Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

Özet

Biz insan meme hormon eylem incelemek için yeni bir ex vivo modeli geliştirdik. Bu doku mimarisi, hücreler arası etkileşimleri ve parakrin sinyal korumak cerrahi göğüs doku numunesinin izole doku mikro dayanmaktadır.

Özet

İnsan meme hormon eylem çalışması yeterli model sistemler eksikliği engel olmuştur. İn vitro kültüre, primer meme epitelyum hücreleri hormon reseptörü ifade kaybetme eğilimindedir. Yaygın olarak kullanılan hormon reseptörü pozitif meme kanseri hücre kuşakları in vivo duruma uygunluğu sınırlıdır. Burada, insan meme hormon etkisini incelemek için bir eks vivo modeli açıklar. Böyle azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri veya mammectomies gibi cerrahi ıskarta malzeme Taze insan meme doku örnekleri mekanik ve enzimatik kanalları ve lobülleri ve çoklu stromal hücre tipleri içeren doku parçaları elde etmek için sindirilir. Büyüme faktörleri olmaksızın bazal ortamda tutulur Bu doku mikro bunların hücreler arası temas doku normal yapı, ve birkaç gün boyunca duyarlı hormon kalır. Bu maddeler hali hazırda, RNA ve protein çıkarma, histolojik analiz için işleme veya orta dondurma saklanır. Floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS) belirli bir hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için de kullanılabilir. Bu protokol son derece karmaşık, çeşitli insan örnekleri ile öteleme çalışmalar için basit, standart bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Meme kanserinde mutasyon manzara hakkında bilgiler hızla artmaktadır. Daha az dikkat meme kanseri gelişimini etkileyen sistemik faktörler ödenmiştir. Üreme hormonları maruz kalma hastalığın ilerlemesine ^1-3 üzerinde büyük bir etkisi vardır. Ancak, üreme hormonları, insan meme çarpmadan hangi mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Genetiği fare modelleri ile çalışmak onlar birkaç mansap efektörlerinin ⁴ ile hücre içsel ve parakrin sinyal içerdiğini ortaya koymuştur.

İnsan meme hormon eylem hakkında sınırlı bilgi yeterli modellerin eksikliği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR), sinyal mekanizmaları ilişkin pek çok çalışma, MCF-7 ve T47D hormon reseptör pozitif göğüs kanseri hücre çizgileri ile gerçekleştirilmiştir. Bunlar alrea vardı ilerlemiş meme kanserli hastaların plevral efüzyon elde edildidy birden tedavileri ⁵ aldı. İnsan meme gibi basit laboratuar çalışmalarındaki modellerde bulgular biyolojik önemi, bu in vitro modellerde tespit şüpheli ve hedef genleridir olan hayvan modellerinde ^6'da tanımlanan hedef genlerin farklıdır. Birincil insan meme epitel hücreleri, in vitro olarak kültürlenir onlar hormon reseptör ekspresyonu ve bu nedenle hormon yanıt ^7,8 kaybetmek eğilimindedir. Bu sorun, Matrigel kullanarak karmaşık 3D yaklaşımlarla circumventd edilebilir. Bu şekilde, C. Clarke ve arkadaşları, hormon reseptörü ifade muhafaza ve projesteron uyarması ⁹ bir çoğalma tepkisi gösterdi göğüs epitelyal hücrelerinin kurulma başarmıştır. Bununla birlikte, in vivo progesteron reseptörü hedef genlerin önemli iki Wnt-4 ve RANKL bu sistem ⁹ progesteron stimülasyonu üzerine azalmadı. Bu yaklaşım, son olarak nitro ile daha fazla alınmıştır hormon öncesi ve RANKL'ın indüksiyon ¹⁰ sağlandı. Bir uyarı, matrigel toplu bağımlı faaliyetleri vardır kalır pahalı ve sadece küçük hücre sayıları için apt bir deneysel tasarım gerektirir.

In vivo ER ve PR sinyalizasyon büyük ölçüde parakrin etkileşimleri ¹¹ aracılık bulgusuna dayanarak, biz hücrelerarası etkileşimleri muhafaza edilmesi gerektiğini savundu. Dokular olarak kaybolur bir başka önemli faktör, in vitro kültür için tek bir hücre için hücre dışı matriks ile epitelyal hücrelerinin etkileşimlerdir ayrışmış edilir; ancak bu epitel farklılaşması için çok önemli olan ve bozulma tümör oluşumu ¹² önemlidir. Bu düşünceyle, biz taze cerrahi ıskarta malzeme ¹³ meme dokusu mikro izole etmek için bir yöntem kurdu. İç luminal ve dış myoepitheli sahip bir iki tabakalı epitelyum oluşan meme parankimi,ark hücreleri, adipoz dokudan kesilmiş, mekanik ve enzimatik ayrışma tabi tutulur. Yıkama ve santrifüj sonra, süt kanallarının parçaları birçok stromal hücreler ile yakın ilişkileri korumak olduğunu elde edilir. Bu doku mikro duyarlı hormon kalır. Model klinik örneklerden ¹³ valide edildi. Bu haliyle, bu işlem, bir biyolojik ve klinik olarak anlamlı bir bağlamda meme hormon etkisini incelemek için yardımcı olabilir.

Protokol

Genel değerlendirmeler: Zaman Ahead, bir etik protokolü kurmak, hastalar için anketler hazırlar, ve klinik personelinin eğitim görmek. Indirgeme mamoplasti cerrahi malzeme kullanmadan önce, yetkileri tedarik ve hasta rıza sağlamak. Doku bulaşıcı olması ve buna göre ele alınması gerekiyor olabilir. Deneysel Kanser Araştırma Enstitüsü İsviçre - Bu protokol ISREC etik komitesi tarafından onaylandı.

1. Doku Kurtarma, İşleme ve Biyo-bankacılık

Biyo-bankacılık için en uygun örnek kalitesini sağlamak için, birkaç adım laboratuarına taşımak için önce hastanede yapılır.

Hastanede:

1. Gerekirse, indirgeme mamoplasti cerrahi ve kan örneklerinden, steril koşullar altında insan göğüs dokuları elde edilir. Doku malign lezyonların varlığını ekarte etmek için örnek olacak patolog tarafından incelenmesi gerekir.
2. Meme t yerleştirinsteril bir gemide başlık altında vermek ve makas, cerrahi neşter ve zaten buhar sterilizatör sterilize edilir forseps hazırlamak. Bunu açmak için bir neşter kullanılarak meme dokusunun farklı sitelerde derin kesim olun. Insan meme dokusunda sarı yağ dokusunda gömülü kanalları ve lobülleri, oluşan beyaz teller için bakmak.
   NOT: Sarı yağ dokusu beyaz parankimal oranı kadınlarda farklılık; tipik genç kadınlar daha epitel doku var.
3. Daha sonra makas ile adipoz dokudan hafifçe onları ayırmak, beyaz malzeme parçaları seçin ve forseps ile onları tutun. Kan damarlarını almaktan kaçının.
4. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.2 doku durulayın adet kanı çıkarmak için kullanılır. Ve% 1 An (5000 birim / ml penisilin ve 5000 ug / ml streptomisin içeren)% 2 penisilin / streptomisin ile fenol kırmızısı olmaksızın F12 ortamı (Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı F12) ihtiva eden 250 ml'lik bir plastik şişe doku aktarıntibiotic / amfoterisin B (10,000 birim / mL penisilin, streptomisin 10,000 ug / ml amfoterisin B ve 25 ug / ml olmak üzere). Laboratuara taşınması için ortamda depolanmalıdır dokular.
5. Soğuk (kuru buz) izopentanın ile cryovials bunları dondurmak RNA ve protein çıkarma ve flaş için 5 mm çaplı - 3 adet hazırlayın. Laboratuara taşınması için kuru buz kutusuna aktarabilirsiniz.
6. Kalıba 5 mm ve optimum kesme Sıcaklığı (Ekim), bir tabaka ile örtün ve daha sonra soğuk izopentan ile dolu kutunun düz bir alt kalıp yer - 3 parçalarını koyun. Tam donma sonra kuru buz kutusuna kalıp aktarmak.
7. Formaldehit içinde paraformaldehid 5 mm çapında (PFA)% 4 ve 5 parça (FA), daha sonra RT histolojik analiz PBS içinde% 4 - 3 5 adet düzeltin. Bazı antikorlar, daha bir ya da iki diğer çalışmak üzere iki farklı sabitleyici tavsiye edilir.

Laboratuvarda:

8. Yapmakindirgeme mammoplasty ilgili tüm bilgileri cument, cerrahi ve örnekler olup olmadığını tarih sağ meme karşı soldan türetilmiştir.
9. -80 ° C'de dondurulmuş numuneler ve tespitin 2 saat sonra histolojik kasetlerine sabit dokuları aktarın. Daha sonra 4 ° C'de O / N depolama için, etanol, PBS içinde veya% 70 ya da koyun. Ertesi gün, parafin gömme için histoloji tesislerine histoloji kasetleri aktarmak.

2. Doku sindirimi ve Hormon Uyarım

1. P2 hücre kültürü odasında bir laminer akış kabine doku örnekleri içeren şişeleri aktarın. Steril doğrama tahtası (29 x 19 cm) doku parçaları yerleştirin. Forseps ile malzemeyi tutun ve neşter ile meme parankimi (beyaz kısmı) kalan yağ ve damarları kazımak. 10 cm kültür çanak PBS beyaz malzemeyi yerleştirin.
2. Tüm parçalar yağlı malzemenin çıkartılması ve atılması sonra onları güvenlik kuralına görelaboratuvar s, arka doğrama tahtası üzerinde epitel doku içeren beyaz parçalar yerleştirin. Karşıt neşter kullanılarak doku kesmek ve en fazla 2 mm çaplı parçalara doğrayın.
3. Yeterli büyüklükte tüplerin içine kıyılmış malzemeyi yerleştirin: 1, 2.5 ve 10 ml kadar 5, 15 ya da 50 ml'lik tüplere, sırasıyla. Tipik olarak 5 ml'lik bir tüp verimi yeterli parafin gömülmesi ve hormon uyarımlar için malzeme ve flöresanla aktive edilen hücre bir 15 ml tüp verimi yeterli malzemenin sıralama (FACS). Daha büyük tüp alikotları dondurulması için kullanılır.
4. % 1 penisilin / streptomisin / amfoterisin B (fenol kırmızısı olmadan DMEM / F12) ortama aşağıdakilerden oluşan sindirim ana karışımı hazırlamak ve (Clostridium histolyticum'dan Clostridiopeptidase A) bir kolajenaz. Sindirim saatlerine göre kollajenaz doz.
   1. 12, 24, ve kuluçkalama 36 saat için, 1.5 mg / ml, 1.0 mg / ml ve 0.5 mg nihai kolajenaz konsantrasyonu, kullanımı / ml olarak tespit edildi. 4 kez sindirim ana karışımı ekleyinsindirilmiş malzemenin hacmi yeterli ajitasyon ve havalandırma sağlamak için.
      NOT: deneysel tasarım ve hormon stimülasyon süresine bağlı olarak, sırasında veya enzimatik sindirim adım ve mikro kurtarma sonra ya hormonlar ekleyin.
5. Numune ve kontrol aracı test etmek için, istenen konsantrasyonda hormon (lar) ekleyin. 17 β-estradiyol ve promegeston (R5020) ile stimülasyonu için 20 nM nihai konsantrasyon kullanılır.
   Not: R5020 ortamda doğal progesteron daha kararlı olan bir sentetik progesteron reseptör agonistidir.
   1. 37 ° C ve 40 rpm O / N bir inkübatör içinde silindir mikser yerleştirin tüpleri. Mikserde örnekleri yerleştirmeden önce, tüm maddi santrifüj tüplerine boyunca dağıtır sağlamak için onları çok iyi tekrar süspansiyon.
6. Sindirim az 12 saat hormon stimülasyon kez en az 12 saat (O / N), alır gibi, (mikroyapıların kurtarma sonra hormonları eklemek deAdım 3 altında kuyruklu). Eğer mikro tekrar süspansiyon ve ultra-düşük bağlanma plakaları üzerinde süspansiyon yer olarak hormonları ekleyin. Doku mikro yaklaşık% 70, canlılığını muhafaza büyüme faktörü içermeyen ortam içinde 7 gün boyunca ultra-düşük bağlanma plakaları üzerinde tutulabilir.
7. RNA ve protein analizi için, santrifüj tüplerine 5 dakika ve flaş dondurma için 400 xg'de santrifüj doku mikro toplamak.

Doku Microstructures 3. Kurtarma

1. 5 dakika boyunca 400 xg'de tüp (ler) santrifüj. Santrifüj tüpünün üst yağ aspire ve 5 dakika süreyle 1,250 x g de yeni bir santrifüj tüpüne ve santrifüj, fibroblastlar içinde zenginleştirilmiş olan geri kalan sulu süpernatan, süpernatanlarının aktarın.
   NOT: Meme dokusu mikroyapıları sonraki tüm adımlar için, çok yapışkan olduğundan tüp hafifçe çalkalayarak pelletini. Pipetleme nedeniyle malzeme kaybetme riski tavsiye edilmez.
2. Mikro ve PBS,% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS), sulu süpernatan elde edilen fibroblastlar zenginleştirilmiş pelet yeniden süspanse. Daha sonra 5 dakika boyunca 1.250 xg'de hem tüpleri dönmeye ve daha sonra süpernatantlar atın.
3. 3 pelet tekrar süspansiyon - 5 ml kırmızı hücre kan parçalama tamponu ve temiz tüplere aktarabilirsiniz. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe.
4. PBS,% 2 FCS 2x hacmi ilave edin ve 5 dakika boyunca 1250 x g'de santrifüj. 5 dakika boyunca 1,250 x g hızında PBS,% 2 FCS ve santrifüj ile pelet yıkayın. Iki kez bu adımı tekrarlayın.

Akım Sitometrisi 4. Örnekler

1. Pelet% 0.25 oranında tripsin 2 ml ve hücreleri ayırmak için 1.000 ul Pipetman ile 2 dakika süreyle çok hafifçe aşağı yukarı pipetleme karıştırın ve - 1 ekleyin.
2. 9 ml PBS,% 2 FCS eklenerek tripsin aktivitesi inhibe. 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve 10 ml PBS,% 2 FCS içinde pelletini.
3. T yerleştirilen 40 mikron hücre süzgecinden üzerine hücre süspansiyonu aktarın50 ml'lik bir santrifüj tüpünün op tek hücrelerin hazırlanması için. Hücre süspansiyonu bir kaç mikrolitre filtrenin üstünde kalırsa, bir pipet ile süzgeçten diğer taraftan onları aspire onları filtreden geçerek yardım ve filtre mikroyapılarının ekleyebilirsiniz.
4. Daha sonra, ayrı bir bağışıklık hücreleri, anti-CD45, bir kokteyl ile mikro gelen fibroblastlar ve endotel hücreleri, anti-FAP ve anti-CD31 antikorları ve sırasıyla ¹⁰ lümen ve bazal hücrelerin ayrılması için bir pan-epitel işaretleyici EpCAM ve CD10 göre, FACS ile sıralamak .

Histoloji 5. Örnekler

1. Yukarıda tarif edildiği gibi, mekanik olarak ve enzimatik olarak sindirilen materyali yıkandıktan sonra, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 4 PFA içinde 1 ml 1.5 mi, başlangıç ​​maddesi granül düzeltin.
2. 5 dakika boyunca 1.250 xg'de Santrifüj ve 1 ile yıkayın - iki kez 2 ml PBS.
3. 10 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin. Bu süre boyunca, (Tris-Asetat-EDTA agaroz% 1 çok amaçlı hazırlanmasıTAE) tampon ve solüsyon kaynama noktasına gelene kadar mikrodalga fırında ısıtın çözüm.
   1. Mikrodalga fırından çözüm çıkarın ve çözüm karıştırın ve kalan agaroz parçacıkları tekrar süspansiyon yavaşça şişeyi girdap. 50 ° C'ye soğutun, agaroz çözeltisi ve bir parafin baz kalıp içinde 1 ml akış 31 x 23 x 13.5 mm çapında.
4. Süpernatant atılır ve katılaşan bir tabakanın üstünde yer pelet - düz bir uca sahip olan bir spatula kullanılarak agaroz (1 ila 3 mm) kadardı. Agaroz ek bir katman (40 ° C) ile hepsini kapsayacak.
5. Agaroz katılaşır sonra, genellikle 5 dakika içinde, parafin gömme için histoloji kasetleri içine agaroz blokları koydu. Agaroz örnekleri kalem küçük harflerle yazılmış azalma mamoplasti numarası, deneysel koşul ve tarihi hakkında tüm bilgiler kaset beyaz ofis kağıdı yerleştirin birlikte; Bu yazı sonraki tüm tedavi adımlarını dayanıklıdır.
6. Kasetler koyPBS O / N ya da 4 ° C'de hafta sonu boyunca depolama için% 70 etanol içinde. Biz iki depolama çözümleri arasında herhangi bir fark fark değil. Sonra parafin gömme için histoloji tesislerine histoloji kasetleri aktarmak.

6. Dondurma Mikroyapılar (Gelecek Kültürleme)

1. % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile FCS içeren orta ve cryovials 1 ml'lik numuneler dondurulması yeniden süspanse doku mikro. Elde edilen cryovials sayısı azaltma mammoplasty elde edilen birincil malzeme miktarına bağlıdır.
2. -12 ° C sıcaklık ile azalan, 6 ° C / dakika oranı ile C ila -7 sıcaklığının düşürülmesi, 5 dakika 4 ° C 'de yaşayan aşağıdaki program ile bir kontrollü hız dondurucu kullanılarak doku mikro içeren cryovials Freeze 6 ° C / dk, 10 dk konut hızı, 6 ° C / dakika oranı ile -40 ° C sıcaklık azaldıkça -80 ° C sıcaklıkta azalmaktadır6 ° C / dakika hızı. Sonra ° C derin dondurucuda -80 kadar cryovials aktarmak.
3. Ertesi gün, uzun depolama için sıvı azot tankına ° C -80 cryovials aktarın.

Sonuçlar

Östrojen ve progesteron rolünü incelemek ve daha iyi insan meme moleküler işlevlerini anlamak için, onların bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra azalma tekniği mevcut ameliyat teknikleri (Şekil 1) uygulanan hastalarda taze insan meme doku örneklerinin toplamak. Biz de hastaların tıbbi ve üreme geçmişi, hem de ameliyat sırasında serum progesteron seviyelerini belirlemek için kan örneği almak. Taze azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri doku mekanik ve enzimatik ayrışmış. Elde edilen doku, mikro kök...

Tartışma

Burada anlatılan ex vivo kültür normalde insan kadın meme bulunan diğer hücre tipleri ile birlikte sağlam kanalları ve lobülleri içeren meme dokusu mikro sağlar. Genellikle azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri elde edilen insan göğüs dokusunun işlenmesi sırasında, yağ dokusu, stromal matrisin mekanik ve enzimatik sindirme ve kırmızı kan hücrelerinin lizizine çıkarılması süt kanalı parçaları ve terminal duktal lobüler birimleri zenginleştirir. Sağ süresince doğru konsantrasyonda yumuşak enzimatik sindirimi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mikrolitre Santrifüj	Heraeus Biofuge Fresk	75005521
Santrifüj 5810R	Eppendorf	5810 000.327
Cryobox	Nalgene	5100-0001
Kontrollü Hız Dondurucu EF600 Hibe	Asimptote	EF600
CO2 inkübatörü	Hera Cell Heraeus	51022391
Silindirli Mikser SRT9D	Sturt	SRT9D
Histoloji Kasetleri	Medizintechnik	81-0021-00
Hücre Süzgeci	Falcon	352340
Strile Cerrahi Bıçak	Aesculap	BB536
Neşter	Aesculap	BB084R
Forseps	Aesculap	BD047R
Makas	Aesculap	BC374R
Parafin taban kalıbı	SAKURA	4166
Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) Kriyomatris	Termobilimsel	6769006
Penisilin / Streptomisin ve nbsp;	Yaşam Teknolojileri	15070-063
Antibiyotik/Antimikotik	Yaşam Teknolojileri	15240-062
DMEM F/12	Yaşam Teknolojileri	11039-021	Ön Isıtma (37 ° C)
Kollajenaz	Roche	11 088 793 001	Ön ısıtma (37 > C)
Fetal Sığır Serumu Yaşam	Teknolojileri	10270	Fetal Buzağı Serumu
Hücre Kan Lizis Tamponu	Sigma	R7757
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D2650
Tripsin-EDTA	Yaşam Teknolojileri	15400-054
Agaroz	Invitrogen	16500-500
ile değiştirilebilirFormaldehit	Sigma	F1635
Paraformaldehit	Roth	335
İzopentan	Sigma	M32631
Etanol	Merck	1009831000
Kriyojenik şişeler (5.0 ml)	VWR, Uluslararası	479-0820
Ultra düşük ataşman kültür kabı	Corning, NY 14831	3471

,