Yöntem makalesi

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

15.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52408

⸱

17 Şubat 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Özet

Burada 2 farklı nöronal popülasyondan oluşan bir ko-kültür oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), epizomal vektörler kullanılarak insan fibroblastlarından yeniden programlanır. iPSC kolonileri, fibroblast yeniden programlamasının başlamasından 30 gün sonra gözlemlenebilir. Pluripotent koloniler, nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) farklılaşmaya izin vermek için nöral indüksiyon ortamında manuel olarak seçilir ve büyütülür. iPSC'ler 1 hafta içinde hızla nöroepitel hücrelerine dönüşür ve yüksek kültür yoğunluğunda tutulduğunda kendi kendini yenileme yeteneğini korur. Birincil fare NPC'leri, 7 gün boyunca serum içeren bir ortama maruz bırakılarak astrositlere ayrılır ve üzerine embriyonik gün 18 (E18) sıçan kortikal nöronlarının (channelrhodopsin-2 (ChR2) ile transfekte edilmiş) eklendiği bir tek tabaka oluşturur. Floresan protein, tandem dimer Domates (tdTomato) ile etiketlenmiş insan NPC'leri daha sonra ertesi gün astrosit / kortikal nöron kültürüne ekilir ve 28 ila 35 gün boyunca farklılaşmasına izin verilir. Bu sistemin, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve kortikal nöronlar arasında, kortikal nöronların fotostimülasyonu üzerine sinaptik akımların sıklığındaki artıştan açıkça görülen sinaptik bağlantılar oluşturduğunu gösteriyoruz. Bu ko-kültür sistemi, iPSC'den türetilen nöronların diğer nöronal popülasyonlarla sinaptik bağlantılar oluşturma yeteneğini değerlendirmek için yeni bir platform sağlar.

Giriş

Son yıllarda, nöron ve nöronal devre fonksiyonu anlayışımız nöronal uyarılabilirliği denetleyen çeşitli Optogenetic araçlar tarafından devrim edilmiştir. Böyle bir alet ışık aktive katyon kanalı, channelrhodopsin-2 (ChR2): ışık uyarımı 1-3 cevaben ChR2 yangın aksiyon potansiyelleri ifade nöronlar. Nöronlar ışığa duyarlı normalde olmadığından, bu olağanüstü yetenek nöronların 4 genetik tanımlanmış nüfusun faaliyet kesin zamansal ve mekansal kontrolü için yeni yollar açılır ve büyük ölçüde beyin fonksiyonlarının çalışmaları hızlandırdı. ChR2 sinir ağları 6 faaliyetlerini düzenleyen nöronal gelişme 5 izlenmesi, farklı amaçlar için kök hücre araştırmaları için uygulanmıştır.

Burada nöronal bir eş-kültür sistemine yararını artırmak ChR2 kullanılır. Ko-kültür sistemleri farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin değerlendirmesini sağlar.Nöron ve glial ko-kültür, sinir sisteminin ana hücre tipi, genel olarak, bu farklı hücre tipleri arasında sinyal araştırmak ve aynı zamanda fizyolojik yanıtlar, bu sinyal önemini değerlendirmek için, hasar yayılması ve incelemek için kullanılan Potansiyel olarak, bu 7 sinyal yer alan moleküler mekanizmalar. Bir önceki çalışmada, insan iPSCs sıçan kortikal birincil kültür içeren nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia 8 varlığında nöronların içine çok hızlı bir şekilde ayırt ortaya koymuştur.

Bu protokol, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) elde edilen fare kortikal nöronlar ve nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıları sorgulamak için bir ko-kültür sisteminde ChR2 kullanan bir yöntemi göstermektedir. Biz astrositlere içine incelemek için adımlar ve hasat beyin dokuları 9 yanı sıra fare nöral progenitör hücreleri korumak ve ayırt etmek için (NPC) açıklamak ve insan NPC'ler into nöronlar ko-kültür sistemi oluşturmak için. Bu ko-kültür sistemi kurmak için, biz Okita ve arkadaşları tarafından tarif entegrasyon-ücretsiz yeniden programlama yöntemi kullanıldı. 10 insan iPSCs oluşturmak için. Li ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bu iPSCs sonra verimli bir şekilde küçük moleküllü inhibitörleri kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış ortamlarda NPC ayrışmıştır edildi. 11

Ko-kültürlerinde nöronların farklı popülasyonlar Domates (tdTomato) dimer floresan protein, tandem ile iPSC türetilen nöron kortikal nöronlarda ChR2 ekspresyonunun saptanması ve etiketleme yoluyla tespit edilebilir. Kortikal Nöronların Optogenetic photostimulation ile iPSC türetilmiş nöronlardan elektrofizyolojik kayıtları birleştirme birbirleriyle devreleri oluşturmak üzere nöronların bu iki tip yeteneğinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Spesifik olarak, kortikal nöronlar ChR2 ifade photostimulation sinaptik devreleri oluşmuş iPSC türetilen nöron sinaptik tepkiler uyandırmakphotostimulated kortikal nöron ağı ile. Bu artış postsinaptik akımlar gerçekten bu koşullar altında iPSC türetilen nöron tespit edilir olduğunu göstermektedir. Bu protokol, hastalarından fibroblastlardan elde edilen iPSCs kullanarak farklı nörolojik hastalık modelleri içinde tekrarlama da dahil olmak üzere deneysel koşullar, çeşitli altında sinaptik devre değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Protokol

NOT: Bütün deneyler SingHealth Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip gerçekleştirilir edilir.

1. Hasat Erken Doğum Sonrası Fare Brain

  1. 1 mi 1 x Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (+% 1 HEPES) deoksiribonükleaz I ile (DNase I) (250 U / ml) ve Dispase II (1 U / başına 10 ul papain: diseksiyon önce, hipokamp dokusunda sindirim çözelti hazırlamak mi). Doku sindirim çözeltisi yaklaşık 2.5 ml yapın ve 0.20 mikron filtre ünitesi kullanarak filtre. Kullanılana kadar 37 ° C'de çözelti, sıcak tutun.
  2. 5 dakika boyunca buz koyarak doğum sonrası gün 5 (P5) fareler yavrular uyutmak. Ayak veya kuyruk tutam yoluyla ağrı refleksi buz ve testi çıkarın. % 70 etanol ile yavrular püskürtün. Yavrular başını kesmek ve buz üzerine bir petri tabağına kafaları yerleştirin.
  3. Küçük scisso bir çift, burun kafatası tabanından, orta hat boyunca deride bir kesi yapmakrs veya ince diseksiyon forseps. Peel cildi açmak ve kafatası yoluyla benzer bir kesi yapmak. Kafatasının her iki tarafında iki ek yatay kesik, (bregmadan at) bir rostral ve (lambda at) bir kaudal olun.
  4. Peel altta yatan beyin maruz kazıma çizgiler boyunca kafatası açın. Koku ampuller örten kafatası ve aralarında herhangi bir orta hat kemiği kaldırmak için forseps bir çift kullanın. Olmayan Diseksiyon el forseps bir çift ile istikrarlı bir kafa tutarken yapın.
  5. Beynin ventral kısmı ve kuyruk ucunda kafatası tabanı arasında bir spatula düz kısmını kolaylığı. Beynin altında kafatası tabanına spatula paralel tutulması, beyin ve kafatası tabanında arasında herhangi bir yapışıklıklar koparmaya kafatası rostral sonuna doğru hareket ettirin.
    1. Spatula ile beyin oymak ve buz-soğuk 1x EBSS (+% 1 HEPES) içeren bir Petri kabındaki yerleştirin. Her zaman batık dokuları tutun.
  6. Tüm içinMikro-diseksiyon adımlar, bir mikroskop altında çalışması ve her el ince diseksiyon forseps bir çift kullanın, doku kesme biri ve istikrarlı doku tutmak için diğer.
  7. Bir kesim, sadece Beyin ayırmak için beyin korteksinde posterior olun. Iki hemisfer içine serebral korteks ayırmak için orta hat boyunca kesin. Serebral hemisferden meninksler çıkarın.
  8. Bir yarımkürede medial tarafı yukarı yerleştirin ve hipokampus altında lateral ventrikül içine forseps yerleştirin. Ortabeyin kesip.
    1. Hipokampus üst ve alt uçlarında kesikler yapın, ve dentat / entorhinal korteks kavşak yakınında korteksten hipokampus izole etmek. Buz soğukluğunda 1x EBSS (+% 1 HEPES) ihtiva eden bir tabak içinde hipokampları toplayın.

2. Hipokampal Doku Ayrılma

  1. Önceden ısıtılmış hipokampal doku sindirim çözümü içeren bir çanak hippocampi aktarın. Kıyma tMümkün olduğu kadar iyi dokuların hipokampal ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  2. Yavaşça, 15 ml bir santrifüj tüpüne mekanik pipetleme ve transfer hücreleri tek hücre içine dokuları ayırmak.
  3. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj çıkartıldı ve süpernatan.
  4. 20 ml içinde süspanse hücre peleti, 10 dakika boyunca 200 x g'de sakaroz (0.9 M) ve santrifüj içeren Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), 0.5X.
  5. NPC bakım ortamına (Tablo 1) 2 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın, 5 dakika süreyle 200 x g'de 1X EBSS çözeltisi ve santrifüj içinde% 4 Sığır Serum Albümini (BSA), 10 ml üstüne yerleştirilir.
  6. Süpernatantı ve hücre peleti fare NPC bakım ortamına (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça yukarı pipet ve 5-10 kat aşağı hücre pelet tek hücre bölünür sağlamak.
  7. Önceden kaplanmış Matrigel plakalara içeren ortamda hücre transferi ve epidermal büyüme faktörü (EGF) ve tüp fibrobla eklemekHeparin st büyüme faktörü 2 (FGF2) (her ikisi de 20 ng / ml) (5 mg / ml) eklenmiştir. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin.

Yapışık Fare Hipokampal NPC 3. Bakım

  1. En az bir saat önce Pasajlanması fare hipokampal NCPlerle kaplanmış plakalar / şişeler hazırlayın. Her bir plaka veya cam şişe yüzey alanı kapsayacak ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe olmaya yeterli Matrigel ekleyin.
  2. % 90 birleşen fare NPC kültürlerinden ortamı çıkarın ve sonra PBS aspire 1x Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ile bir kez yıkayın.
  3. Tüm oyuklar / şişeler kapak ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleyin.
  4. Tüm hücreleri 10X büyütmede ters parlak bir alan mikroskobu altında bakarak müstakil emin olun. Hala bağlı hücreler varsa, bir daha 1-2 dakika kültür gemi inkübe ve yine hücreleri kontrol edin. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Ham F-12 Besin Karışımı iki miktarını ekleyin (DMEM / F-12)kuyulara hücre ayrılma çözümün olduğu gibi / şişeler kez tüm hücreler müstakil oylandı.
  5. 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj içine DMEM / F-12 içeren hücreleri aktarın.
  6. Fare NPC bakım ortamına (Tablo 1), 5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Yavaşça tek hücre içine hücre pelet kırmak için aşağı yukarı pipet ve.
  7. EGF ve FGF2'nin ile desteklenmiş yeni kültür kuyuları / şişeler ve kontör yeterli kültür ortamı içine toplam hücrelerin üçte Plate. 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde kültür hazneleri inkübe edin. 3 Her 3 ila 4 gün: Orta her ikinci gün ve split hücreleri 1 doldurun. Toplanmasını ve dekolmanı önlemek için fare NPC kültürlerin üremesine kaçının.

Astrositler içine Fare NPC 4. Farklılaşma

  1. Astrositlerde içine fare NPC farklılaşmasını başlatmadan önce peşin poli-L-Lizin (PLL) / laminin kaplı 12 mm kapak gözlük en az bir gün hazırlayın. Cov ekle24-iyi plaka içine erslips yeterli PLL (borat tampon maddesi içinde 1 mg / ml) ile kuyu tüm yüzey alanını kaplar.
    1. 4 ° C de gece boyunca plaka inkübe edin. Ertesi gün, PLL çıkarın ve 1x bir kez PBS ile yıkayın.
  2. Daha sonra, 37 ° C'de en az 4 saat süreyle inkübe daha iyi herbirinin bütün yüzey alanını kapsayan, (buz soğuk DMEM / F-12 içinde 1 mg / ml), laminin ekleyin.
  3. Fare NPC kültürlerinden ortamı çıkarın ve sonra PBS aspire 1x kez PBS ile yıkayın.
  4. Tüm oyuklar / şişeler kapak ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleyin.
  5. Tüm hücreler daha sonra müstakil DMEM / F-12 kuyu / matara hücre ayrılma çözümünün bu kadar iki kez miktar eklemek emin olun.
  6. 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj içine DMEM / F-12 içeren hücreleri aktarın.
  7. 5 ml astrosit farklılaşma ortamı (Tablo 1) süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Yavaşça pipet hücre suspension yukarı ve aşağı tek hücre içine hücre pelet kırmak için. Bir hemasitometre ile tek hücre sayısını.
  8. 5 x 10 4 hücre / cm, 24 oyuklu plakanın her bir kuyu için orta 2 500 ul plaka hücreleri. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin. Her ikinci gün taze ortam ile orta yarısı değiştirin. Fare NPC hızla 2 gün içinde astrositlerde içine farklılaştırmak ve başka deneyler başlamadan önce bir hafta ayrılır.

5. Hasat Embriyonik Fare Brain ve Kortikal Doku Ayrılma

  1. Astrosit kültürlerinden astrosit farklılaşma orta (Tablo 1) çıkartın ve primer nöron ortamı (Tablo 1) embriyonik fare beyinleri hasat başlamadan önce en az 4 saat ile değiştirin.
  2. 12.1 mg / ml L-sistein ile 1 mi 1x EBSS'ye (+% 1 HEPES) başına 10 ul papain: diseksiyon önce, kortikal doku sindirim solüsyon hazırlanır. Yaklaşık 2 olun0,5 doku sindirim çözeltisi ve bir 0.20 mikron filtre birimi kullanılarak filtre. Kullanılana kadar 37 ° C'de çözelti, sıcak tutun.
  3. Sıkıştırılmış gaz kullanarak karbon dioksit boğulma hamile baraj Euthanize. Ayak veya kuyruk tutam yoluyla ağrı refleks test edin.
  4. Emici ped üzerine hayvan ventral tarafı yukarı Lay ve% 70 etanol ile karın bölgesi ıslatın. Karın maruz yeterince geniş, forseps bir çift ile cildi sıkın ve cerrahi makas bir çift ile bir yanal kesi yapmak. Forseps ile periton kavrayın ve karın boşluğunu açın kesti.
  5. Forseps ile uterin boynuz yukarı kaldırın ve mesometrium boyunca ücretsiz kesti. Buz üzerinde Petri kabındaki disseke rahim yerleştirin. Aralarındaki rahim dokusunun keserek her embriyo ayırın.
    1. Embriyonik kese bir kesi yapmak. Yavaşça açıklıktan fetus dışarı kabuk. Fetüsü başını kesmek ve buz üzerinde bir Petri kabı baş koyun.
  6. Embryo hasat içinic sıçan beyinleri, adım 1,3-1,5 açıklamayı izleyin.
    1. Kortikal dokuları incelemek bir beyin hemisfer yanal yüzü yukarı yerleştirin. Orta yanal iki yarımkürede kesin. Beyin tabanına yarısı yakın atın. Ortabeyin kaldırmak için eksize doku Trim.
  7. Önceden ısıtılmış kortikal doku sindirim çözümü içeren bir çanak kortikal dokuları aktarın. Mümkün olduğu kadar ince kortikal dokular kıyma ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  8. Önceden ısıtılmış primer nöron ortamı (Tablo 1) 10 ml içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku sindirim çözeltisi kortikal dokular aktarın. Hiçbir doku parçaları ile homojen bir solüsyon elde edilinceye kadar, bir serolojik pipet defalarca onları pipetleme ve aşağı kortikal dokuları ayırmak.
  9. Kalan doku kümeleri filtrelemek için 70 mikron hücre süzgecinden doku çözümü geçirin. 15 ml doku çözeltisi alikosuHer bir tüp içinde, yaklaşık 3 ml ilave santrifüj tüplerine.
  10. Alt ve üst BSA Doku çözeltisi ile iki tabakayı oluşturan her bir tüpün dibine 1x PBS içinde 800 | il% 7.5 BSA ekleyin.
  11. 5 dakika süreyle 200 x g'de santrifüjleyin. İki katman arayüzünden, aspirasyon süpernatantı. Tüpün alt hücre pelet rahatsız kaçının.
  12. 1 ml primer nöron ortamı (Tablo 1), her bir hücre pelletini ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde birleştirin. Hemasitometre kullanarak hücre yoğunluğu belirleyin.

6. Elektroporasyon ve Kaplama İlköğretim Kortikal Nöronlar

Not: Gen transferi, elektroporasyon, kalsiyum fosfat transfeksiyon ve viral transdüksiyon dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, biz ChR2 Primer kortikal nöronların içine inşa teslim elektroporasyon açıklar.

  1. Santrifüj 6 x 10 6 sıçan kortikal nöronlar5 dakika için 200 xg t ve süpernatant kaldırmak. En az 6 x 10 6 kortikal nöronlar nöronların hayatta kalan bir nöronal ağ oluşumunu sağlamak için elektroporasyon için gereklidir.
  2. Pelet hücre ve yavaşça tekrar süspansiyon elektroporasyon çözeltisi 100 ul ekleyin. Randımanlı-synapsin-hChR2 6 ug (H134R) -EYFP-WPRE 4 plazma hücre süspansiyonu 100 ul birleştirin ve sertifikalı bir küvet içine aktarın. Aktarım sırasında hava kabarcıkları üreten kaçının.
  3. Seçin ve üreticinin talimatlarına göre elektroporasyon için uygun programı uygulamak.
  4. Elektroporasyon işleminden sonra küvete hücre / DNA süspansiyonuna MEM 500 ul ilave edin. 11.5 ml primer nöron ortamı (Tablo 1) örnek aktarın ve yavaşça yeniden süspanse edin. ortam toplam miktarı, bütün 24-delikli plaka için yeterlidir. Kısım 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyu için ortamının 500 ul. 37 ° C'de plaka ve% 5 CO2 inkübe edin.

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin 7. Nesil

NOT:. Bu yöntem Okita ark adapte edilmiştir 10

  1. DMEM içinde kültür insanlara özgü fibroblastlar; 6-yuvalı plakalar içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir.
  2. Matrigel ile fibroblastlar, kat 6-kuyu yeniden programlama başlayan ve oda sıcaklığında en az bir saat süreyle inkübe önce. % 80 izdiham, fibroblast kültürlerinden ortamı çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  3. Tüm plaka kapağı ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe etmek için yeterli,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin.
  4. Hücreler kuyulardan yerinden sonra tripsin tripsin sindirimi söndürmek için,% 10 FBS DMEM, iki miktarını ekleyin. Yavaşça aşağı pipet hücre süspansiyonu yukarı ve hücreleri kırmak için. Bir hemasitometre ile tek hücre sayısını.
  5. 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj 5 200 xg'de hücre süspansiyonu içine aktarın 7 x 10 5 hücreMin.
  6. Süpernatantı ve elektroporasyon çözeltisi hücre pelletini. Üreticinin talimatlarına uygun olarak fibroblastlar Electroporate. Elektroporasyon tampon maddesi içinde 100 ul hücrelerin tekrar ve her bir epizomal vektörün 1 ug ekleyin. 1650 V ayarları, 10 ms ve 3 kez darbeleri ile electroporate hücreler.
  7. DMEM içine aktarın, hücre süspansiyonu,% 10 FBS ve plaka, bir 6-yuvalı plaka başına 5 x 10 4 hücreleri ile takviye edilmiştir. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin.
  8. 48 saat sonra, transfekte fibroblast kültürlerinden ortamı çıkarın ve mTeSR ortamı ile değiştirin. Uyarılmış pluripotent kök hücre (iPSC) koloniler izole edilmesi için hazır olana kadar günlük kültür ortamı değiştirin. iPSC koloniler 28-35 gün sonra gözlenebilir.
  9. Ne zaman izolasyonu için hazır, mekanik bir iPSC koloni kesilir ve bir Matrigel kaplı 6-çukurlu plaka 12 üzerine 10 uM, Rho-ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (Y-27632) ile mTeSR ortamında reseed. Günlük kültür ortamı değiştirin.

8. Sinir İndüksiyon ve İnsan NPC Bakım

Not:. Bu yöntem, Li ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir 11

  1. IPSC kültürler% 20 birleştiği çevresinde olduğunda, mTeSR orta kaldırmak ve nöral indüksiyon ortamına (Tablo 1) ile değiştirin. Her ikinci gün orta doldurun.
  2. 7 gün sonra, sinir indüksiyon orta kaldırmak ve insan NPC bakım ortamına (Tablo 1) ile değiştirin. Kültürleri pasaj önce 7 gün orta her ikinci gün kadar doldurun.
  3. Önce en az bir saat süre ile, oda sıcaklığında Matrigel ile kültür, kaplama plakaları / şişeler pasaj.
  4. Konfluan insan NPC kültürlerden ortamı çıkarın ve sonra PBS aspire 1x kez PBS ile yıkayın.
  5. Tüm oyuklar daha sonra 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe karşılamak için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleyin.
  6. Tüm hücreler müstakil emin olun. DMEM iki katını ekleyin /F-12 oyuk / şişelere hücre ayırma çözeltisi kadar iyi değildir.
  7. 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj içine DMEM / F-12 içeren hücreleri aktarın.
  8. 5 ml insan NPC bakım ortamına (Tablo 1) yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Yavaşça aşağı pipet hücre süspansiyonu yukarı ve hücreleri kırmak için.
  9. Plaka Matrigel kaplı kültür kuyuları / şişeler ve kontör 10 uM Y-27.632 ile desteklenmiş yeterli ortam içine toplam hücrelerin üçüncü. 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde kültür hazneleri inkübe edin.
    1. Bölünmüş kültürleri 1: 3, her 3 ila 4 gün ve her gün orta doldurmak. Farklılaşma önlemek için yüksek yoğunlukta insan NPC kültürleri korumak.

Co-kültürler Nöronlar içine İnsan NPC 9. Farklılaşma

  1. Nöronların içine farklılaşmayı başlatmadan önce insan NPC kültürüne lentiviral vektör Synapsin1-tdTomato ekleyin. Astrocyte / kortikal nöron ko-kültür hazırlayınİnsan NPC ayırt önce bir gün önceden.
  2. 1x PBS ile bir kez, insan NPC kültürleri yıkayın ve kuyu kapağı için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleme / şişeler daha sonra 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
  3. Tüm hücreler müstakil emin olun. Oyuk / şişelere hücre ayırma çözeltisinin olarak DMEM / F-12 iki kez miktarını ekleyin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine transfer edin. 5 dakika süreyle 200 x g'de santrifüjleyin.
  4. 5 ml nöronal farklılaşma ortamı (Tablo 1) süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Yavaşça pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı tek hücre içine hücre pelet kırmak için. Bir hemasitometre ile tek hücre sayısını.
  5. Dikkatle astrocyte / kortikal nöron kültürlerinden orta aspire. 5 x 10 3 hücre / cm nöronal farklılaştırma ortamının 2 500 ul her bir 24 oyuklu 10 uM-Y-27632 ile desteklenmiş (Tablo 1) plaka insan NPC. Yavaşça her bir oyuğa, insan NPC içeren ortam ilaveastrositler ve kortikal nöronların rahatsız etmemek için.
  6. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin. En az 28 gün süreyle taze ortam ile her 2-3 gün orta yarısı değiştirin.

IPSC türetilmiş nöronlar 10. Elektrofizyolojik kayıtlar

  1. İnsan iPSCs olgun nöronlar gibi davranırlar olmadığını onaylayın.
    1. Bir 60X (0.9 NA) suya daldırma lens ile donatılmış bir dik konfokal mikroskop kullanılarak tdTomato görselleştirme insan iPSCs ayırt hücreleri bulun.
    2. Harici bir çözelti içinde oda sıcaklığında 4-6 M serpmek hücre direncine pipet kayıt çekin (Tablo 1)% 95 O 05/02% CO2 ile sürekli olarak kabarcıklar halinde. İç solüsyon (Tablo 1) ile kayıt mikropipet doldurun.
    3. Cur mevcut enjeksiyon (1 sn süresi, 10 pA artışlarla) yanıt olarak bütün hücre modu ve kayıt aksiyon potansiyeli ateş yama tdTomato + hücrekelepçe kira.
  2. ChR2 ifade kortikal hücrelerin aksiyon potansiyeli güvenilir ışık uyarımı ile uyarılmış ise onaylayın.
    1. Konfokal mikroskop altında GFP görselleştirme ile ChR2 ifade kortikal hücrelerin bulun. Adımları 10.1.3 için 10.1.2 takip ederek kortikal hücreler üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapın.
    2. Kontrol aksiyon potansiyeli güvenilir cıva ark lambası (100 W) ile hafif aydınlatma ile uyarılmış edilir. uyarılma filtreli dalga boyu 480/40 nm.
  3. Optogenetic stimülasyon gerçekleştirin.
    1. Yama tdTomato + tam hücreli modunda hücre ve -70mV ayarlanmış gerilim kelepçe. 2 kHz akım sinyallerini Filtre ve 10 kHz dijital ortama. 10 kayıtları sırasında tutarlılık için 20 M arasında değişen serisi dirençlerini izleyin.
    2. 30 saniye için 100 W cıva lambası ile 480/40 nm uyarma filtresi ile bütün alanını teşvik.
    3. Tutanak postsinaptik akımlar ve photostimulation tarafından uyarılan yamalı hücrenin (PSC'ler) presinaptik kor ChR2 ifadekortikal nöronlar. Algılama ve PSC'ler ölçün. Sırasıyla 5 pA ve 20 pC'den en genlik ve akımlar alanı için belirlenen eşik. Elle olmayan PSC izlerini silmek için bu olayları incelemek.

Sonuçlar

Burada, astrositler içeren bir ko-kültür üreten alan çoklu aşamalarını tarif protokol kortikal nöronlar ve insan nöron görüntülenmiştir. İnsan iPSCs yüksek yoğunluklu (Şekil 1A) muhafaza edilmiş NPC 11 yaparak, küçük molekül inhibitörlerinin bir kokteyl ile bir sinir soy içine epizomal kullanarak fibroblastlar yeniden programlama ile elde edilen 10 vektörleri ve belirlenmiştir. TdTomato (Şekil 1B) ile etiketlenmiş insan NPClerden astrositlerde içine fare NPC farklılaşmasını, ChR2 ifade sıçan kortikal nöronların kaplama ve ekim: Çeşitli adımlar ko-kültür oluşturmak için gereklidir. Farklılaşma 2 gün içinde Glial fibrilar asidik protein (GFAP) + astrositler kolaylıkla eden kültürler (Şekil 1C) 'de görülmektedir. Fare NPC astrosit tek katmanlı (Şekil 1D) üzerine ChR2 ifade kortikal nöronlar kaplama önce en az bir hafta için ayırt etmek için izin verilmiştir. 3 sonraİnsan NPC farklılaşma 4 hafta, tdTomato + nöronlar kültürleri (Şekil 1E) tespit edilmiştir.

Bu ko-kültür sistemi ışık uyarımı (Şekil 2A) yanıt olarak tek tek iPSC türetilmiş nöronlardan postsinaptik akımlar sürekli tespit edilmesine olanak sağlar. Işık ile uyarıldığında, aksiyon potansiyeli ChR2 (Şekil 2B) ifade kortikal nöronlarda üretilmiştir. Mevcut edilen kutuplaşma giderici darbelerin genliği artmış aksiyon potansiyeli ateşlemesini gösteren nöronları da (Şekil 2C) uyarılabilir olan iPSC türetilen (Şekil 2D) yükseltilmiştir. Bu nedenle, bu hücreler olgun nöronal özellikler sergiler. Işık yokluğunda, iPSC türetilen nöron spontan sinaptik giriş (Şekil 2E) verildi. GABA reseptörleri aracılığıyla akımlar dışa olurdu çünkü bu içe postsinaptik akımlar ağırlıklı, AMPA alıcıları tarafından aracılık ve NMDA reseptörleri mevcut a taşımak yok-70 mV tutma potansiyeline t. Hafif stimülasyon ölçüde postsinaptik akımlar (Şekil 2E) sıklığını artması nedeniyle en azından bazı girdilerin, CHR2 ifade presinaptik kortikal nöronlar arası idi. sinaptik girdi bu artışın zaman ders Şekil 2F gösterilmiştir: kortikal nöronların photostimulation 30 sn uzun ışık flaş boyunca devam edildi. ChR2 ifade kortikal nöronların (Şekil 2G) photostimulated zaman PSC'ler sıklığı yüksek iken, onların genlik (Şekil 2H) etkilenmemiş oldu. Özetle, bu sonuçlar iPSC türetilen nöron olgun nöronal özellikler sergiledi ve presinaptik kortikal nöronlar ile sinaptik bağlantılar oluşturabilir göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: ortak-kültürünün oluşturulması için şematik diyagramıiPSCs ve NCPlerle nöral indüksiyon, insan fibroblastlar yeniden programlanması için sistem. (A) Timeline. kortikal nöron ve astrosit kültürleri üzerinde olgun nöronların içine insan NPC terminal farklılaşması için (B) Timeline. (C) Fare NPC hızla GFAP içine ayırt + astrositler 2 sonra in vitro gün. (D) Bir hafta sonra, ChR2 ifade kortikal nöronlar GFAP + astrositler üzerine ekildi. (E) 4-5 hafta sonra, insan NPC ayrılmasından sonraki elektrofizyolojik tdTomato + nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Ölçek çubukları 100 um temsil eder.

figure-results-2
Şekil 2: Fonksiyonel sinaptik bağlantı optogenetic analizi. TdTomato (kırmızı) ile etiketlenmiş, (A) iPSC türetilmiş hücreler kortikal nöronlar ifade ile birlikte kültürlenmiştir ışıkla aktiveKanal, ChR2 (yeşil). IPSC türetilmiş nöronların Kayıtlar kortikal nöronların veya diğer iPSC-türetilmiş nöronların birinden gelebilir postsinaptik akım (PSC) yanıtları, ortaya. (B) Aydınlatma (mavi çubuk) ChR2 ifade kortikal nöronlarda aksiyon potansiyelleri bir dizi uyarılmış. ( C) iPSC türetilmiş hücreler ChR2 ifade kortikal nöronlar (E) photostimulation (mavi bar) korur. iPSC türetilmiş hücre akım eğrisi vs D) Pişirim (. Mevcut enjeksiyon ile uyarılmış iPSC türetilen nöron PSC'lerin sıklığı arttırılır . photostimulation tarafından üretilen PSC sıklığında bir artış (F) zaman akışı. Mavi çubuk photostimulation zaman gösterir. PSC frekans photostimulation (G) bir artış iken (G, H), PSC genlik etkilenmemiş (lH) idi. * P <0.05, öğrencinin t-testi ile kontrol grubuna göre gösterir.

Tartışma

Optogenetik nöronların 13 belirlenen popülasyonlarının aktivasyonu için zamansal ve uzamsal kesinlik sağlar. Deneylerde, mikroskop objektif tüm alanı ChR2 ifade fotoğraf uyarmak sadece kortikal nöronların 30 saniye aydınlattı. Bu sinaptik bağlantıları ko-kültür içindeki nöronların farklı popülasyonlar arasındaki oluşmuş olup olmadığını belirlemek bize izin verdi. Bizim sonuçlar photostimulation bu nöronlar ChR2 ifade presinaptik kortikal nöronların sinaptik girdi almak olduğunu göstermektedir ki, iPSC türetilmiş nöronlarda PSC sıklığını artırmaktadır ortaya koydu. Bu da, iPSC türetilen nöron başarılı bir şekilde kortikal nöronlar devrelerin içine dahil olduğu saptanmıştır.

Bu ko-kültür sisteminin oluşturulması için pek çok kritik adım vardır. Bu kaplama ile devam etmeden önce fare NPC türetilmiş astrosit kültürleri, minimal hücre ölümü ile, sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidirdiğer hücre türleri. Kortikal nöronlar ve insan NPC sağlıklı astrositlerde üzerine de eklemek ve elektrofizyolojik kayıtlar kültür koşulları ağır bağlıdır. Bu protokolde diğer önemli adımlar astrosit kültürleri üzerine elektroporasyon ve kortikal nöronların kaplama vardır. Hücrelerin geniş bir sayısı elektroporasyon sonra kalıp gibi, en az 6.000.000 kortikal nöronlar, 24 oyuklu plakalar içinde astrosit kültürleri üzerine kaplama için elektroporasyona sağlamak için önemlidir. Biz az 6 milyon hücre elektroporate zaman, hayatta nöronların sayısı elektrofizyolojik kayıtları etkilenen yoğun nöronal ağ oluşturmak olmadığını gözlemledik. Her ko-kültür deney farklı çalışmalar arasında karşılaştırma izin için electroporated kortikal nöronların sayısı da tutarlı olmalıdır. Enzimatik sindirim ile ilgili tüm adımlar için, çok uzun hücre ölümüne neden olabilir sindirim çözelti hücreleri bırakmamaya esastır.

Buyaklaşım, diğer nöronlarla sinaptik temas oluşturmak üzere, hastaya özgü fibroblastlar türetilen nöron yeteneği taranması için kullanılabilir. Nöro bozukluğu Rett sendromu (RTT) mustarip hastaların fibroblastlardan elde edilen nöronlar sinaptik transmisyon kusurlar sergilerler: RTT nöronlar ki tahminen bu, daha az sinaptik bağlantı 14 sağlıklı nöronlara göre PSK frekans ve genlik belirgin bir azalma sergiler. Bizim co-kültür sistemi gelişim kusurları görüntüleyen nöronlar üzerinde uyuşturucu etkileri muayene izin verir. Bu hastalıklı insan NPC ekim sırasında ve aynı zamanda nöronal farklılaşma süresi boyunca bileşiklere sürekli maruz kalma sırasında söz konusu bileşikler, ilave edilerek gerçekleştirilebilir.

Bu ko-kültür sistemi de uyuşturucu testi için bir model olarak kullanılabilir iken, bu yaklaşım ile bir sınırlama her aday bileşiğin etkilerini araştıran süreci uzun ve gibi sıkıcı olabilir kiBu, yüksek veri akışı tarama yöntemi değildir. Aday bileşikler ile işlemden geçirildikten sonra, iPSC türetilen nöron ayrı PSC'lerin her bileşiğin etkisini belirlemek için yama gerekir. Ayrıca, şu anda hastaların pek mevcut fibroblastlar ve iPSCs vardır. Bu nedenle, daha sabırlı hücrelere sahip ve aynı zamanda yüksek verimli tarama için bu protokolü adapte yakın gelecekte ilgi olacaktır. Örneğin, bu gibi iyonları ya da zar potansiyeli genetik olarak kodlanmış sensör olarak bir etkinlik göstergesi iPSC türetilmiş nöronlar, etiketleyerek yan adım zaman alıcı elektrofizyolojik prosedür ile esas olarak akış oranını artırmak için mümkün olacaktır. Elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmeden fibroblastları yeniden programlanması gelen, bu ko-kültür sistemi üreten tüm süreç olarak, en fazla 90 gün, sırasıyla yeniden programlama ve nöral indüksiyon adımlarından sonra, insan iPSCs veya NPC ya genişletilmiş olması tavsiye edilir gerektirir,ve kriyoprezerve gelecek deneyler için gerekli zamanı azaltmak için.

Deneylerde, biz synapsin1 promotörün kontrolü altında kortikal nöronlarda ChR2 ifade edilmiştir. Bu promotör Pan-nöronal olduğundan, biz muhtemelen hem inhibitör ve eksitatör kortikal nöronlar photostimulating edildi. Gelecek deneylerin amacı, özellikle engelleyici veya uyarıcı ya da devre sorgulamak için ise, daha özel promoterler kullanılabilir. Alternatif olarak, kortikal nöronlar transjenik (ya da virüs enjekte edilen fareler) ChR2 sentezleme, özellikle nöron genetik tanımlanmış alt popülasyonlar hedeflenen elde edilebilir. Örneğin, Cre recombinase sahip bir fare hasat kortikal dokular ChR2 ifade sadece kortikal nöronlar PV internöron 15 olacak bir durum verecektir floxed ChR2 ile bir fare ile geçilen parvalbumin içeren internöronlar (PV internöron) olarak ifade edilmiştir. Böyle ChR2 ifade eden de internöronlardan ko-cu kullanımılture sistemi yamalı iPSC türetilmiş nöron PV internöronlar bir devrenin içine dahil etmek mümkün olup olmadığı tespitine imkan olacaktır.

Bir önceki çalışmada 9 dayanarak, kortikal nöronlar in vitro 14 gün sonra dendrit örtüşen olgun. Photostimulation bir yamalı iPSC türetilmiş nöron bir tepkisi yoksa Böylece, bu nöron kortikal nöronlar ile sinaptik bağlantıları yapmak için yeteneğine sahip olmadığını belirtmelidir. Bir iPSC türetilmiş nöron diğer iPSC türetilmiş nöronlar veya kortikal nöronlar ya sinaptik girdi alabilir. Geleneksel yama kelepçe kayıtları kullanılmış olsaydı, bu sinaptik girdi nereden geldiğini ayırt etmek mümkün olmazdı. Bizim sistemin avantajı kortikal presinaptik girişten postsinaptik cevaplar seçici uyarılmış ve tespit edilebilir olmasıdır. Burada özetlenen prosedürler entegre iPSC türetilmiş nöronların yeteneğini değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlamaktanımlanmış bir nöronal ağa.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

Biz iPSC nesil uzmanlık ve protokol paylaşımı için, sırasıyla ChR2 ve Synapsin1-tdTomato lentiviral yapıları C. Chai K. Deisseroth ve S. Je teşekkür, WY Leong, teknik destek için, paylaşım reaktif ve uzmanlık için Goh laboratuar üyeleri. Bu çalışma ELG onun Rekabet Araştırmaları Programı (002-082 2008 NRF-CRP UÇK) altında Ulusal Araştırma Vakfı Singapur, Abbott Beslenme ve ELG için Mükemmeliyet Merkezi Akademik (ACE) GlaxoSmithKline (GSK) araştırma ödülü tarafından desteklenen ve GJA ve Eğitim, Bilim ve Kore Teknoloji (MEST) Bakanlığı tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı World Class Enstitüsü (WCI) Programı (UÇK) tarafından (UÇK Hibe Numarası: BÇYÖ 2009-003) GJA için

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nörokült Proliferasyon Kiti (Fare)STEMCELL Teknolojileri5702NSC Bazal Ortam ve NSC Proliferasyon Takviyesi İçerir
Epi5 Epizomal iPSC Yeniden Programlama KitiInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Nörobazal ortamInvitrogen
Glutamin içermeyen MEMInvitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B27Invitrogen17504044
L-glutaminInvitrogen25030081
GlutaMAX takviyesiInvitrogen35050061
PenStrepInvitrogen15140122
BSASigmaA7906
İnsan LIFCanlandırıcıPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biyoteknoloji130103926
SB431542SigmaS4317
Bileşik EMerck Millipore565790
EGFMerck Millipore 324856
FGF2Ar-Ge D Systems233FB025
Araştırma Sınıfı FBSThermo ScientificSV30160.03Astrosit farklılaşma ortamı için
Tanımlanmış FBSThermo ScientificSH30070.03Primer nöron ortamı için
PBSThermo ScientificSH30028.02
GlukozSigmaG8270Primer nöron ortamı için
SükrozSigmaS0389
HeparinEMD Millipore375095
PapainWorthington3126
HBSSİnvitrojen14175095
DNaz IRoche10104159001
Dispase IIKÖK HÜCRE Teknolojileri7923
HEPESGibco15630080 hasat beyinleri
EBSSInvitrogen14155063
L-SisteinSigmaC7352
Tripsin-EDTAInvitrogen25200056
70 ve mikro; m hücre süzgeciBD Biosciences   352350
20 ve mikro; m filtre ünitesiSartorius Stedim16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D (+) - GlukozSigmaG7520Elektrofizyolojik çalışmalar için
K-glukonatSigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375Elektrofizyolojik çalışmalar için
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
Borosilikat cam kılcal damarlarWorld precision instruments, Inc1604323
15 ml santrifüj tüpüBD Biosciences 
50 ml santrifüj tüpüBD Biosciences352070
24 oyuklu plakalarCorning9761146
6 oyuklu plakalarCorning720083
T25 şişeleriCorning430641
12 mm kapak camlarıMarienfeld-Superior111520
AMAXA Sıçan Nöron Nükleofektör Kiti ve nbsp;LonzaVPG1003Primer kortikal nöronların elektroporasyonu için
Neon Transfeksiyon Sistemi İnsan fibroblastlarının elektroporasyonu içinInvitrogenMPK5000
Mini Analizi PSC'lerin ölçümü içinSynaptosoftMini Analiz v.6
Normal Dermal İnsan FibroblastlarıPromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPREAddgene20945
Cıva kısa ark lambasıOSRAMHBO 103 W/2
, 21103049352096

Kaynaklar

  1. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  4. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  5. Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
  6. Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
  7. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
  8. Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
  9. Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935(2012).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  12. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
  13. Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  14. Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  15. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

iPSC Kaynakl N ronlarChannelrhodopsin 2Optogenetik Stim lasyonSinaptik Ak mlarnsan NPC DiferansiyasyonuAstrosit MonotabakasElektrofizyolojik Kay tlarKonfokal Mikroskopi
Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.