Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Özet

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Özet

Retina görsel sisteme kapıdır. Görsel sinyal işleme mekanizmaları anlamak için, biz retina sinir ağı işlevlerini araştırmak. Ağda Retinal nöronlar çok sayıda alt-tiplerinin içermektedir. Bipolar hücreler, ganglion hücrelerinin ve amacrine hücrelerinin fazla 10 alt tipi morfolojik çalışmalarla tespit edilmiştir. Retina nöronlarının birden fazla alt tipleri, hareket ve renk, görsel sinyal belirgin özellikler, kodlayan ve birden çok sinir yolları oluşturmak üzere düşünülmektedir. Bununla birlikte, görsel sinyal işleme her bir nöronun fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılmış değildir. yama kelepçe yöntemi bu temel soruyu ele almak yararlıdır. Burada, bir protokol sağlanır koyu adapte koşullarda yama kelepçe kayıtları kullanarak fare retina nöronlar ışık uyarılmış sinaptik yanıtları kaydetmek için. Fare gözler O / N koyu adapte olup, retina dilim hazırlıkları kızılötesi aydınlatma ve izleyiciler kullanarak karanlık bir odada disseke edilir. Kızılötesi ışık yokFare fotoreseptörleri etkinleştirmek ve böylece ışık yanıt korur. Patch kelepçe retina nöronlar ışık uyarılmış yanıtları kaydetmek için kullanılır. Bir floresan boya nöronal morfolojik alt tipleri karakterize etmek kayıtları sırasında enjekte edilir. Bu prosedür, fare retinanın her nöronun fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bize sağlar.

Giriş

Retina, sinir sisteminin benzersiz parçalarından biridir. Beynin erişilebilir bir parçası olarak, sinaptik mimarisi iyi karakterize edilmiştir. Ek olarak, bu sinir ağının işlevleri fizyolojik bir uyaranla incelenebilir: ışık. Retina dokusu karanlık bir odada uygun işlemlerle izole edilirse, dokudaki nöronlar ışığa yanıt verecektir. Bu hazırlık, görsel sinyal işlemeyi incelemek ve çeşitli sinaptik mekanizmaları ve sinir ağı fonksiyonlarını ve ayrıca hastalık mekanizmalarını aydınlatmak için kullanılmıştır.

Retinal nöronlardaki ışık tepkileri onlarca yıldır kaydedilmiştir. İlk çalışmalar, çamur yavrusu retinal nöronlarından hücre içi kayıtlar yapmak için keskin elektrotlar kullandı¹. 1980'lerde, yama kelepçesi tekniği icat edildi² ve kısa sürede görme araştırmacıları arasında popüler bir yöntem haline geldi^3,4. Çamur yavrusu ve balık retinal nöronları da dahil olmak üzere daha düşük omurgalılardan alınan tek hücreli kayıtlar, görsel sinyal işleme mekanizmalarının aydınlatılmasına katkıda bulunan popüler yöntemlerdi^5,6.

Genetik mutasyon teknikleri geliştirildikten sonra, fare retinası görme araştırmacıları için daha popüler bir model haline geldi^7-9. Memeli retinası, evrimsel olarak insan retinasına daha yakın olduğu için düşük omurgalılardan daha çekicidir ve hastalık modellerini kullanma fırsatı vardır. Bununla birlikte, fare retina hücreleri küçük ve kırılgandır¹⁰ ve karanlık bir odada retina hazırlıkları yapmak ve yama kelepçe kayıtları yapmak zordur. Teknoloji geliştikçe, görüntüleme çalışmaları¹¹ ve elektroretinogram (ERG)¹² gibi görsel sinyalleme mekanizmalarını incelemek için çeşitli yaklaşımlar mevcut hale geldi. Bununla birlikte, yama klemp yöntemi ile tek hücre kaydı, diğer yöntemlere göre zamansal ve mekansal olarak oldukça hassas olduğu için hala önemlidir. Bu nedenle, fare retinal dilim preparatlarında^(13-15) görsel sinyal işlemeyi araştırmak için sürekli olarak yama kelepçesi kayıtları gerçekleştirdik ve yöntemlerimizi geliştirdik.

Bu video eğitiminde, protokoller önemli ipuçlarıyla birlikte sunulmaktadır. İyi kayıtlar ancak iyi bir hazırlık ile elde edilebilir. Hayvan diseksiyonu yapmak ve sağlam bir yama kelepçesi teçhizatı oluşturmak, çoğu araştırmacının başarılı kayıtlar elde etmesini sağlayacaktır.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Deneysel Çözüm 1. Hazırlık

1. Gerçek deneyden önce diseksiyon çözeltisini 1 gün hafta 1 hazırlayın. Çünkü düşük sıcaklıklarda ¹⁶ de güçlü tamponlama yeteneği retina diseksiyon için bir HEPES tampon solüsyonu kullanın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırın: 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 _CaCl2, 1.0 _MgCl2, 10 HEPES, 28 glikoz ihtiva eder. NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın. 1 hafta buzdolabı yukarı çözümü tutun.
2. kayıt solüsyonu retina preparasyonlar ¹⁷ için tasarlanmış yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) 'dir Ames aracı. Deney günü olarak, bir tüp içinde Ames tozu (500 ml çözelti için 4.4 g) tartılır. Ayrıca, NaHCO ₃ (500 ml çözelti için 0.95 g) tartmak ve A ile karıştırınMES'in toz.
3. Deney günü ile yama kelepçe kayıtları için hücre içi pipet çözüm hazırlayın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırma: 111, K-glukonat, 1.0 _CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 _MgCl2, 5 ATP, Mg ve 1,0 GTP Na. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Geleneksel şırınga filtresi ile pipet çözüm Filtre. ~ 500 ul hacimde yapın ve bir dondurucu veya derin dondurucuda saklayabilirsiniz.

Deney Günü 2. Hazırlık

1. O / N karanlık adaptasyonu için karanlık bir alanda - (erkek, 8 haftalık 4, C57BL / 6J veya benzeri bir arka plan) gece deneyden önce, bir kafes içinde bir fare koyun.
2. Diseksiyon için hazırlık:
   1. En az 10 dakika süreyle oksijen ile, bir cam beher içinde - (200 mi, 100), buz üzerine yerleştirin ve kabarcık çözeltisi kesme doldurun.
   2. Retina hazırlık depolama için karanlık kutu oksijenasyonu başlatın.
   3. Yeniden gres için raylar ile plastik lamelleri hazırlayınintestinal dilim preparasyonlar 35 mm plastik tabak, her biri koyun.
   4. Bir helikopter (doku dilimleme makinesi) yeni bir jilet takın.
   5. Iki eşit parçaya, bir filtre membranı kesin. Bu retina dilimleme içindir.
   6. Mikroskop yakın diseksiyon araçları ve transfer pipet hizalayın. Her aracı kolayca karanlıkta erişilebilir, böylece çalışma alanı iyi organize edilmelidir.
3. Yama kelepçe kayıtları için hazırlık:
   1. Ames tozu ve damıtılmış su içinde NaHCO ₃ (Ames 4.4 g NaHCO ₃ 0.95 g / 500 mi GKD ₂ O) içinde çözülür. Karışık oksijen ile kabarcık Ames ortamı (% 95 _O2 ve% 5 _CO2), en azından 30 dakika için ise bir kayıt sıcaklık seviyesine ısıtma (~ 35 ° C). Hala köpüren ise _NaHCO3 ile 7.4 pH ayarlayın.
   2. Diseksiyon sırasında iç pipet çözüm çözülme. Çözündürüldükten sonra, hücre içi boyama için,% 0.01 sülforhodamin B ekleyin.

3. Retina Diseksiyon

1. Karanlık bir odada, karbon dioksit ve bilateral pnömotoraks kullanarak fare euthanize. 2 Sonra - karbondioksit kullanarak 3 dakika, fare bilincini kaybeder.
2. Fare artık kuyruk-çimdiği yanıt zaman hızlı bir şekilde gözler enükleasyonu ve bir plastik tabak soğuk kesme çözeltisi içine yerleştirin. Hayvanın ölümü sağlamak için ikili pnömotoraks gerçekleştirin. Hızla karanlık kutuya çanak göz saklayın. Karanlıkta prosedürü yürütmek için bir kızılötesi görüntüleyicisi kullanın.
   Not: Alternatif olarak, izofluran, dekapitasyon veya servikal dislokasyon ötenazi için kullanılabilir. ötenazi yöntemi Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallara uymalıdır.
3. Karanlık bir odada, diseksiyon mikroskobu ve kızılötesi aydınlatma ayarlayın. Mikroskop altında, 10 cm plastik tabak w içine çanak göz aktarınsoğutulmuş kesme solüsyon i. Sürekli boru içinden kabarcık oksijen plastik tabak altına yerleştirdi. Çok düşük değil yani akış sesini ayarlayın, ancak diseksiyon rahatsız kadar yüksek olmadığından emin olun.
4. Kornea ve lens temizleme:
   1. Bir mikro-cerrahi bıçakla kornea üstünde bir kesi yapmak. Göz küresinin diğer ucunda optik sinir tutarak hareket gözü engeller. Cerrahi bir makas kullanarak kesim uzatın. Etrafında bazı sklera ile kornea kesin.
   2. Ince forseps ile objektif tut ve yavaşça lensi çekin. Vitreus lens çıkarmak için çok yapışkan ise, bir makas ile vitreus kesti.
   3. Göz-fincan yapıldıktan sonra, yavaşça küçük bir transfer pipet ile Göz yuvası içine soğuk, oksijenli kesme çözümü dökün.
      NOT: Bir kesi korneada yapıldıktan sonra gözün çabuk söner. Bu pro sırasında göz deforme gibi göz şeklini korumak için önemlidirketencik retinaya zarar ve retina dekolmanı neden olacaktır.
5. Retinanın dorsal ve ventral tarafı belirlenmesi:
   Not: yeşil ve morötesi (UV) düzensiz bir dağılım özel retina alanı belirleme ¹⁸ koniler için hafif tepki kayıtlar için önemlidir.
   1. Optik sinir başı yakınında geçen retina göz fincan karşısına gidiyor çizgi belirleyin. Bu hat, çoğunlukla optik sinirin ventral tarafında boyunca geçer; Diğer ¹⁹ ventral ise optik sinir dahil yan, sırt tarafı. Kızılötesi izleyiciler altında açıkça bu dönüm bakın.
   2. Deney amacına bağlı olarak, gereksiz tarafında bir kesim yapmak. Bu göz fincan retina izole sonra yararlı olacaktır.
6. Camsı kaldırma:
   1. İsteğe bağlı olarak, 15 dakika için hiyaluronidaz (0.5 mg / ml) ile göz fincan inkübe edilir.
   2. Ekstra ince forseps ile vitrözü çıkarın. vitreus esasalt ve göz bardağın dış kenarına eklenerek. Yavaşça dokunmadan veya retina alay etmeden çıkarın. Vitreus sıkıca Göz yuvası takılı olabilir gibi, göz fincan retina dekolmanı önlemek için yavaşça çıkarın. Hiçbir gerginlik hissedilir kadar çekmeye devam edin.
      Not: Bu adım fare retinasına kesme için özellikle önemlidir; Bununla birlikte, bu tür sıçan veya salamanderin gibi diğer türlerin retinalarında için bir sorun değildir.
7. Göz-fincan retina izole edin. Sklera tut ve yavaşça forseps ters kullanılarak retina soyulabilir.
   NOT: retina hazırlıkları Tüm montaj izole retina yapılabilir. Kenarlarda 3-4 kesim yapmak ve retina düzleştirmek ya da birkaç parçaya kesilmiş retina.
8. Retina Trim ve retinanın gereksiz yarısını atın (3.5 adım). Aynı plastik tabak, iki parçaya kalan retina kesti. Retinanın her parça için, bir yapmak için kenarları kesilmişretina döşeme ve katlama kenarları kırpın.
9. Büyük bir transfer pipeti (~ 2 mL) kullanılarak bir cam plaka üzerine bir retina levha aktarın. Küçük bir pipet ile aşırı çözümü Suck slab düzleştirmek için filtre kağıt parçası kullanın ve ardından hızla doku üstünde filtre membran bir parça koyun.
   1. Küçük bir transfer pipet kullanarak, filtre zarı üzerinde çözüm diseksiyon bir damla yerleştirin. Çözelti zarın yayılır kadar ~ 15 saniye bekleyin. Bu süre zarfında, retina dokusu filtre zarı sopa olacak.
   2. Altında ve filtre etrafında daha soğuk diseksiyon çözüm dökün. Filtre membran ile retina dokusu yüzer. Bir forseps ile filtre membran tut ve dilimleme odasına yerleştirin. Doku üzerinde çözüm diseksiyon dökün ve karanlık kutuya hazırlık saklayın.
      NOT: Burada anlatılan prosedür önemlidir. Bu sağlamak için hızlı bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için önemli olduğunu filtre hafızasına retina dokusu sopabran ve kurumaz.
10. Bir helikopter kullanarak, dilimler halinde retina dokusu kesti. Yaklaşık 200 mikron kalınlığında yama kelepçe çalışmaları için uygundur.
11. Dilimleme odasında gres raylar ile bir plastik lamel yerleştirin. Plastik lamel gres rayların üstünde bir retina dilim aktarın. Enine bölüm görünür şekilde dilim 90 ° döndürün. Daha sonra, lamel üzerine aşağı filtre membranı basın yağ ile filtre kağıdı tarafı kapsamaktadır.
    1. Dilim plastik lamel üzerinde hareketsiz sonra, lamel kapmak ve 35 mm plastik tabak aktarmak. Retina hazırlık üzerine soğuk diseksiyon çözüm dökün ve hazırlık daldırın. Sürekli oksijenli gereken karanlık kutunun her yemeğin, saklayın.
       NOT: Tüm prosedür filtre membran deforme etmeyecek şekilde dikkatli yapılması gerekiyor. Aksi takdirde, retina dilim kolayca filtre zarından ayrılır.

4. Retina Dilim Hazırlık Patch Kelepçe Kayıtlar

1. Hazırlık Kayıt:
   1. Ames 'orta ile Başbakan perfüzyon tüpleri. Boru doldururken tüm kabarcıklar geçmesine izin verin.
   2. Bir çektirmesi ile yama kelepçe kayıt pipetler olun. Pipet backfilled kadar 1 dakika boyunca bir pipet arka pipet çözeltisi, daldırma ile bir pipet doldurmak için. Sonraki, bir mikro-pipet dolgu kullanılarak pipet ~ 1/3 'doldurunuz. Nemli pipet kutusu, her pipet saklayın.
   3. Yama kelepçe kayıtları için ekipman açın; bilgisayar, amplifikatör, CCD kamera, mikroskop ve dahil.
2. Oda ışığı kapatın. Kızılötesi görüntüleyici kullanarak mikroskop sahne odasının üzerine bir retina dilim hazırlık yerleştirin. Bu hareketsiz kılındıktan sonra, sürekli perfüzyon başlar. 33-37 ° C'de perfüzyon sıcaklığını ayarlayın.
3. CCD kamera ile dilim yüzeyini görüntüleyin. Hedef yere odaklanın nerede hedef cell türleri bulunur. Yama kelepçe kayıt için sağlıklı görünümlü hücreyi seçin (örneğin, pürüzsüz görünümlü yüzey ve iyi bir hücre şekli olmalıdır).
4. Bir pipet tutucu bir kayıt pipet yerleştirin. Dilim hazırlık pipet Advance. Bu dilim hazırlama (~ yukarıdaki 2 mm) yakın olduğunda, mikroskop ile pipet ucu bulabilirsiniz. Pipet ucu mikroskop altında görülebilir sonra, hedef hücreye doğru ucu aşağı hareket ettirin.
5. Amplifikatör ayarlayın. (Sıfırlama) 0 mV / 0 pA de pipet ayarlayın ve 10 Hz ~ En ~ 5 mV sürekli elektrik darbe başlar. Pipet direnci kontrol edin; İdeal direnç çoğu retina nöronlar için 5 ila 10 MΩ olduğunu.
6. Ucundan dışarı üfleme başlayın. Bir ağızlık kullanın, ya da pipet banyo çözeltisi içine dips zaman pozitif basınç uygulamak için, bir şırınga kullanın. Ucu hedef hücrenin yüzeyinde kadar sürekli iç çözüm darbe.
   1. Pozitif basınç th küçük bir çukur yaptığındae hücre yüzeyi, biraz ucu ilerlemek ve üfleme durdurun. Artmalıdır pipet direnci, kontrol edin. Sürekli artıyorsa, bırakın ve> 1 GΩ (gigaseal) ulaşıncaya kadar direnç izlemek. Direnç kendiliğinden artmaz ise bir gigaseal olana kadar, yavaşça negatif basınç uygulayın.
7. Gigaseal gerçekleştirildikten sonra mV -70 için tutma potansiyeline değişir. Sonra, aralıklı pipet içindeki membran rüptürü negatif basınç uygulayın. Tam hücre konfigürasyonu yapıldığında, pipet direnci 500 MΩ ve 1 GΩ ve kapasitif akım görülmektedir arasında olabilir. Bazen spontan postsinaptik akımlar görülebilir.
8. -80 Den +40 mV IV ilişkisini kaydedin. Voltaj kapılı kanallar farklı tipte hücre tipine bağlı olarak aktive edilir.
9. Tutanak sinaptik akımları ya da gerilimleri ışık uyarılmış.

Sonuçlar

Bir temsilci dilim dilim hazırlama hazırlama düz bir yüzeye ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri gösteren, düz konumda. Şekil 1'de gösterildiği ve filtre kağıdı hiçbir dekolmanı olduğu. Bir dilim hareket ettirildiğinde ise, hazırlık sadece bir parçası zor yama sıkma için uygun bir hücreyi tanımlamak için yapar, odak olduğunu. Kayıtları için, genellikle parlak yüzeye sahip iyi bir soma, bir hatta yuvarlak şekil ve görünür hiçbir karanlık plaklar seçmek önemlidir. Bütün hücre konfigürasyonu yapılmış son...

Tartışma

İyi kayıtlar ancak iyi retina preparatları ve iyi tasarlanmış yama klemp kurulumları ile elde edilebilir. Yukarıda açıklanan tüm adımlar önemli olsa da, tartışma hem diseksiyon hem de kayıtlar için bazı kritik adımları vurgulamaktadır.

Diseksiyon için iki şey özellikle önemlidir: soğutma ve oksijenasyon. Gözü enükleasyona tabi tuttuktan sonra, gözün ön kısmını oksijen kabarcıklı, soğutulmuş diseksiyon solüsyonu içeren bir diseksiyon odasında hızla çıkarın ve soğuk solüsyonu göz kabına dökün. ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fareler (28-60 günlük, erkek)	Jackson laboratuvarı	C57BL/6J suşu
Ames'in orta tozu	Sigma	A1420	mükemmel
Stereo mikroskop	Nikon	SMZ745	mükemmel
Diseksiyon aleti: forseps	Dumont	# 4, # 5, # 55	mükemmel
Diseksiyon aracı: makas	Roboz	RS-5605	mükemmel
Diseksiyon aleti: ameliyat bıçağı	Surgistar	7514	mükemmel
Tıraş bıçağı (doğrayıcı için)	EMS	71970	mükemmel
Doğrayıcı	el yapımı
Kızılötesi görüntüleyici	Gece Kuşu Optik	NOBG1	Parlak görüntü gösterir. Küçük nesnelere odaklanmak bir sorundur.
Çektirme	Sutter	P-1000	mükemmel; tutarlı boyutta pipetler yapar.
Karanlık kutu	Pelikan	karanlık kutu	mükemmel
Yama kelepçe sistemi	Scientifica	dilim kapsamı 2000	Mükemmel kurulum. Çoğu temel bileşen tek bir pakete dahil edilmiştir. Mikromanipülatörler mükemmeldir.
Amplifikatör	Moleküler Cihazlar	multiclamp 700B	Mükemmel ve kolay kontrol.
Yazılım edinme	Moleküler Cihazlar	pClamp yazılımı	Mükemmel ve kolay kontrol.
Işık kaynağı (LED)	Soğuk LED	pE-2 4 kanallı sistem	Mükemmel
CCD kamera	Q-görüntüleme	Retiga 2000	Mükemmel
Faraday kafesi	el yapımı