sınırlıdır ve prosedür, birçok hastada 9,10 kalıcı ağrı oluşturan bir ilave cerrahi içerir. Buna ek olarak, otolog kemik grefti etkinliği, hastanın sağlık bağlıdır. Sentetik malzemeler veya işlenmiş kadavra kemikten yapılmış kemik yerine 11-13 bol mevcuttur, ancak bunlar hadüşük konukçu hücre yapışma özelliklerine, düşük osteoconductivity ve immün red 14 potansiyeli dahil olmak üzere önemli kısıtlamaları, ve,. Güvenli, etkili ve yaygın olarak kullanılan, kemik yenilenmesi teknolojileri için acil bir ihtiyaç vardır.

Kemik rejeneratif stratejiler geliştirmek için yetenek deney hayvanlarında ciddi kemik travma taklit yeteneği kritik bir şekilde bağlıdır, ancak büyük kemik lezyonlarının nesil ve istikrar teknik zordur. Çoğu durumda, ciddi uzun kemik travması doğal iyileşmeyecek bir kusur kurarak deneysel taklit edilir. Bu türler 15 ile değişir, ancak bu, kemik enine kesit 16 daha büyük bir çapının 1.5 mislinden daha olan bir kemik parçası tamamen çıkarılması ile elde edilir. Kemik daha sonra kırık kenarlarının doğru bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak ve hareket için izin vermek için, bir metal implant ile stabilize edilir. Nedeniyle kendi küçük boyutu ve kırılganlıkuzun kemikler, farelerde bu tür lezyonların kurulması çoğu araştırma grupları yeteneklerini ötesindedir. Bu nedenle, uzun kemik defekti modelleri, farelerde ve büyük hayvanlar sınırlıdır. Yine, fareler onlar genetiği değiştirilmiş ve insan hücreleri ve dokuları reddetmek değil bağışıklık tehlikeye suşlar olarak yetiştirilen olabilir ki önemli araştırma avantajlar göze.

İnsan hücre tabanlı uygulamalar için, bağışıklığı baskılanmış farelerin onlar fizyolojik evin kolay, iyi karakterize çünkü çalışmak için cazip, maliyet etkin ve kolay histolojik radyolojik ve analiz. Büyük önem bağışıklık yetmezlikli fareler insanlar dahil olmak üzere farklı türlerden hücreleri reddetme kalmamasıdır. Kendi küçük boyutu da hücreler veya ortopedik uygulamalarda deneysel iskeleler hacimleri çok küçük sayılar test izin verir. Birkaç kemirgen ortopedik modeller kemik istikrar 17,18 değişik derecelerde göze olduğu bildirilmiştir. Bu systeendokondral iyileşme 19 bildirilmiş olmasına rağmen, bu dış fiksatörlerle ve kilitleme plakaları gibi istikrar çok yüksek seviyelerde, neden ms ağırlıklı intramembranöz kemikleşme ile iyileşir. Buna karşılık, bu tür sabitlenmemiş veya kısmen sabit medüller işaretçilerine kullananlar gibi bazı mikro ve / veya makro-motion, izin olanlar, genellikle endokondral kemikleşme 20,21 üstünlüğü ile iyileşir. Gecikmeli sendika veya uzun kemiğin olmayan sendika kusurlar nedeniyle gerekli istikrar ekstra seviyesine farelerde elde etmek oldukça zordur. Ancak, bir takım yaklaşımlar birbirine çivi ile medüller pimleri, kilitleme plakaları ve dış fiksatörlerle 22 olmak üzere, bildirilmiştir. Bu sistemler genellikle iyi çalışır, ancak onların karmaşık tasarım onlar yüklemek için teknik olarak zor olabilir verilen. Örneğin, Garcia ve arkadaşları. 23 farelerde kullanılmak için zarif birbirine pim sistemi geliştirmiştir, ancak söz konusu prosedür, iki ayrı yerinde kesiler içerirs ve femur geniş değişiklik işaretçilerine karşılamak için. Bu prosedürler, bir mikroskop altında yapıldı.

Bu yazıda, 3 mm kemik açığının kapanmasını önlemek ve aynı zamanda kusur orijinal kenarlarını belirginleştiren tasarlanmış bir merkezi yakalı basit femur medüller pin tarif. Pim kemik kendisi sabit değil iken, yeterli müdahale medüller kavite sonuçlarının pin çapı ve raybalama hassas boyutlandırma burulma hareketi (Şekil 1) en aza indirmek için. Doğuştan yaş, cinsiyet ve gerilme-uyumlu farelerin dikkatli seçimi ile, sonuç kolayca radyolojik değerlendirilebilir oldukça tekrarlanabilir hipertrofik olmayan uniondefect 22 olduğunu. Ayrıca Söz konusu bölgeler yeniden üretilebilir, de novo kemik oluşumu ve histomorfolojik parametrelerin ölçülmesi için mikro-bilgisayarlı tomografi (uCT sonra) tanımlanabilir. pimleri hazır araçları kullanarak laboratuvarda prototyped edildi.

figure-introduction-1
Şekil 1: Deneysel ilke defekt modeli diyagramsal özeti.. Bir 9-10 mm kemirgen femur merkezi 3 mm segmenti (solda) cerrahi olarak eksize edilir. Bir 3 mm uzunluğunda, 19 göstergesi cerrahi çelik boru tam merkezine (sağda) uzun bir 9 mm, 22 G paslanmaz çelik boru geçti ve yapıştırıcı ile sabittir. Elde edilen pim kemik 3 mm'lik bir bölümü yerine 19 G, yaka (aşağıda, merkez) ile femur kalan proksimal ve distal kısımlarının medüller kanala takılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu protokol, Jackson Laboratories'den elde edilen dişi çıplak (nu / J) fareler (18-25 g, 6 haftalık) için tasarlanmıştır. Farelerin suşları anatomisi ve büyüme oranı bakımından biraz farklılık yana, biz pim fabrikasyon canlı konuların içine implantasyon öncesinde alıcıların suşu, cinsiyet ve yaş için optimize edilmiştir tavsiye ederiz. Suşları dikkatlice eşleştirilmiş ise, pim ve kemik iliği boşluğu arasındaki girişim uyum son derece tekrarlanabilir. Konut, diyet ve genel hayvancılık için prosedürler bu protokol kapsamı dışındadır, ancak tüm fareler Kurumsal Hayvan Bakım ve belirlenen Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (8 inci Edition) ve kurumsal politikaların Kılavuz uyarınca muhafaza edildi Kullanım Komitesi (IACUC) ve Scott Beyaz Hastanesi Karşılaştırmalı Tıp Anabilim Dalı (DKMP).

Pins 1. Fabrikasyon

figure-protocol-1
Şekil 2: Pin montaj. (A) montaj çeşitli aşamalarında cerrahi çelik boru ve 5 mm kalınlığında levha Gelfoam bir 4 mm çaplı silindir kesim Fotoğraf. (B) monte pimi (yukarıdaki) parlatma sonra, Gelfoam silindir çelik üzerine konumlandırılmış, kesilir Yaka (orta), daha sonra kurutuldu, Gelfoam ile kaplanmış steril iğne ile sonuçlanan otoklavda muamele edildi. Bu yaralanma yerinde hücre eki geliştirir ve şifa (aşağıda). (C) medüller iğne ile donatılmış bir eksize femur yönünü korur. (D), çeşitli kalınlıklarda pim meclisleri örnekleri ve bu yaklaşımın esnekliği gösteren uzunlukları. proksimal femur uzak uçlarına trabeküler kemik ile medüller pim etkileşimini gösteren bir pim stabilize femur kusur (E) uCT yeniden oluşturma.

  1. 22 G, paslanmaz deri altı boru 9 mm uzunluğa ve bir döner alete takılan bir 23.8 mm çapında fiberglas güçlendirilmiş ağır kesme çarkı ile 19 G, bir boru, 3 mm uzunlukta kesilir. Boru (yukarıdaki Şekil 2A) hareketsiz küçük ince uçlu pense kullanın. Uygun göz koruması takın ve dikkatle döner aracı anlaştım.
  2. 9 mm'lik milin ortasından siyanoakrilat yapıştırıcı madde küçük bir miktar (yaklaşık 10 ul) yerleştirin. Merkezi kadar 9 mm şaft üzerinde 3 mm yaka Pass ve eşit yaka ve şaft arasındaki tutkal dağıtmak için bükün. Dijital kumpas bir çift boyutları ölçün ve Şekil 1 ile karşılaştırın. En az 15 saat (Şekil 2A, ortası) ayarlamak için izin ver.
  3. Çapakları ve aşırı tutkal kaldırmak için bir 220 kum zımpara emdirilmiş disk kullanın.
  4. Döner aracını kullanarak, bir keçe parlatma diski kullanarak pimini lehçe.
  5. Deiyonize su ile durulayın ve geniş kapsamlı kurussed hava.
  6. Yaka karşı yeni yapılan pim ve itme milin üzerine bir 19 G derialtı künt iğne yerleştirerek test bütünlüğü. Yaka ağırlığının yaklaşık 25 gr kurtulamazsın emin olun.
  7. Steril olarak filtreden geçirilmiş, fosfat tamponlu tuzlu su (Şekil 2B, üst) pim durulayın. Pimin mil kesme kemik (Şekil 2C) kenarlarına karşı yaka floş femoral medüller boşluğuna rahatça sığar emin olun. Çalışma ve alıcı (Şekil 2B) belirli amaçlar için Prototip çeşitli konfigürasyonlar. Fiksasyon üst düzeye çıkarmak ve girişim geçişimi (Şekil 2E) geliştirmek amacıyla pimin uçları diafiz trabeküler kemiğe nüfuz emin olun.
    NOT: Bu uygun canlı farelerde (örneğin Şekil 2C) implantasyon öncesi kemik örnekleri üzerinde test edilmesi tavsiye edilir.
  8. Bir silindir kesmek için 4 mm çaplı yumruk-biyopsi kesici kullanınCerrahi jelatin sünger 5 mm kalınlığında sacdan. 3 mm uzunluğa silindir Döşeme ve bir delik (aşağıdaki Şekil 2A) üretmek için silindirin uzunluğu boyunca 20 G derialtı iğne geçmek için bir neşter kullanın.
    NOT: kusur bölgesinde bir jelatin ya da kolajen skafoldun konumlandırma hücre birikimini arttırır ve kemik ekseni boyunca uzunlamasına bir büyümeye yol açar bulmuşlardır.
  9. Piminin üzerine jelatin köpük silindiri geçmek ve 15 psi'de ve 120 ° C sıcaklıkta kuru bir döngü bandajın (Şekil 2B, orta) ve otoklav ile hizalanır. jelatin köpük kurur ve (aşağıda Şekil 2B) koyulaşacaktır.

2. Cerrahi Tekniği

Not: Aşağıdaki yordam Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu (8. Baskı) tarafından belirlenen tüm kurallara uyulması yazılır. Tüm ek politikalar uyunYerel IACUC tarafından belirlenen ve aşağıdaki bölümlerde geçmeden önce yerinde (veya eşdeğeri), IACUC onaylı hayvan kullanımı protokolü sağlamak.

figure-protocol-2
Şekil 3: Cerrahi aletler. (A) Cerrahi kiti. Mikro-matkap (1), tekerlek kesme (2), emilebilir sütür (3), dış sütür (4), neşter bıçakları (5), neşter sapı (6), folyo sarılı steril medüller pimleri (7), medüller derinlik göstergesi yapılan formu derialtı boru (8), ince burunlu forseps (9), sıçan-diş forseps (10), künt oyma iğneler (11), iğne sürücüleri (12), küçük hemostatlar (13), ince makas (14), periost asansör (15), modifiye edilmiş Kern forseps (16) (B):. fareler için Kern tarzda kemik kulpları üretmek için gerekli modifikasyonlar.

  1. Aracılığıyla trafik bir cerrahi işlem odası ya da temiz laboratuvar kapatılabilen bir kapı ile ve hiçbir seçin. Uygun bir çalışma Surfac sanitizeKlinik dereceli dörtlü-bazlı dezenfektan temizleyici ile e.
  2. Atılabilir steril eldiven ve elbise giyerek, Otoklavlanmış bez örtüler ile dezenfekte çalışma yüzeyine yaklaşık 60 x 90 cm 2 steril bir alan kurmak.
    NOT: Bir asistan dış ambalajı kaldırmak ve alanı kurma araştırmacı steril malzeme sunmak için tavsiye edilir.
  3. Drape sıcak bir su yeniden sirkülatörün takılan bir dezenfekte ısıtma yastığı yerleştirin ve steril tek kullanımlık örtüler ile kaplayın. Çalışma sıcaklığına bir kordon sterilizatör ısıtın (250-265 ° C, bu, 30 dakika kadar sürer).
  4. Steril alanda, tüm bileşenlere kolay erişim sağlamak için cerrahi kiti (Şekil 3A) düzenlemek. Ayrıca, steril pamuk gazlı bez (2 x 2 inç 2), steril Q ipuçları, steril tuzlu su, ve klorheksidin / izopropil alkol cerrahi dezenfektan aplikatörler (ağırlık / hacim% 0.9) ihtiva eden bir steril çelik çanak (500 mi) sağlar.
  5. Küçük birleştirinVeteriner rehberlik ve kullanıcı kılavuzuna uygun bir indüksiyon odasına ve burun-koni montaj ile steril alanın yanındaki hayvan anestezi ünitesi. Gaz temini ve izofluran, USP gibi klinik sınıf oksijen kullanın.

figure-protocol-3
Şekil 4: Cerrahi yöntem. (AC) Yaklaşım ve femur maruz kalma. (DE) Yükseklik ve keser. (FK) Raybalama ve medüller kanallar boyutlandırma.

figure-protocol-4
Şekil 5: Cerrahi yöntem. Pimin (AB) Kurulum. (CD) Kapanış. (E) ameliyat sonrası düzgün yerleştirilmiş pim 24 saat tipik görüntüsü.

  1. Anestezi sistemi ve se indüksiyon odasında bir fare yerleştirinT 2 dakika -1 O 2 L% 3 izofluran konsantrasyonu çıkışı (h / h).
    1. Fare 1 dakika içinde bilinçsiz olup olmadığını kontrol edin; % 4 konsantrasyonunu (h / h) gerektiğinde. Altında konumlandırılmış ısıtma pedi steril alanında fare, yer çıkarın ve burun konisi uygulayın. Transferi kurumsal politikasına uygun olarak yeterli cerrahi uçak için koni akar, ve% 2.5 izofluran azaltmak, bir daha 20 saniye bekleyin ve test. Tipik olarak, hafifçe sıkılmış bir arka bacak refleksi eksikliği yeterli anestezi belirlenmesi için yeterli.
    2. Tüm süreç boyunca, bilinçsiz ise oksijenlenme uygun bir düzeyde sağlamak için güçlü bir düzenli nefes ve ekstremite ve ağız bölgesinde pembe renk için bir asistan monitör var. Veteriner rehberlik ve kurumsal politika gerekirse uygun anestezi ayarlayın. Steril yapay gözyaşı yağ merhemi (% 15 (h / h) arasında mineral yağ,% 83 halinde (hacim / hacim) WHGözleri ite vazelin).
  2. Yeni bir tek örtü üzerinde yukarı bakacak arka-bacak ile tek yüzüne fare çevirin. Gerekirse, bir elektrikli tıraş makinesi veya epilasyon kremi ile kürk çıkarın. Steril serum fizyolojik ile site silin ve aşırı kürk ek örtü çıkarın. Tüm parçaları ancak tüm arka-uzuv (Şekil 4A) kapsayacak ancak renklendirme ve nefes izlemek için yüz ve pençe görünümünü korumak amacıyla fare üzerinde yeni bir Fenestralı örtü yerleştirin.
  3. Uyluk kemiğinin merkeze yakın ve uzak uçlara bulun ve uzunlamasına ekseni (Şekil 4B) boyunca, 5-10 mm cilt insizyon. Biceps femoris ve vastus lateralis üzerinden femur lateral yaklaşım sergilemek, bir 15. neşter ile fasya cilt katmanı ayırın. Her iki kasların septalar (bu kas pembe renk üzerine beyaz doku çizgi) buluştuğu bulun. Bir neşter ile dikkatlice intermusküler sınırına kadar birlikte teşrihFemur (Şekil 4B) görülebilir.
  4. Tüm gövdesini (Şekil 4C) açığa çıkartacak şekilde bir künt periosteal ile kesi geliştirin. Medial tarafında (Şekil 4D) posterior nörovasküler demeti korumak için dikkat çekerken ayrıca femur orta üçte ikisinin açığa asansör kullanın. Yavaşça steril Q-ucu veya eşdeğeri ile yumuşak bir neşter ile kemik kapalı doku, ve kuru kazıyın.
  5. Steril bir neşter veya işaretleyici ile kumpaslar gerekirse ve işareti ile femur merkezini bulun, sonra merkezden proksimal ve distalde 1.5 mm işaretleyin. Yavaşça kemik aşırı basınç önlemek için önceden Kern tarzı moda ince burunlu forseps bir çift kullanarak femur kavramak.
    Not: değişiklikler için kesin boyutlar Şekil 3B'de verilmiştir. Bu gerektiren baskı altında kırmak olmaz kemik sağlamak için kullanmadan önce bir ötenazi numune üzerinde forseps test tavsiye edilirkesim sırasında immobilizasyon d.
  6. Ince elmas kum kaplı kesme tekerleği (8 mm çap x 0.1 mm genişlik) ile donatılmış ince bir matkap kullanarak, (Şekil 4E) altındaki dokuyu korumak için asansör ilk kesim yapmak. Sıkıca 3 mm segmenti kaldırarak, ikinci kesim yapmak, diafiz ekstremite tutarken 45 ° kesim femur Raising.
    NOT: Yüz koruması, bu aşamada tavsiye edilir.
  7. Forseps tarafından hareketsiz kemik ile, dikkatli bir künt 23 G derialtı iğne ile her iki ucuna medüller boşlukları oyun. 19 G, borular takımı içinde yerleştirilmiş 22 G, bir boru uzunluğunu yapılmış bir önceden hazırlanmış derinlik ölçer kullanılarak (Şekil 3A, ı 8 TEM), delik medüller derinliğini belirlemek ve 3 mm, emin olun (Şekil 4F-k) . Medüller kavite 22 G derinlik ölçer direnir ise, bir künt 22 G derialtı iğne ile tekrar oyun.
  8. Dikkatlice sonra proksimal distal medüller c içine medüller pimini takınavities istikrarlı 3 mm'lik boşluk (Şekil 5A, B) orijinal uzunluğuna geri femur getirmek ve kurmak. Gerekirse, femur kortikal kemik çubuk iyi bir girişim geçişimi elde etmek için el ile gerilim arasında küçük bir miktar uygulanır. Pim, her iki tarafın medüller boşlukların içine rahatça sığar ve kesim kemik kenarları yaka ile aynı hizada olduğundan emin olun. Bir boşluk varsa, bir 22 G, kör bir iğne ile bir kez daha oyun.
  9. Pim üzerinde kas ve periferik doku konumlandırmak ve sürekli bir emilebilir 5-0 dikiş (Şekil 5C) ile kapatın. Cerrahi yapıştırıcı (Şekil 5D) ile 5-7 kare düğüm naylon 5-0 sütür ve mühür ile yakın cilt kesisi.

3. Ameliyat sonrası Prosedürler

  1. Cilt kesisi kapattıktan sonra, anestezi çekilme, ama O 2 fare hareket etmeye başlayana kadar akan kalmasına izin; Bu az 1 dakika sürer. Fare 5 dakika sonra hareketsiz kalırsaO 2 yönetim, veteriner müdahale kurumsal politikalara bakın.
  2. Fare hareket başladığında, yavaşça tercihen kuru, otoklava yatak içeren bir kafese transfer.
    1. Her kafeste bir iglo tipi yuva yerleştirin ve fare hareketi azaltarak, içine çekilmek olacaktır. Fare arka ekstremite hareketlilik bilinç kurtarma sonra 5-10 dakika kurtarır kontrol edin.
    2. Kurumsal politikalar doğrultusunda günlük postoperatif izleme yapın. İlk 5-7 gün kafesin zeminine jelatinleştirilmiş nemlendirme ve yiyecek sağlamak ve kurumsal onaylanan politikalar doğrultusunda analjezi ve postoperatif izleme yönetmek.
      NOT: Biz yönetmek 0.05-0.1 mg kg -1 günde iki kez, ilk 3 gün ve daha sonra tuzlu subkutan 0.25 ml, ile buprenorfın 24 fare, normal programını yeniden değilse.
  3. Kurtarma, ilk 24 saat sonra, unde canlı hayvan X-ışını görüntüleme gerçekleştirmekr anestezi pimi yerleştirme (Şekil 4E) görselleştirmek için. Pim yerinden ise, derhal revizyon ameliyatı düşünün.
  4. Günde 7 ameliyat sonrası anda, kurumsal hayvancılık politikalarına uygun olarak gruplar halinde anestezi ve evin altında sütür çıkarın.
  5. 2-5 hafta sonra, insanca Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği ile uyumlu hayvanlar ötenazi 25 yöntemleri onaylı euthanize.
    NOT: piyasada mevcut barbiturate-kombinasyon ötenazi kokteyl bir intraperitoneal enjeksiyonu etkili ve insancıl, ama ötenazi yerel kurumsal politikalar takip edilmelidir olduğunu.
  6. Dikkatle proksimal femur ve medial taraftan pelvis teşhir ederek arka-uzuv uzak teşrih. Bir neşter ile asetabulum (kalça soketi) den femur başını ayrılmakta iken yavaşça bacak lateral tarafında içe doğru eklemi basın. Serbest, keskin bir neşter veya mikro-makas ile kas ve cilt kalan CutTüm ekstremite pelvis oluştururlar. Rongeurs veya ağır makas keskin bir çift, düşük arka-uzuv (tibia / fibula) diz ekleminin altında yaklaşık 5 mm kesti.
    NOT: Tüm örneklerin analiz öncesi aynı şekilde depolanması tavsiye edilir.
  7. Cildi çıkarın, ancak yerinde kas bırakın. 1 ay kadar önce görüntüleme için, 10 mM CaCl2 ile doldurulmuş fosfat-tampon tuzlu su içinde depolama ve ardından 1 hafta boyunca 10 mM CaCl2 sabitleyici ile takviye edilmiş,% 10 tamponlu formalin içine doku düzeltildi. 4 ° C'de tespit ve depolama gerçekleştirin. Alternatif olarak, derhal tespit olmadan örnekleri tarayın.

Örneklerinin 4. Analizi

NOT: Kemik iyileşmesi bu protokol kapsamı dışındadır metodolojileri geniş bir yelpazede tarafından değerlendirilebilir. Aşağıdaki başarılı bir örnek MikroBT'lerin (uCT) görüntüleyici kullanarak istihdam var bir yöntemdir. Aşağıdaki parametreler ar önerilirE o zaman projenin özel ihtiyaçları için optimize, başlangıçta test.

  1. Enstrüman odasında plastik sızdırmazlık film ve dikey pozisyon onu ince bir tabaka halinde numune sarın. Femur tüm tarama sırasında numune aşamasında dik olduğundan emin olun. Aşağıdaki parametrelere tarama ayarlayın; gerilimi = 29 kV, akım = 661 uA, güç = 19 W, görüntü piksel boyutu (um) = 21.00; 360 derece dönebilen = yes; Çerçeve ortalama = (5); rotasyon aşaması (C) = 1.00, rastgele hareket =. Tarama başına tek bir hedef klasör (örneğin Şekil 6A) JPEG dosyaları olarak kaydedin.
    NOT: Tarama 57 dakika içinde tam olmalıdır.
  2. Aşağıdaki parametrelere dayalı eksenel görüntüler oluşturmak için yeniden yapılanma yazılımı yararlanın; yumuşatma = (4), hiza tazminat = üzerinde, halka artefakt azaltma = (5), kiriş-sertleştirme düzeltme (% 40) üzerine, CS rotasyon (°) = 0.00 üzerinde. 2,000-15,000 Hounsfield birimlerine çıktı ayarlayın. JPEG dosyaları olarak kaydetme görüntüleritarama başına tek hedef klasörde.
  3. Eksenel görüntüleri ve analitik yazılım kullanarak, ilk proksimal ve orijinal kusur uzak kenarları ayarlayarak faiz (ROI) bölgeyi tanımlamak. Sadece yaka kapsayacak bölümleri seçerek bunu başarmak. Yaka medüller pin daha kalın olduğundan, bu bölümler kolayca (sol Şekil 6B) tanımlanır. (Sağ, Şekil 6B) (100 mikron marjı) etrafında bir dışlama alanı çizim ve ROI bölümlerin her bölgeyi aktararak hesaplamalardan yaka hariç.
    NOT: yeni kemik hacmi (Şekil 6C, D) atalet 3D oluşturulmasında ve hesaplamalar kutup dakika kolaylıkla yazılımı kullanılarak elde edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fareler genellikle bilinci kurtarmak ve arka bacak hareketlilik anestezi çekilmesinden sonra 5-10 dakika. İlk 5 gün boyunca, ayrı ayrı fareler ev ve ekstremitenin aşırı kullanımını önlemek için çevre zenginleştirme tanıtmak için tavsiye edilir. Bu amaçla, iglo tipi yuvaları yuva bina ihtiyacını azaltmak ve istirahat teşvik. Ayrıca, kafesin kat yiyecek ve hidrojelin karşılık pim yer değiştirme olasılığını azalttığını gözledik. Kurumsal-onaylanan politikalar doğrultusunda gerekli 5 günlük süre boyunca, analjezi uygulanmal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, standart laboratuvar ve veteriner ekipman kullanılarak kemirgen femur kritik boyutlu pin-stabilize kusur oluşturmak için basit bir yöntem tarif. Pimleri ve cerrahi prosedür kendisi montaj pratik gerektirir iken, iyi bir iyi eğitimli biyomedikal araştırma bilim adamı ya da veteriner yetenekleri dahilindedir.

pin eksternal fiksatörü veya birbirine vidaları istihdam daha karmaşık yaklaşımlar daha prosedür teknik olarak daha uygun hale ek fiksasyon olmadan medüller kanal içine konumla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Biz bu tekniğin gelişimi sırasında değerli tavsiye ve yardım için, Karşılaştırmalı Tıp, Temple, Teksas Scott & Beyaz Hastanesi Bölümü personeli ve veteriner hekimler teşekkür ederiz. Bu çalışma Rejeneratif Tıp Programı Fonları Enstitüsü, Scott & Beyaz ALP hibe # 90.172, NIH 2P40RR017447-07 ve NIH R01AR066033-01 (NIAMS) tarafından kısmen finanse edildi. Biz yazının prova Dr Suzanne Zeitouni teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Pin assembly
>Dremel döner aletDremel8220veya eşdeğeri
Ağır hizmet tipi kesme diskiDremel420
Cerrahi boru 19  GKüçük Parçalar (Amazon)B000FMZ8LYOD 1.07  mm, ID 0.889  mm
Cerrahi boru 21  GKüçük Parçalar (Amazon)B000FMZ8YQOD 0.82  mm, ID 0.635  mm
Cerrahi boru 22  GKüçük Parçalar (Amazon)B000FMYLZSOD 0.719  mm, ID 0.502  mm
Cerrahi boru 23  GKüçük Parçalar (Amazon)B000FN0SY0OD 0.643  mm, ID 0.444  mm
Siyanoakrilat yapıştırıcıLoctite1365882
Zımpara diskiDremel413
Kauçuk parlatma noktasıDremel462
Keçe parlatma diskiDremel414
Jelatin süngerSurgifoam/Ethicon1974
Punch biyopsi kesiciMiltex33-34
Cerrahi/ameliyat sonrası
Sıcak ped ve sirkülatör pompasıStryker/ThermocareTP700, TP700C, TPP722
Kapsama kuaterner spreySteris1429-77
Boncuk sterilizatörüGerminator/CellPoint ScentificGerminator 500
Anestezi sistemiVetEquip Inc901806 veya 901807/901809
İzofloran anestezikVETone/MWI501017, 502017
Cerrahi dezenfektanChloraprep/CareFusion260449
Cerrahi aletlerGüzel Bilim AraçlarıçeşitliAlman yapımı tavsiye
Yüz korumasıSıçrama Kalkanı4505
Şarj edilebilir yüksek hızlı matkapGüzel Bilim Araçları18000-17
Elmas kesme diskiStrauss Diaiond361.514.080HP
Emilebilir sütürler CovidienUM-213
Dış sütürlerEthicon668Gveya eşdeğeri
Vetbond3M1469SBveya eşdeğeri
Hidrasyon jeliClear H2O70-01-1082
Diyet jeliClear H2O72-01-1062
BuprenorfinReckitt ve Benckser12496-0757-01kontrollü madde
Fare iglolarıBio ServK3328, 3570,3327
Ötenazi kokteyliEuthasol/Virbac710101kontrollü madde
Analiz
Canlı hayvan görüntüleyici OrthoscanFD Pulseveya eşdeğeri
Micro-CT ünitesi ve yazılımıBrukerSkyscan1174veya eşdeğeri
Sızdırmazlık filmi/Parafilm MVWR veya Fisher100501-338, S37441
*Jenerik kaynaklar, gaz, örtü, koruyucu giysi, hayvan bakım ekipmanı gibi diğer tüm öğeler için uygundur.

Kaynaklar

  1. Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
  2. Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
  3. Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
  4. Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
  5. Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
  6. Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
  7. Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
  8. Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
  9. Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
  10. Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
  11. Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
  12. Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
  13. Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
  14. Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
  15. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
  16. Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
  17. Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
  18. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
  19. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
  20. Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
  21. Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
  22. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  23. Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
  24. Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
  25. Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
  26. Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  27. Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
  28. Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
  29. Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
  30. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
  31. Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
  32. Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
  33. Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kritik Boyutlu DefektFare Femur ModeliMedüller Pin İmplantasyonuKemik İyileşmesi AnaliziMikro BT GörüntülemeHistolojik DeğerlendirmeCerrahi Fiksasyon TekniğiKemik Rejenerasyonu ÇalışmasıSegmental Kemik DefektiRadyografik Değerlendirme
Farelerde Basit Kritik ölçekli Femoral Hata Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.