Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Özet

Kanser hücresi proteomlarının derinlemesine analizleri, yeni ilaç hedeflerinin ve tanısal biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Sıvı ve katı tümörlerden türetilen kanser hücresi alt popülasyonlarındaki (fosfo-) proteomların kantitatif analizi için deneysel bir iş akışı açıklıyoruz. Bu, hücresel zenginleştirme stratejilerinin kantitatif Super-SILAC tabanlı kütle spektrometresi ile birleştirilmesiyle elde edilir.

Özet

Derinlemesine kanser hücresi proteomların analizleri onkojenik patomekanizmaların aydınlatmak için, yanı sıra potansiyel ilaç hedefleri ve teşhis Biyobelirteçleri tanımlamak için gereklidir. Ancak, hasta kaynaklı tümörlerin ve özellikle hücresel alt popülasyonlar kantitatif proteomik karakterizasyonu için yöntemler büyük ölçüde eksiktir. Burada, sıvı ya da katı tümörler ya da elde edilen kanser hücresi alt-popülasyonlarının proteomların analiz edilmesine olanak sağlamıştır deneysel kurulum tarif eder. Bu biyoinformatik veri analizi ve ardından kantitatif Süper SILAC bazlı kütle spektrometresi ile hücresel zenginleştirme stratejileri birleştirerek elde edilir. FACS-sıralayarak ardından sitometri spesifik hücresel alt kümelerini zenginleştirmek için, sıvı tümörler ilk akış tarafından immunophenotyped edilir; katı tümörler için, lazer yakalama mikrodiseksiyon spesifik hücresel alt-popülasyonunu saflaştırmak için kullanılır. İkinci bir aşamada, bir protein, arıtılmış hücrelerinden ekstre edilir ve daha sonra bir tümör-spesifik birlikte,Protein miktarının sağlayan başak-standardı SILAC-etiketli. Elde edilen protein karışımının, jel elektroforezi ya da triptik sindirme ile ve ardından filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) 'ye tabi tutulmuştur. Son olarak, triptik peptidler bir melez quadrupole-Orbitrap kütle spektrometresi ile analiz edilir ve elde edilen veriler MaxQuant dahil biyoinformatik yazılım suit ile işlenir. 8000 proteine ​​kadar burada sunulan akışı aracılığı ile tespit edilebilir ve bir hastada elde edilen numunelerde ölçülmüştür ve elde edilen protein ekspresyon profilleri teşhis proteomik imza ya da potansiyel ilaç hedeflerini tanımlamak için hastalar arasında karşılaştırılabilir.

Giriş

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik ortaya çıkmıştır ve hücre biyolojisi ve translasyonel biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir disiplin şimdi. Binlerce proteinin tek bir kütle spektrometrik deney ^1,2 tespit edilebilir bu alandaki teknik ilerlemeler, hücre hatları ve hayvan modellerinde kompleks hücresel süreçlerin çalışma mümkün kılmıştır. Bu, genellikle bir değişiklik ^2,3 her türü için zenginleştirme ve veri analizi için sipariş akışlarını gerektirir, ancak benzer bir ilerleme, fosforilasyon ya da ubikitinasyon gibi birçok dönüşüm sonrası modifikasyonların analizi için yapılmıştır. Ayrıca, SILAC dahil olmak üzere kimyasal ve metabolik etiketleme stratejileri, katılımı, insan kanserinde ⁴ temel hücresel süreçler, tanı biyolojik belirteçler ve potansiyel ilaç hedefleri keşfi için bu yöntem özellikle çekici hale proteinlerin ve PTMS doğru nispi ölçümü sağlar.

Bununla birlikte,birçok karşı primer insan kanserlerinin ⁵ proteomik analizi ile ilgili aşılması gerekmektedir. Her şeyden önce, insan kanser örnekleri, genellikle bağışıklık sistemi hücreleri, fibroblastlar, tümör mikro-e ait çeşitli hücre tiplerinin varlığı nedeniyle hücresel heterojenlik yüksek derecesini göstermektedir. İkincisi, klonal evrim farklı fonksiyonel özelliklere sahip çeşitli hücresel alt popülasyonlar varlığına sonuçlanan, kendi tümörler içinde genetik çeşitliliğe yol açar. Kanser gelişimi ve ilerlemesi gibi (işlevsel son derece alakalı), hücresel alt popülasyonlar proteomik analizi ardındaki itici güçleri olan birkaç kanser kök hücrelerinin mevcut kavramına göre klinik uygulama için ilgili onkojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması için büyük önem olması bekleniyor ^6. Üçüncü olarak, yüksek numune miktarlarının setleri kantitatif protein ekspresyon profilleri, genellikle, güçlü bir klinik BIOMAR tanımlanması için gerekli olankers; dayanarak bu gibi hücre çoğalması ^4, -, - aynı şekilde uygulanamaz metabolik etiketleme stratejileri ise, bu, örneğin iTRAQ ⁷ gibi kimyasal etiketleme başarılamaz. Dördüncü olarak, en uygun bir katı tümör örnekleri formalinle sabitlenmiş, bağlı bir protein çapraz bağlarının ⁸ oluşumu için kütle spektrometrik analizi proteom zorlaştırmaktadır bulunmaktadır. Son olarak, en mevcut proteomik iş akışları zor klinik araştırmalar için ilgili örnek sayı analizi render örnek işleme ve veri toplama önemli miktarda gerektirir, ve yeni iş akışı çağrısında ^9,10 paradigmalar.

Bu engelleri gidermek için biz kapsamlı kitle spektrometresi analizi için küresel bir iç standart tanıtmak için bir süper-SILAC ¹⁴ strateji ile hücresel zenginleştirme için ¹¹ veya lazer yakalama mikrodiseksiyon ^12,13 sıralama ya akım-sitometrik hücre birleştiren bir deney düzeneği geliştirdi. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, sıvı ya da katı kanserler ya da elde edilen tek bir insan tümör örneklerinde 8000 proteine ​​kadar ölçmek mümkündür.

Protokol

İnsan doku ya da kan örnekleri üzerinde tüm deneyler etik oylamaya verilen yönergelere göre bir etik komitesi tarafından onaylanmış ve yapılmalıdır.

1. Hücresel Zenginleştirme

1. Sıvı tümörler / floresans ile aktive edilen hücre tasnif.
   1. Amonyum klorür kullanılarak eritrosit lizizi gerçekleştirerek veya Ficoll yoğunluk-gradyan santrifüjü ile, kemik iliği veya kan numunesinden mononükleer hücreleri izole edin.
      1. Eritrosit liziz için, amonyum klorür çözeltisi 4 ml ile numunenin 1 mL bir araya getirir. 10 dakika - 5 buz üzerinde çözelti inkübe edin. 400 x g'de 5 dakika 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz (PBS) +% 2 fetal dana serumu (FCS) ve santrifüj 40 ml ilave edilir.
      2. Ficoll gradyan santrifüj, katman 2 ayrı katmanları oluşturmak için Ficoll-Hypaque 15 ml üzerindeki numune 10 ml için (katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj - dikkatli bir şekilde (15 ila 25 ° C) ve mononükleer hasatinterfaz toplamak hücreler.
      3. Hücreleri aşağı Spin ve PBS +% 2 FCS onları sürebilir. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve 1 ml PBS +% 2 FCS ile kaplar. Negatif kontrol olarak bir kısım ve son leke kullanılan her bir floresan boya için, bir kısım al.
   2. 30 dakika boyunca buz üzerinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak seyreltme lösemik hücre popülasyonu izole etmek için yararlı bir floresan-etiketli antikorlar ile inkübe edin. Ayrıca her bir antikor ile tazminat için kullanılan alikotları leke. PBS +% 2 FCS ile iki kez yıkanır.
      Not: kullanılan antikorlar, CD117-PE (Klon 95C3), CD34-FITC (Klon 8G12) ve CD33-PE (Klon P67.6) karşı fare anti-insan edildi.
   3. 35 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri, hücre süzgecinden ile ideal kullanarak tüpler kap entegre.
   4. (Örneğin, 7-AAD) hücre canlılığı leke ekleyin. Bir hücre sıralayıcı ¹¹ (Şekil 2) kullanarak sıralar hücreleri. Isc'den hücreleri toplamak % 10 FCS içeren Ove'nin Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM).
2. Katı tümörler / Lazer yakalama mikrodiseksiyon.
   1. Tarif edilen deneyler için, akciğer kanseri örnekten FFPE örnekleri kullanılmıştır. Bu amaçla, akciğer kanseri dokusu derhal cerrahi rezeksiyon ile yaklaşık 3 x 2 x 1 cm parçaları sonra% 4 tampon formalin içinde sabitlendi için daha fazla analiz için parafin içine gömülmüştür burada.
   2. Bir mikrotom ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE) numune 10 um kalınlığı 5 - kesitler halinde kesilmiştir. Film kaplı membran slaytlar ve 1 saat boyunca 37 ° C'de kuru üzerine monte bölümleri. Deparaffinize ve 1 dakika boyunca, ksilen içinde arka arkaya kuluçkalama, mutlak etanol,% 70 su ve her monte edilmiş bölümleri nemlendirir.
   3. 20 saniye hematoksilen ile bölümleri Leke ve daha sonra musluk suyu ile durulayın. Bir lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemini kullanarak ilgi hücre popülasyonu toplayın (ayrıca ¹² bakınız).

başlığı "> 2. Protein Ekstraksiyonu

1. Sıvı tümörler.
   1. 400 xg, 4 dakika 4 ° C'de adım 1.1.5 hücre süspansiyonu Santrifüj ve süpernatant atın. 400 x g'de 5 dakika boyunca, 500 soğuk PBS ul ve santrifüj ile iki kez yıkanır ve 4 ° C'de
   2. 10 ⁶ hücre başına 40 ul liziz tamponu ilave edin ve (en az hücre sayısı olmalıdır 10 ⁵ hücre (yakl. 10 ug toplam protein)), buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir. 14,000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C 'de lizat santrifüj ve yeni bir reaksiyon tüpüne süpernatant (temizlenmiş hücre lisatı) aktarın. Pelet atın.
2. Katı tümörler.
   1. Microdissected dokuya, doku liziz tamponunda 60 ul eklenir ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir, kısa süreli santrfugasyon yoluyla sıvı toplamak ve yeni bir reaksiyon tüpüne süspansiyon aktarın. 3 dakika boyunca buz üzerinde lizat sonikasyon.
   2. Nihai SDS co ulaşmak bir% 20 sodyum dodesil sülfat (SDS) 15 ul ekle% 4 ncentration. 1 saat için bir ısıtma bloğu içinde 99 ° C 'de microdissected doku inkübe ve 600 rpm'de çalkalandı. 16.000 x g'de, 10 dakika süre ile 18 ° C 'de lizat santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.

Bir SILAC Spike-in Ölçülmesi Standardı 3. kurulması (Süper-SILAC Standardı)

NOT: ölçüm standardı 4 türetilen bir SILAC-etiketli protein karışımı oluşur - ilgi tümör tipini maç 6 hücre hatları. SILAC etiketli referans proteomu ve tümör türevli proteomu arasındaki maksimum çakışmasını sağlamak için, bir ana bileşen analizi hücre çizgileri ölçüm standardı ¹⁴ için seçilen önce yapılması gerekir.

1. Temel bileşenler analizi (PCA).
   1. Hücre çizgilerinin protein ekspresyon modellerini belirlemek için, uygun hücre kültürü ortamı içinde yaklaşık olarak on farklı hücre hatları yetiştirmek. Hücreleri, tarif edildiği gibiAdım 2.1. Adım 6.1'de tarif edildiği gibi, kütle spektrometrisi için hücre lizatları hazırlayın.
   2. Yüksek çözünürlüklü her hücre soyunun, protein sentezleme modelini analiz, sıvı kromatografisi-bağlanmış kütle spektrometresi (nanoLC-MS / MS).
   3. Ücretsiz eşya MaxQuant kullanarak ortaya çıkan ham veri analiz ve Perseus ^16,17 gibi ilişkili yazılım kullanarak bir ana-bileşen analizleri.
   4. Protein-ifade profilleri arasındaki en büyük çeşitlilik gösterir ve Süper-SILAC başak-standardı oluşturmak için bunları kullanmak 6 hücre hatları - 4 seçin.
2. SILAC-etiketleme ve etiket kontrolü.
   1. Arginin ve lisin, karbon ve azot ile (SILAC ortamı) ⁴ kararlı izotoplar ile işaretlenmiş olan uygun SILAC hücre kültür ortamı içinde en az beş hücre döngüsü için, seçilmiş hücre soylannın geliştirin.
   2. Parçalayıcı aşama 6.1'de tarif edildiği gibi aşama 3.1'de tarif edilen ve kütle spektrometresi için hücre lizatları hazırlamak hücreleri.NanoLC-MS / MS ile SILAC etiketleme kuruluş verimliliğini ölçmek. MaxQuant ile sonuçlanan ham MS verileri analiz ve SILAC-etiketleme etkinliğini belirlemek. Bu onların etiketli (ağır) olarak tanımlanan peptidler ve onların endojen formları (ışık) sayıları sayma, ve oranı (ağır) / (ağır + ışık) hesaplanması ile elde edilir. Etiketleme verimliliği% 98 aşmalıdır.
3. SILAC proteomlarda ve doğrulama kombinasyonu.
   1. Yetiştirmek ve uygun SILAC ortamında, üretici talimatlarına göre seçilen hücre hatları genişletmek. Parçalayıcı katı tümörler için, aşama 3.2'de tarif edilen ve her bir hücre lizatı protein konsantrasyonunu belirlemek sıvı tümörler için aşama 2.1'de tanımlanan ya da hücreler.
   2. Her bir hücre dizisinin eşit molar miktarlarda bir protein karıştırın ve kana karışımı içine ayırmaktadır. Ölçme kadar -80 ° C'de alikotları ve mağaza Yapış-dondurma. Süper SILAC standart 50 ug - bir deney için, 20 gerekir. Stan hazırlamak için özenBir dizi deney sırasında içinde standart değişiyor gibi fazlalık olarak dart kaçınılmalıdır.

Protein Konsantrasyonu ve Spike-in 4. Ölçümü

1. Sıvı tümörler.
   1. Protein kantitasyon deneyi kullanılarak ilgili hücresel lizatları ve Süper-SILAC standart protein konsantrasyonlarını belirlemek.
   2. Temizlenmiş hücre lisatı ve süper SILAC standart eşit miktarlarda karıştırılır ve daha sonra lityum dodesil sülfat (LDS) tamponu (örnek hacminin% 25) ve indirgeyici bir madde (örnek hacminin% 10) ekleyin.
   3. 10 dakika boyunca 72 ° C'de bir ısıtma bloğu içinde elde edilen çözelti ısıtılır. İsteğe bağlı olarak, -80 ° C 'de elde edilen denatüre edilmiş proteinler saklayın.
2. Katı tümörler.
   1. Bir plaka okuyucusu üzerinde protein konsantrasyonu ölçümü için, (BSA) seyreltme çözeltisi serisi, lizat ve ticari olarak temin edilebilen bir protein, a uygun süper SILAC standart standart sığır serum albümini karıştırın96 oyuklu bir plaka içerisinde ssay ve 1 dakika süre ile çalkalanır, belirtilen süre boyunca inkübe ve üretici tarafından belirtildiği gibi absorbansı ölçülür.
      Not: lizat yüksek SDS konsantrasyonu ve ditiotreitol (DTT) protein konsantrasyonunu belirlemek için en uygun deneyleri için bir sorundur.
   2. Açıklık lizat ve 20 ° C'de 30 dakika 14,000 x g'de filtre ünitesi ve santrifüj üre 200 ul Süper SILAC standart eşit miktarda karıştırılır. 50'den fazla açıklık lizatın ul ve Süper-SILAC standardını kullanmayın. Bu üre kristalleşmez, yani 15 ° C altında kaçının.

5. Numune Ayırma ve Protein Digest

1. Sıvı tümörler.
   1. % 12 gradyan SDS-PAGE jeli - Ayrı 30 - 4 üzerinde çizgi başına 100 ug toplam protein. Coomassie Mavi O / N ile Leke proteinleri. Su ile sonraki iki yıkar aşırı Coomassie leke çıkarın.
   2. Jelden her sokağın kesin ve bölmekbakılmaksızın jel boyama desen 23 eşit büyüklükte dilimler halinde. 0.6 ml polipropilen şişe içinde, ayrı ayrı her bir jel dilimlerini işleyin.
   3. Su ve metanol / su (50:50, h / h), 56 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edilerek, 10 mM DTT ile azaltılması ile jel dilimlerini yıkayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilerek iyodoasetamid 55 mM (IAA) ile jel dilimlerini alkilat.
   4. Numune işleme adımları arasında, fazla çözücüyü yok ve reaktif çözeltisi alımını artırmak için bir SpeedVac içinde 15 dakika boyunca, asetonitril ve kuru ile dilimleri yıkayın.
   5. 37 ° C'de 16 saat süre ile (0.025 M sulu amonyum bikarbonat içinde 12.5 ng / ul), domuz tripsin çözeltisinin minimum miktarda kuru jel dilimlerini rehidrasyon proteaz bölünme yapın.
   6. Jel dilimi 10 ul su ilave edin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 80 ul asetonitril ilave edin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 1 dakika boyunca, 15,800 x g'de santrifüjleyin. Ayrı 0.6 ml süpernatant ve mağaza toplayıntüp.
   7. % 5 formik asit çözeltisi, girdap 65 ul ilave edin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 65 ul asetonitril ilave edin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 1 dakika için 15,800 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant toplayın ve önceki adımdaki süpernatant ekleyin. Bir vakum yoğunlaştırıcısı kuruyana kadar birleştirilen supernatant buharlaştırın.
2. Katı tümörler.
   1. Doku lizattan SDS'nin uzaklaştırılması için de referans ¹⁵ olarak açıklanan aşağıdaki FASP protokolünü kullanır.
   2. Aşama 5.2.3 tarif edilen birinci santrifüjden sonra 20 ° C'de 20 dakika 14,000 x g'de bir filtre üzerinde, 8 M üre ayrıca 200 ul, ve daha fazla santrifüj ekleyin. Flow-through süzüntü atın.
   3. 100 ul IAA ilave edilir ve 1 dakika süre ile, 600 rpm'de bir Thermomixer karıştırın. Karanlıkta 20 ° C sıcaklıkta 20 dakika boyunca filtreyi inkübe edin. 20 ° C'de 10 dakika 14,000 x g'de filtre santrifüjleyin.
   4. Filtre ve cen üre 100 ul ekleyin20 ° C'de 15 dakika boyunca 14,000 x g'de trifuge. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   5. 20 ° C'de 10 dakika 14,000 x g'de filtre ve santrifüj _{NH4 HCO3} 100 ul ekle. Iki kez bu adımı tekrarlayın.
   6. 40 ul _{NH4 HCO3} + 1 ul (= 0.4 ug) tripsin ilave edin ve 600 rpm'de 1 dakika için 20 ° C 'de Thermomixer karıştırın. 37 ° C'de nemli bir bölmede filtre O / N inkübe edin. Yeni toplama tüpleri filtreyi aktarın.
   7. 20 ° C'de 10 dakika 14,000 x g'de filtre santrifüjleyin. 20 ° C'de 10 dakika boyunca 14,000 g'de _{NH4 HCO3} ve santrifüj 50 ul filtre ekleyin. Kütle spektroskopisi ölçümü kadar -20 ° C'de elde edilen peptidler saklayın.
   8. Peptid konsantrasyonu ölçümü için, bir 96-çukurlu plaka içinde elde edilen akış yoluyla ve düzgün triptofan uygun seyreltilerde bir dizi 50 ul dağıtmak. Triptofan floresan ölçün. Elde edilen konsantrasyon dönüştürmetriptofan, 0.1 ug peptid konsantrasyonuna triptofan, 9 ug proteine ​​karşılık gelir.

6. Sıvı Kromatografi ve kütle spektrometrik analiziyle

1. Bir sonikasyon banyosu içinde 5 dakika için 30 ul yükleme tamponu peptidler içinde yeniden çözülür. 1 dakika boyunca 15,800 xg'de santrifüj aşağı Spin ve MS otomatik numune şişenin içine net bir çözüm pipetle.
2. NanoLC-MS / MS sistemi otomatik numune alıcı ile analiz başına örnek 5 ul enjekte edilir. C18 ön kolonu (5 um gözenek boyutu C18 malzeme ile 0.15 mm iç çap x 20 mm), bir havalandırılmış kolon kurulum veya Kolon öncesi anahtarlama kurulum ya da monte edilen bir ters faz online konsantre edin ve desalt peptidler.
3. Bir ters faz C18 Mikrokolonlu ayrı peptidler (0.075 mm İD x 200 mm kendinden dolu 5>% 35 asetonitril, 90 dakikalık bir gradyan vs kullanılarak, örneğin PicoFrit olarak kendi kendine paket nano-sprey sütun 3 um veya daha küçük bir gözenek boyutu C18 malzeme ile 300 nl de.% 0.1 sulu formik asit /Min. Bir nano-sprey iyon kaynağı ile hibrid bir dört kat / Orbitrap kütle spektrometreye Aktarım yıkama sıvısı.
4. Bir top15 veriler bağımlı toplama yöntemi (MS m / z aralığı 350 ile peptidler analiz -. 1600, çözünürlük hedef 70.000 FWHM, AGC hedef 1 x 10 ^6, maksimum dolum süresi 60 milisaniye MS / MS kütle 100 başlatmak, çözünürlük hedef 17.500 FWHM, AGC ., MS / MS eşiği 3 x 10 ⁴ 2 x 10 ^5, maksimum dolum süresi 60 msn hedef ücret devletlere 2 dahil - 5, Normalize Çarpışma Enerji NCE% 25, dinamik dışlama 15 sn).

7. Veri analizi

1. Veri analizi için serbestçe kullanılabilir MaxQuant ¹⁶ yazılımını kullanın. Biyoinformatik veri analizi için ayrıntılı bir protokol ^16,17 tarif edilmektedir. Analizi için, tek bir deneyde ¹⁷ içine bir SDS-PAGE şeritli tüm dilim ham veri dosyaları birleştirmek.

Sonuçlar

Hastaların sıvı ve katı tümörlerin proteomik profilleme yeni tanı ve öngörü biyomarkerların keşfi için umut verici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, numune hazırlama işlemi ve kütle spektrometrik analiz numunelerinin karmaşıklığı ve örneklerin büyük setleri doğru protein miktarının ihtiyacı nedeniyle zordur. Yukarıda tarif edilen deney prosedürü, floresans ile aktive edilen hücre sıralama ya da lazer yakalama mikro-kesim ile ya da, ilgi konusu hücrelerin izolasyonu ile başlar.

Bu amaçla, bir hastada elde edilen kemik iliği aspiratları veya kan örneklerinden Hücreler, FACS-bazlı sıralama ve hücre lizizi önce ilgili tanımlanan yüzey belirteçleri karşı floresan-etiketli antikorlar ile lekelendi.

Doku kesitlerinden hücre alt kümelerine zenginleştirmek için bu birinci lazer yakalama mikro-kesim sağlamak için uygun kaydıraklar üzerinde monte edilmesi gerekir. Bu amaçla, t monteçok uygun bir membran slaytlar üzerinde doku bölümleri ve üreticinin talimatlarına lazer yakalama microdissector göre kullanımı. Alanları ve ilgi hücreleri seçme sağlıklı ve neoplastik doku histomorphology hakkında uygun bilgi gerektirir. Alınan hücreler daha sonra uygun bir toplama tüpüne aktarılır. İlk deneyler, ilgi her yeni doku için yeterli protein miktarlarının (en az 10 ug toplam protein) çıkarılması için gerekli olan doku miktarını tanımlamak üzere yapılmalıdır. Her microdissected numunesi doku liziz tamponu 60 ul ile muamele edilmektedir. Etkin parçalanması için, doku örneklerinden elde edilen hücreler, formalinin neden olduğu protein çapraz bağlar kaldırmak için 1 saat süreyle 99 ° C de bir termomikser içerisinde inkübe edilir ve 3 dakika için ve SDS numune 15 ul ilave edilmesinden sonra sonikasyona tabi gerekir. Santrifüj sonunda temizledi hücresel lizatın toplanmasını kolaylaştırmak olacaktır.

I her hastalık içinnterest (sıvı ve katı tümörler) uygun bir Süper-SILAC ölçümü standardı olan ¹⁴ tesis edilecek. Uygun bir standart ilgi örneklerde ifade edilen proteinlerin% 90'ından fazlasını temsil etmelidir. Bir miktar standart hazırlanması için, ilgi konusu kanser tipine bağlı hücre hatları ilk önce, protein ekspresyon profillerini belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir ve daha sonra, ana bileşen analizi yapılmalıdır. 4 - diferansiyel protein ekspresyonu ile 6 farklı hücre hatları seçilen ve "ağır" arginin ve lizin ile SILAC etiketli olmalıdır. Etiketleme verimliliği nanoLC-MS / MS ile kontrol edilmelidir ve% 98 daha büyük olması gerekmektedir. Daha sonra, hücre çizgileri daha sonra, her bir numune ve SILAC başak standart eşit mol protein miktarlarının karıştırılmalıdır ilgili bir hastada elde edilen örnek ile aynı şekilde lize edilmelidir. O Klinik örneklerin doğru bir protein ölçümü için kritik bir adımf faiz hasta kaynaklı numunelerin ve SILAC başak-in miktar standart ekimolar protein miktarlarının doğru karışımıdır. Kriteri hücrelerinden türetilen lisatların protein konsantrasyonunu belirlemek için, çeşitli protein ölçüm tahlilleri kullanılabilir. Doku türevli hücrelerin hücre lizatları, bir deney lizatı içinde SDS ve DTT konsantrasyonu yüksek olan başa ihtiyaç duyulmaktadır. Hasta türevi örnekleri ve SILAC başak standart protein konsantrasyonları da benzer örneklerin yüzlerce yapımında çok önemli olan doğru karışımı sağlamak amacıyla, ilgili klinik örnekler ile bir araya getirilmeden önce, her zaman ölçülmelidir.

Ayrılmış 1D-PAGE 10 dakika boyunca 72 ° C'de bir Thermomixer ısıtıldı LDS ile karıştırılır sıvı tümörler elde edilen ve daha sonra maruz standart ve lizat örnekleri başak ve jel sindirim eşit miktarlarda karışımı sonra tripsin ile protein. Örnekler eldeDoku Wisniewski ve arkadaşları tarafından belirlenmiş olan FASP yaklaşımı kullanarak SDS kurtarılmış ve tripsin ile sindirilir. ¹⁵

Elde edilen triptik peptidler filtre salınan Peptid miktarı, ilk filtre üzerine yerleştirilmiştir, protein miktarlarına göre% 15 ve% 75 arasında değişmektedir doku örnekleri için özel ilgi çeken bir triptofan floresan ölçülmesi ile hesaplanabilir. Bu amaçla triptofan floresan ölçer. Triptofan 1.1 ug, yaklaşık 100 ug peptidin tekabül gibi uygun bir triptofan seyreltme serisi ile karşılaştırma, peptitler ölçülmesini sağlar. Gerekirse, FASP işlem özellikle edilen örnekler nanoLC / MS / MS sistemine ¹⁸ üzerine yüklenmeden önce, ters faz C18 (RP-C18) malzeme ile dolu, ticari veya ev yapımı aşama uçları ya da önceden saflaştırılabilir.

Kitle-spektometrik analiz, yüksek gerçekleştirilir-resolution, yüksek hassasiyet kütle spektrometresi sistemi. Kısacası, peptid numuneleri, tuzdan arındırılmıştır ve bir RP-C18 Kolon öncesi ile yoğunlaştırılmış ve kütle spektrometresi ile doğrudan bağlanmış bir RP-C18 analitik kolonu üzerinde ayrılır. FASP tarafından işlenen katı tümörlerin (3 saat, RP-C18 geçişlerini - analizi, yeterli derinliği elde etmek için, uzun bir 2, 40 dakika RP-C18 (sıvı tümörler) ve gradyanlar veya tek enjeksiyonları ile SDS-PAGE protein prefractionation bir kombinasyonu ya istihdam ). MS spektrumları kromatografik pik profilleri entegrasyonu ile SILAC çiftleri doğru ölçümü sağlamak için, 70,000 FWHM ya da daha iyi bir çözünürlükte elde edilir. Protein belirlenmesi için, bir top15, veri-bağımlı alma yöntemi peptid ve protein belirlenmesi için peptid MS / MS spektrumları, büyük bir sayı üretmek için kullanılır.

Elde edilen ham verilerden, protein kimlik ve miktar bir UniProt Knowledgebas karşı MaxQuant yazılım ile arama veritabanı elde edilirE İnsan Tam Proteome veri tabanının ^17. MaxQuant yazılım (güncel sürümü 1.5.0.25), peptidler protein dizi veritabanından silico türetilen spektrumları karşı peptid fragmanı eşleştirme tarafından satın MS / MS spektrumları ile tanımlanmıştır. Aynı zamanda, izotopik profilleri iyon ön-madde kromatografik tutma süreleri yaklaşık ekstre edilir ve entegre pik alanları ışık nispi ölçümü için kullanılır: SILAC etiketlenmesi sureti ile oluşturulan yoğun peptit çiftleri. Peptit kimlikler ve nispi yoğunlukları daha sonra gelen protein özellikleri atanır. Kahraman yazılımı (güncel sürümü 1.5.0.15) daha sonra örnek-örnek karşılaştırmalar, PCA ve hiyerarşik kümeleme dahil MaxQuant işleme sonuçlarının daha aşağısında istatistiksel değerlendirme, gerçekleştirmek için kullanılır.

Deney düzeneği biz belirledik açıklanan ve az toplam proteinin mikrogram 30 olarak 8,000 proteinlere kadar sayısal kullanmaSıvı tümörlerinden türetilen.

Katı tümör örneklerinden kadar 2500 proteinleri tanımlanmış ve nispeten kısa bir süre içinde, klinik örneklerde yüzlerce analize izin verir ancak 2 saat arasında bir LC gradyanı ile bir av tüfeği proteomik yaklaşımla belirlenebilir.

Şekil 1. Deneysel iş akışı. Hücresel alt kümesi zenginleştirme, protein izolasyonu temel adımlar, başak-in sıvı ve katı tümörler için gösterilen ölçüm standardı ve kitle-spektrometrik analiz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Hücresel zenginleştirme strategies. FACS sıralama ve LCM. (A) Örnek yolluk stratejisi hücre sıralayıcı tarafından elde edilen bir CD117-lekeli lösemik hücre popülasyonu üzerinde yolluk resmeden. Solid tümör dokusu (B) Lazer yakalama mikrodiseksiyon. 5 Doku kesitleri - 10 um kalınlıkta boyama önce film kaplı membran lam üzerine yerleştirilmiştir. Çıkarları Bölge lazer yakalama mikrodiseksiyon elle seçildi. Ilgi bölge ile mikrodiseksiyon sarı ve mikrodiseksiyon sonra işaretli önce bölümler gösterilmiştir. 50 um bir ölçek çubuğu rakam dahil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Insan kanser hücre proteomların Şekil 3. Küme analizi. Pr Öğreticisiz küme analiziSıvı ve katı tümörlerin otein sentezleme profilleri hesaplama platformu Kahraman kullanılarak gerçekleştirilmiştir. AC - Adenokarsinom, SCC - Skuamöz hücreli karsinom, SCC-Met - teknik çoğaltmak - baş ve boyun kanseri, R Skuamöz hücreli karsinom metastazı.

Tartışma

Hasta kaynaklı kanser hücre proteomların Kitle spektrometrik profil yeni tanı / öngörü biyomarkerların keşfi için gerekli yanı sıra kanser hücre biyolojisi daha iyi bir anlayış vermek için hangi olabilir yeni potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesine yol açacaktır. Çeşitli ön-analitik konular bir sağlam ve biyolojik ilgili sonuçlar elde etmek ise, çözülmesi gereken Ancak, bu tür kitlesel spektrometrik analizler, özellikle zorlu vardır.

Burada tarif edilen deney akışı, sıvı ve katı tümörlerin, hem hücresel alt popülasyonlannda elde proteomların kantitatif proteomik karakterizasyonu için izin verir. ya da FACS-bazlı hücre sortingor mikro-kesim ile tümör hücrelerinin ilk zenginleştirme tümör mikro-hücreleri ile kirlenmesini önlemek için gereklidir. Ayrıca, bu teknikler bir ilgi hücresel subpopülasyonunun izole sağlar. Son hücre biyolojik çalışmalar iblis varBazı hücresel subpopülasyonunun tümör başlatan özelliklere sahip ve dolayısıyla kanser patogenezinde ^19,20 için son derece alakalı olduğunu strated. Kütle spektrometresi son yıllarda daha duyarlı hale geldikçe, kantitatif proteomik analizler, birkaç bin hücrelerden elde edilebilir protein küçük miktarlarda mümkün olan mümkün işlevsel ilgili hücre popülasyonlarının odaklanmak için yapım.

Burada sunulan set-up FFPE örneklerinde yeni tanı Biyobelirteçleri tanımlamak ve doğrulamak için kullanılabilir. Dolayısıyla, hala birçok kanser türleri için yeterli sayıda ve kalitede moleküler biyolojik belirteçler eksikliği olduğu tarihe kadar, klinik teşhis iyileştirilmesi için yararlı bir araç bea vaat ediyor. Biyomarkırlar eksik olan zor ayırıcı tanı, önemli örnekleri, akciğer metastazları, intrapankreatik kolanjiosellüler karsinom ve pankreas adenokarsinomaya primer akciğer kanseri arasındaki ayrımcılık vardır, yanı sıra farklıoldukça malign periferik sinir kılıfı tümörleri-benign nörofibromlar ayırt edilmesi. Ayrıca, ve diğerleri proteomik imza sayısal aydınlatılması, genel olarak kanser hücresi biyolojisi okuyan ve kanser hastalarında ²¹ terapötik tepkinin işaretidir biyolojik işaretleri ortaya çıkarılması için yararlı olabileceğini göstermiştir.

Burada yer alan yöntem iki akım dezavantajları zengin manuel Örnek işleme gerekliliği ve nanoLC-MS / MS, alma zamanına ilişkin bir talep vardır. Eski örneğin, 96-kuyu formatları örnek hazırlama hareketli ve robotik işleme kullanılarak ele alınabilir iken, ikincisi kitle spektrometrik satın alma stratejisinde bir değişiklik gerektirecektir. Hedef proteinlerin alt-gruplar, örneğin, tümör sınıflandırması ile ilişkili olabilir ki belirlendikten sonra, bir önemli ölçüde azaltılmış ayrılma çaba ile, bu alt-gruplar için nicel okumalarını sağlayabilir hedef kütle spektrometresi yöntemleri tasarım öngörmektedir, veDolayısıyla buna bağlı olarak azalır, alma zamanına sahip. 24'ten azaltılabilir gereken gerekli alma süresi ise - 36 saat (sıvı tümörler) veya 3 saat (katı tümörler) gibi üzere, 1 saat daha sonra kütle spektrometrisi ve peptidlerin bir basit tek-boyutlu bir ayırma, iç verimle sonuçlanır kazanç hedef kullanılarak ölçüm sonuçlarının önemli iyileştirmeler karşılık gelen, incelenmiş ve biyolojik teknik replika anlamlı sayısını arttırmak için kullanılabilir. Hedeflenen kitle spektrometrik yaklaşımları zaten kanser-ilişkili protein biyolojik belirteç-adayların ²² doğrulanması için uygun bir araç olduğu gösterilmiştir ve onlar doğrulama için ya da rutin klinik kullanımda ²³ için potansiyel bir araç olarak umut vaat bir noktaya geliştirilmiştir ^{, 24.}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
660 nm Kit	Thermo scientific	22662
Arginin ve lizin içermeyen hücre kültürü ortamı	Thermo Scientific	88421
Coomassie Brilliant Blue R-250 boyama solüsyonu	Bio Rad	161-0436
Diyalize edilmiş fetal buzağı serumu (FCS)	PAA	A15-107
Mikrodiseksiyon için difüzör kapakları	MMI	50202
FACS-sorter	BD	FACSAria III
İyonik Deterjan Uyumluluk Reaktifi	Thermo scientific	22663
Lazer yakalama mikrodissektörü	MMI	hücre kesimi artı
LDS tamponu	Yaşam Teknolojileri	NP0009
Mikrodiseksiyon için membran slaytları	MMI	50103
Microcon YM-30	Millipore	MRCF0R030
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Mini Jeller	Life Technologies	NP0335PK2
Picofrit Kendinden Paketli Sütunlar	Yeni Amaç	PF360-75-15-N-5	Kütle Spektrometresi Sütunu/Yayıcı
İndirgeyici ajan	Yaşam Teknolojileri	NP0007
Reprosil-Pur LC/MS/MS Kolon sabit faz	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 3 & m
Reprosil-Pur LC/MS/MS Sütun öncesi sabit faz	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 5 & m
SILAC etiketli arginin	Eurisotop	CLM-2265-H-0.1
SILAC etiketli lizin	Eurisotop	DLM-2640-0.25
Tripsin, NB Sıralama Sınıfı	içi sindirimler için	Serva
3728301 Tripsin,	çözelti içi sindirmeler için	Promega	V5111
Tampon ve çözeltiler
Hücre lizis tamponu: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF,  %0.5 NP40, %0.1 laurilmaltosid, Roche tam proteaz inhibitörü, 1 mM Na3VO4
Doku lizis tamponu: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT
Üre: 0.1 M Tris-HCl'de 8 M üre,	FASP protokolü için
IAA: 0.05 M iyodoasetamid, 8 M üre, 0.1 M Tris-HCl,	FASP protokolü için
0.05 M NH4< / sub>HCO3< / sub>
10 mM ditiyotreitol (DTT) jel içi sindirim
Jel içi sindirim için 0.1 mM amonyum bikarbonat
IAA)  % 5 sulu formik asit.