Yöntem makalesi

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 Şubat 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzenlenmiş protein yıkımı hemen hemen her hücresel fonksiyon için çok önemlidir. Moleküler mekanizmaları ve ökaryotik protein yıkımı için genetik gereksinimleri hakkında bildiklerimizin çoğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae kurulmuştur. Protein yıkımı Klasik analizleri biyokimyasal darbe-kovalamaca ve sikloheksimid-kovalamaca metodolojileri yararlanmıştır. Bu teknikler, protein degradasyonunu gözlemlemek için duyarlı araçlar sağlarken, zahmetli, zaman alıcı ve düşük verimlilik bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar, protein bozulmasını önlemek mutasyonlar için hızlı veya büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Burada, protein parçalanması için genetik gereksinimleri kolay tanımlama için bir maya gelişimi tabanlı deney tarif edilecektir. Bu testte, özgül seçici koşullar altında büyüme için gerekli bir raportör enzim kararsız bir proteine ​​kaynaştırılır. Hücreler, endojen raportör enzim eksik olan fakat füzyon proteini sele altında büyüyebilir ifadeFüzyon proteini stabilize yalnızca ktif koşulları (örneğin, protein yıkımı uyuşmazlık olduğunda). Burada tarif edilen büyüme deneyinde, vahşi tipten ve bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmid mutant maya hücreleri seri seyreltme seçici ve seçici olmayan ortam üzerine tespit edilir. Seçici koşullar altında büyüme, belirli bir mutasyon ile bozunma bozukluğu ile tutarlıdır. Artan protein bolluğu biyokimyasal teyit edilmelidir. Elektroforez ve Western blot için müsait bir biçimde maya proteinleri hızlı bir şekilde çıkarılması için bir yöntem olup, aynı zamanda gösterilmiştir. Biyokimyasal analizi için protein çıkarılması için basit bir protokol ile birlikte protein istikrarı için bir büyüme temelli okuma, protein parçalanması için genetik gereksinimleri hızlı belirlenmesini kolaylaştırır. Bu teknikler, kısa ömürlü bir çok protein degradasyonunu izlemek için adapte edilebilir. Verilen örnekte, histidin biyosentezi için gerekli olan His3 enzim kaynaştırıldıbu anormal endoplazmik retikulum translokon yürütmektedir sonra Deg1 için -Sec62. Deg1 -Sec62 bozulması için hedeflenmiştir. Deg1 -Sec62-HIS3 barındıran hücreler proteini kararlı hale geldiğinde, seçici koşullar altında büyüyebilir mümkün.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seçici protein yıkımı ökaryotik yaşam için gerekli olduğunu ve değiştirilmiş protein yıkımı, çeşitli kanser tipleri, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve sistik fibrozis 1-5 dahil olmak üzere tıbbi koşullar, bir dizi katkıda bulunur. seçici protein degradasyonunu katalize ubikitin-proteazom sistemi (UPS), bu koşullar 6-10 için gelişmekte olan bir tedavi edici hedeftir. Ubikitin ligaz kovalent proteinler 11 76-amino asit ubikitinin polimerleri takın. Poliübikütin zincirleri ile işaretlenmiş proteinler tanınan ve ~ 2.5 megadalton 26S ile 12 proteazom proteolizlenmiş edilir. Model ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae (çiçek mayası) başlatılan çalışmalar ökaryotik hücrelerde protein yıkımı mekanizmaların açıklanması, temel olmuştur. UPS ilk gösterdi fizyolojik substrat MATα2 13 maya transkripsiyon represörü oldu, UPS 14 ve çok sayıda yüksek derecede korunmuş bileşenler ilk olarak tespit edilmiştir ya da (örneğin, 15-26), maya ile karakterize edilir. Bu çok yönlü ve genetik uysal model organizma yapılan Keşifler ubikuitin-aracılı bozulması korunmuş mekanizmaları önemli açılımlar sağlamaya devam etmesi muhtemeldir.

Çoğu UPS yüzeylerde tanınması ve yıkımı birden proteinlerin uyumlu eylem gerektirir. Bu nedenle, belirli bir kararsız proteinin düzenlenmiş bozulmasını karakterize önemli bir gol proteoliz genetik gereksinimlerini belirlemektir. Memeli ya da maya hücrelerinde protein degradasyonunu izlenmesi için klasik yaklaşımları (örneğin, darbe kovalayıcı ve sikloheksimid kovalayıcı deneyler, 27), zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Yöntem bu tür protein degradasyonunu tespit etmek için çok hassas bir araç temin ederken, protein parçalanması ya da büyük ölçekli bir screeni hızlı analizi için uygun değildirProtein bozulmasını önlemek mutasyonlar için ng. Burada, kararsız proteinlerin bozunması için genetik gereklerine hızlı tespit edilmesi için bir maya gelişimi bazlı analiz sunulmuştur.

Protein degradasyonunu, ilgi (ya da bozulma sinyali) kararsız bir protein analiz etmek için maya gelişimi dayalı yöntemde, belirli koşullar altında maya büyümesi için gerekli olan bir proteine, çerçeve içinde, birleştirilir. Sonuç ilgi kararsız proteinin protein yıkımı genetik gereksinimlerini belirlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir yapay substrat. Uygun bir şekilde, en sık kullanılan laboratuar maya cinsleri, özellikle amino asitler ya da azotlu bazların (örneğin, 20,28-30) biyosentezinde yer alan metabolik enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların bir panel barındırır. Bu enzimler, sentez enzimleri katılmak dışsal olarak sağlanan metabolitlerin yokluğunda hücre proliferasyonu için gereklidir. Böylekararsız proteinlerin bozunması için büyüme bazlı muhabir bağlı oldukları bağlı oldukları gibi metabolik enzimler ve böylece işlev görebilir. proteolizini engellemek mutasyonlar bozunma raportör barındıran hücreleri seçilen şartlar altında büyümeye izin verir çünkü protein yıkımı için genetik olarak gerekli gördükleri kolaylıkla açıklanacaktır edilebilir.

Bir büyüme avantajı, belirli bir mutasyon ve ilgilenilen protein bolluğu arttırır dolaylı bir göstergesidir. Ancak, doğrudan biyokimyasal analiz mutasyon oldukça dolaylı ya da suni nedenler yoluyla daha artmış protein düzeyleri ile büyümeyi izin onaylamak için gereklidir. Protein miktarı hakkında bir mutasyonun etkisi yapabilecek ve özellikle mutasyonu olmayan hücrelerde kararlı durum proteini düzeylerinin Western blot analizleri ile teyit edilebilir. Uygun bir biçimde maya proteinleri hızlı ve etkili bir ekstraksiyon (sodyum hidroksit ve numune tampon maddesi ile maya hücrelerinin sıralı inkübasyonu) için bir yöntem olupwestern blotting ile analiz için de 31 gösterilmektedir. Birlikte, bu deneyler, protein yıkımı aday düzenleyicilerinin hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein Bozulması Arızalı Aday Mutantlarına tanımak 1. Maya Büyüme Deneyi

  1. Bir raportör metabolik enzim, çerçeve içinde, erimiş kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek.
  2. Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan sentetik tanımlı (SD) minimal ortam 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  3. Her bir gece boyunca kültür, 600 nm'de (OD600) 'deki optik yoğunluk ölçülür.
    NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat en az bir OD 0.2 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir.
  4. Bir seyreltilmiş hücreleri ile başlayan, bir steril 96 oyuklu bir plaka içerisinde dönüştürülen maya hücrelerinin altı kat seri dilüsyonları hazırlanmasın, OD 0.2 600. 96 gözlü plaka içindeki farklı üst üste denenecek her biri maya transformant yerleştirin.
    1. Her bir transformant için, 200 ul nihai hacim içinde 0.2 OD 600 hücreleri sulandırmak için gerekli olan bir gece boyunca kültür hacmi hesaplamak. 200 ul hacmi getirmek için steril su içinde uygun miktarda Sütun 1'de de karşılık gelen, gece boyunca bu kültür hacim.
    2. Maya her satır için, Sütun 2, 3 ve 4 kuyulara steril su, 125 ul ilave edin.
      Not: ayrı paketlenmiş steril 96-yuvalı plakalar, steril kapaklar ile paketlenebilir. Kapaklar bu adımda dağıtılır, steril su için rezervuar olarak kullanılabilmektedir. Bu çok kanallı bir pipet ile belirli bir sütunda tüm oyuklara steril su eşzamanlı transferi sağlar.
    3. Yukarı pipetleme ve bir çok kanallı pipet aşağı ilk sütuna (OD 0.2 600 seyreltilmiş maya) içeriğini karıştırın.
    4. TransfBir çok kanallı pipet kullanarak sütun 2 Sütun 1 maya 25 ul, er. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Aktarım Sütun 3 Sütun 2 25 ul ve sütun 3 den Sütun 4 25 ul (her adımda iyi karıştırma).
  5. Bir çok kanallı pipet ile her bir örnek karıştırın. En seyreltilmiş hareketle en uygun seçici ortamı içeren iki plakalar üzerine maya, pipet, her numunenin 4 ul sütunları sulandırmak için. Plazmid seçimi (bu plaka maya lekelenme ve büyüme kontrolü olarak hizmet vermektedir) korur ortamı ile bir tabak kullanın. Raportör enzime bağlı kararsız protein plazmid muhafaza ve ekspresyonu için seçim ortamı ile bir ikinci plaka kullanın. Maya hızla yerleşmek için, düzenli aralıklarla yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın.
    Not: Kurutucu plakalar daha kolay bir şekilde taze hazırlanmış plakalar daha sıvı absorbe edecek ve bu nedenle, bu deneyler için tavsiye edilir. Nemli plakalar lo oda sıcaklığında kuluçkalama ile kurutulabilirbir laminar akış başlığı içinde 2 gün ya da daha kısa bir inkubasyon - 1 ağırlık nem. Laminar hava akımı tezgah paralel ise Tabaklar dengesiz kuruyabilir. Bir şablonun kullanımı kolay düzenli mesafelerde maya hücreleri görmenizi sağlar. İki örnek şablonlar, Şekil 1 'de verilmiştir. Bu, baskılı üzerinden kesilir ve bir Petri kabı, kapağın iç tarafında olabilir.
  6. Plakalar tezgah üstünde kurumaya bırakın.
  7. 6 gün - 2, 30 ° C'de inkübe edin.
  8. İnkübasyondan sonra, her plaka fotoğraf.

figure-protocol-1
100 mm agar plakaları üzerine maya hücreleri tespit için Şekil 1 şablonlar. Bu şablonlar, çok kanallı bir pipet ile düzenli aralıklarda maya tespit kolaylaştırmak için kullanılabilir. Şablonlar, baskılı kesip, ve bir Petri kabı kapağının içine yapıştırılmış olabilir. Büyüme ile Petri kabı yerleştirinşablon orta kapağının iç kısmına yapıştırılmıştır. Şablonlar yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiştir. Bu büyüme deneylerinde kullanılan plakalar Benzer yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiş olması tavsiye edilir. Dört (A) veya beş (B) maya hücrelerinin seri seyreltme sağlanır tespit için şablonlar. 100 mm şablonları ile bu rakamın bir yazdırılabilir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Maya Büyüme Testi 2. Biyokimyasal Onayı

  1. Maya Hücreleri ve Post-Alkali Protein Ekstraksiyon Büyüme (31 değiştirilmiş)
    1. Kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek.
    2. Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan SD ortamı 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    3. Her gecede cu OD 600 ölçünlture.
      NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat 0.2 10 ml taze seçici ortam (aşama 2.1.4) OD 600 seyreltme izin verecek bir OD 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir.
    4. 0.2 10 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücreleri seyreltin.
    5. Kültürler (orta-logaritmik büyüme olan yani) 0.8 ve 1.2 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar, döner veya çalkalama, 30 ° C'de kuluçkalayın devam edin.
      Not: İlgili kararsız proteini, bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında ise, protein ifadesi ve hücre hasat indüksiyonu için en uygun zamanlama önceki çalışmalarda ya da deneysel gözlemlere göre değişebilir.
    6. 15-ml'lik konik kültür 2.5 OD 600 birimleri toplayınOda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile ark tüpü. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
      Not: 600 birim 1.0 OD 600 kültürün 1 ml maya mevcut miktarı olarak tanımlanır bir OD. V = 2.5 OD 600 birim / Ölçülen OD 600: 2.5 OD 600 birim (V) hasat için gereklidir (ml) kültür hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir
    7. 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri distile su. Bir mikrosantrifüj tüp askıya hücreleri aktarın.
    8. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
    9. 100 ul süspanse hücreleri aşağı veya yukarı vorteksleme pipetleme tarafından damıtılmış su ve 100 ul 0.2 M NaOH ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
    10. 18.000 x santrifüj (henüz proteinleri serbest ve hala canlı olan değil çoğu) Pelet hücreleri5 dakika boyunca örn. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
    11. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks ile, hücreleri lize olacak 100 ul 1x Laemmli numune tamponu, - 50 süspanse pelet.
      Not: santrifüj ve Laemmli numune tampon maddesi içinde hücrelerin daha sonra yeniden süspansiyonu aşağıdaki alkali yüzer uzaklaştırılması bir Tris-glisin çalışan tamponu sistemi ve Batı lekeleme ile sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir pH'da proteinleri ayıklar.
    12. Tam proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C 'de lizatları inkübe edin.
      Not: 95 ° C de inkübe toplama eğilimli proteinler (çok sayıda zar-ötesi bölümler ile, örneğin proteinler) çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, Lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C), 10 - 30 dakika sonra gibi ampirik proteinlerin analizi için, tespit edilmiştir.
    13. 5 dakika buz üzerine koyarak serin lizatları.
    14. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 18,000 x g'de santrifüjleyin lizatları çözünmeyen malzeme peletlendi. Önce, sonra Western blot analizi (kısım 2.2) SDS-PAGE ile süpernatant (çözünmüş ekstre protein), ayırın. Alternatif olarak, -20 ° C'de mağaza lizatları.
  2. Örnek Western Blot Protokolü
    1. Bir SDS-PAGE jeli içinde lizatlarının ampirik bir biçimde tespit hacmi yükleyin.
    2. Boya ön kadar 200 V jel çalıştırın jel alt ulaşmıştır.
    3. 4 ° C'de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florür (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın.
    4. 4 ° C 'de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 1 saat süre ile, sallanan ya Tris-tamponlu Tuzlu su (TBS) içinde% 5 yağsız süt içinde inkübe edilerek blok membran.
    5. Çözüm engelleme Durusu.
    6. Oda sıcaklığına 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ile TBS içinde% 1 yağsız süt içinde (ya da bunların epitop) başta ilgi konusu olan proteini için spesifik bir antikor ile membran inkübemperature, sallanan.
    7. Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
    8. Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
      Not: flüoroforlar ışığa duyarlı olduğu için, florofor konjuge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmalıdır. Buna ek olarak, florofor-konjuge antikor varlığında membran inkübasyon ışık geçirmeyen kaplarda gerçekleşmelidir. Bu alüminyum folyo ile inkübasyon tepsiler sarılarak yapılabilir.
    9. Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
    10. Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde.
    11. Membran görüntüleme sonra, bir yük için spesifik bir primer antikor ile membran inkübesallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt kontrol proteini ing.
    12. Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
    13. Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
    14. Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
    15. Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem göstermek için, His3 enzim modeli endoplazmik retikulum (ER) enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde bozulması karboksi-terminaline kaynaştırılmış olduğu (ERAD) alt-tabaka, Deg1 -Sec62 (Şekil 2A) Deg1 -Sec62-HIS3 oluşturmak için (Şekil 3) . Deg1 -Sec62 translokon ile kalıcı, anormal bir ilişki aşağıdaki hedeflenen ERAD alt tabakalar yeni bir sınıfının kurucu elemanını temsil ER zar 32-34 arasında proteinlerin taşınması için esas olarak s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada yer alan yöntem hızlı bir şekilde belirlenmesi ve maya hücrelerinde protein yıkımı genetik gereklerine biyokimyasal onay sağlar. Bu deneyler () (örn 41-44, taşıma, depolama ve maya hücreleri manipüle etmek için protokollerin maya biyoloji birkaç mükemmel değerlendirmeleri ve derlemeler organizmaya yeni müfettişler için mevcuttur) programı ve güç maya modeli ökaryotik organizma olarak vurgulayın. teknikler kolayca protein sınıflarının birçok degradasyonunu ve bolluk araştırmak için uygulanabili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bir destekleyici ve coşkulu bir araştırma ortamı sağlamak için Rubenstein laboratuar mevcut ve eski üyeleri teşekkür ederiz. Biz protokol optimizasyonu konusunda yardım almak için Ryan T. Gibson teşekkür ederim. Biz maya suşları ve plazmidler Mark Hochstrasser (Yale Üniversitesi) ve Dieter Kurt (Universität Stuttgart) teşekkür ederim. Biz bu yazının netlik ve programı geliştirmeye yardım ettikleri için anonim yorumcular teşekkür ederiz. Bu çalışma SGW'den Sigma Xi Ball State Üniversitesi bölümünden bir araştırma ödülü tarafından desteklenen, Ball State Üniversitesi Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (R15 GM111713) EMR için, EMR bir Ball State Üniversitesi aspire araştırma ödülü ve fonlar Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İstenen maya suşları, plazmitler, standart ortam ve tampon bileşenleriİstenilen mutasyonlara sahip maya suşları araştırmacının laboratuvarında oluşturulabilir. Yabani tip maya ve çeşitli mutantlar da ticari olarak temin edilebilir (örneğin GE Healthcare'den). Füzyon proteinlerini kodlayan plazmitler, araştırmacının laboratuvarında üretilebilir.
3-amino-1 H < / em>-1,2,4-triazolFisher ScientificAC264571000His3 enziminin rekabetçi inhibitörü. His3 raportör yapılarını kullanarak büyüme testinin sıkılığını artırmak için ortama dahil edilebilir.
Endoglikosidaz H (Streptomyces plicatus)Roche11088726001proteinlerin N-glikosilasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir; 1x Laemmli numune tamponunda bulunan SDS ve beta-merkaptoetanol konsantrasyonları ile uyumludur.
Tek kullanımlık borosilikat cam tüplerFisher Scientific14-961-32Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
Sıcaklık ayarlı inkübatör (örn. Heratherm İnkübatör Modeli IMH180)Dot Scientific51028068Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
New Brunswick 18 mm tüpler için değiştirilebilir tambur (tüp silindiri)New BrunswickM1053-0450Maya hücrelerinin gece boyunca maya başlatıcı kültürlerini süspansiyonda tutmak için tüp silindiri önerilir. Daha büyük kültürleri süspansiyonda tutmak için bir platform çalkalayıcı veya tüp silindiri kullanılabilir.
New Brunswick TC-7 Makaralı Tambur 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Tüp silindiri ile kullanım için
SmartSpec Plus SpektrofotometreBio-Rad170-2525Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
Steril 96 oyuklu düz tabanlı mikrotest plakaları, ayrı ayrı sarılmış kapaklıSarstedt82.1581.001Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; lGilsonF14401Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
 
 
 

 
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403Tek kanallı ve çok kanallı pipetleyiciler protokolün çeşitli aşamalarında kullanılır. Çok kanallı pipetleyiciler pipetleme yükünü birkaç adımda azaltırken, tek kanallı pipetleyiciler tüm protokol boyunca kullanılabilir. Çeşitli üreticilerden temin edilebilir.
Santrifüj 5430Eppendorf5427 000.216Ünite ile birlikte satılan rotor, 1.5 ve 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerini tutar. Rotor, 15 ml ve 50 ml konik tüpleri tutan bir rotorla değiştirilebilir.
Plaka görüntüleme sistemi (örn. Jel Doc XR+ Sistemi)Bio-Rad170-8195Plakaları görüntülemek için gelişmiş görüntüleme sistemleri, bilgisayar tarayıcıları ve kameralı telefonlar dahil olmak üzere çeşitli sistemler kullanılabilir.
Sabit Açılı Rotor F-35-6-30, Santrifüj için Kapaklı ve Adaptörlü Model 5430/R, 15/50 ml Konik Tüpler, 6'lıEppendorfF-35-6-30
15 ml serigrafi baskılı vidalı kapaklı tüp 17 x 20 mm konik, polipropilenSarstedt62.554.205Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
1,5 ml esnek tüp, PCR temiz, Doğal mikrosantrifüj tüpleriEppendorf22364120Çeşitli üreticiler
Analog Dri-Banyo IsıtıcıFisher Scientific1172011AQSıcak plakalı kaynar su banyosu, proteinleri denatüre etmek için de kullanılabilir
SDS-PAGE çalıştırma ve aktarma aparatları, güç kaynakları ve görüntüleme ekipmanları veya SDS-PAGE için karanlık odalar ve membranaLaboratuvara ve uygulamaya
göre değişecektirWestern blot görüntüleme sistemi (örn Li-Cor Odyssey CLx tarayıcı ve Image Studio Yazılımı)Li-Cor9140-01Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir
EMD Millipore İmmobilon PVDF Transfer MembranlarıFisher ScientificIPFL00010Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir
Birincil antikorlar (örn. Fosfogliserat Kinaz (Pgk1) Monoklonal antikor, fare (klon 22C5D8))Yaşam Teknolojileri459250Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir
İkincil antikorlar (örn. Alexa-Fluor 680 Tavşan Anti-Fare IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Laboratuvara ve uygulamaya göre değişiklik gösterir
aktarım

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maya B y me DeneyiF zyon ProteiniSe ici BesiyeriProtein EkstraksiyonuWestern Blot AnaliziSeri Dil syonUbikvitin LigazKarars z Protein

İlgili makaleler