Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

Summary

Protein-protein etkileşimlerini hedeflemek için REPLACE stratejisinin uygulanmasını açıklıyoruz. REPLACE , optimize edilmiş peptidik inhibitörlerin ilaç benzeri moleküllere dönüştürülmesi için sentetik ve hesaplamalı yaklaşımları içeren yinelemeli bir stratejidir.

Abstract

Daha etkili protein-protein etkileşimleri (PPİ) hedef alınarak geliştirilmiş benzersiz bir strateji DEĞİŞTİRİN olduğunu. Bu potansiyel ilaç hedefleri çoğunluğunu temsil eden bu tür bağlayıcı siteler için inhibitörlerinin belirlenmesi ve hangi gelişmiş metodoloji sağlayarak mevcut ilaç hedef alanını genişletmeyi hedeflemektedir. Bu çalışmanın temel amacı, hesaplamalı ve sentetik kimya yaklaşımlarını içeren REPLACE strateji kullanımı ve uygulama metodolojik bakış sağlamaktır. Olmayan ATP rekabetçi sikline bağlı kinazlar (CDK) anti-tümör terapötik olarak inhibitörlerinin geliştirilmesi için uygulanması ile tarif edilmektedir değiştirin. CDKler sıklıkla kanser deregüle ve dolayısıyla ilaç gelişimi için önemli bir hedef olarak kabul edilir. S fazında CDK2 / siklin A inhibisyonu E2F1 yolu boyunca p53, bağımsız bir şekilde, kanser hücrelerinin seçici apoptosisi teşvik ettiği rapor edilmiştir. Siklin-bağlanma protein-protein etkileşimi hedefleyeng yiv (CBG) transkripsiyonel CDK'lar fazla hücre döngüsünün spesifik önlenmesini sağlayacak bir yaklaşımdır. CBG CDK alt tabakalar ve tümör baskılayıcı proteinlerin türetilen bir uyuşum sekansı tarafından tanınan motifi (MBP) bağlanma siklin olarak adlandırılan. MBP önce ayrıca yeterli aktiviteyi (RRLIF) koruyarak bir pentapeptid kesiliyor sonra p21Waf (HAKRRIF) ve bir oktapeptidin için optimize edilmiştir. Geçirgen hücre değil, genel olarak peptitler, metabolik kararsız ve dolayısıyla strateji DEĞİŞTİR (Hesaplamalı Zenginleştirme aracılığıyla Kısmi Ligand Alternatifleri ile yedek) Daha fazla ilaç gibi inhibitörleri üretmek amacıyla uygulanmaktadır vardır. Strateji seçici hücre döngüsü CDK / siklin kompleksleri inhibe Fragment bağlandı inhibitör peptidler (çevirme) tasarımıyla başlar. Döndürür, tekrarlı N-ucuna (Ncaps) başlanarak küçük moleküller (başlık oluşturma grupları ile) gibi fragmanı ile HAKRRLIF / RRLIF kalıntılarını değiştirerek oluşturulan ilgili değiştirilmesi yoluyla elde edildiC-terminali. Bu bileşikler, anti-tümör terapötik olmayan ATP rekabetçi CDK inhibitörleri üretimi için başlangıç ​​noktası vardır.

Introduction

Bu yazıda, daha fazla farmasötik ilgili moleküllerin içine protein-protein etkileşimleri peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için strateji DEĞİŞTİRİN (hesaplama zenginleştirme kullanarak kısmi ligand alternatifleri ile değiştirilmesi) uygulayarak bir vaka çalışması ^1-3 tarif edilmiştir. PPİ potansiyel ilaç hedefleri zengin ama yeterince faydalanılmayan kaynağı temsil ederken, mevcut metodolojiler bu yaygın erişilebilir hale getirmek, büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Fragmanı göre ^dizayn 4, yüksek verimli tarama ^{5 ve 6} ilerlemeler sağlamıştır zımbalanmış peptidler dahil olmak üzere mevcut stratejiler, ancak, bu bir çok durumda etkisizdir. Sonuç olarak, daha fazla ilerleme ve daha verimli yaklaşımlar gereklidir. Tam ilaç gibi iyileştirilmiş özelliklere ve anti-tümör terapötik maddeler olarak daha da geliştirilmesi için bir potansiyele sahip olan kinaz inhibitörlerinin geliştirilmesinde doğrulanmıştır DEĞİŞTİRME. Bu strateji, hücre dışı ATP inhibitörlerinin geliştirilmesinde örneklenmiştirdöngüsü CDK'ler ve aşağıda içerir: 1) siklin oluğu bağlayıcı HAKRRLIF / RRLIF etkileşimleri ile ilgili 3 boyutlu yapısal bilgileri elde edilmesi; 2) peptid etkileşimi için önemli bir bağlama determinantları olarak belirlenmesi; Bir veya daha fazla bağlama determinantları içeren peptit N-terminal bölgesinin 3) kesme; Peptid ve hangi kesik kısmı için potansiyel küçük molekül alternatiflerinin 4) hesaplama kimlik (kısmi ligand alternatifler PLA'lar) ana peptid önemli etkileşimleri korumak; 5) sentez veya PLA'lerin ticari kaynak önceden silinmiş peptid kalıntı (lar) tarafından işgal alt site ile heyecanla bağlamak için öngörülen; 6) katı faz sentezi kullanılarak kesilmiş peptid için en iyi PLA'lerin ligasyonu yoluyla döndürür ve sentezi; Bağlanma, bir in vitro çevirir ya da bir hücre canlılığı deneyinde daha fazla karakterizasyon ve ardından fonksiyonel deneyi (CDK / siklin bağlamında floresan polarizasyon), 7) test edilmesi. Strateg DEĞİŞTİRME şematik bir temsiliy. Şekil 1 'de gösterilmiştir, bu yazıda, DEĞİŞTİRME strateji iterasyon tartışılmış ve CDK2 / siklin A uygulama detaylı olarak tarif. CDK'lar, doğrudan veya dolaylı tümörlerinin çoğunluğunda deregüle olduğuna inanılmaktadır ve bu nedenle uygun kanser ilaç hedefleri ⁷ kabul edilir. CDK'lar tam aktivasyon için siklinler ile ilişki gerektiren ve daha sonra hücre döngüsü düzenlenmesinde ⁸ kilit rol oynayan proteinleri fosforile. CDK'ların iki ana grup, hücre döngüsü kontrol noktalarına kontrol izotipleri [G1 / S (CDK4 / Siklin D, CDK6 / siklin D ve CDK4 / siklin E), S fazı (CDK2 / siklin A) ve G2 / M (CDK1 / vardır siklin B)] ve fosforilasyon ile RNA polimerazın regülatörleri (CDK7 / siklin H, CDK8 / siklin C, CDK9 / siklin T). E2F1 transkripsiyon faktörü daha sonra DNA'ya bağlanır ve gen transkripsiyonunu başlatır DP proteini ile bir kompleks oluşturduğunda, S fazındaki ilerlemeden bir anahtar aşama, meydana gelir. CDK2 / siklin A E2F1 transkripsiyonel nötralize etmek için gerekli olanfosforilasyon yoluyla aktivite bu şekilde E2F1-DP kompleksi ve daha sonraki bozulma serbest yol açar. CDK2 / siklin A inhibisyonu DNA'sı bağlı durum, kalıcı aktivasyonuna yol içinde E2F1 muhafaza inanılmaktadır. E2F-1 aktivitesi elde edilen seviye, bir terapötik strateji öne p53 bağımsız apoptoz indüklemek için gereken eşik aşacak. Nedeniyle E2F-1 deregüle p53 ve pRb yolları, yüksek düzeyde çoğu zaman tümörler içinde seçici apoptosise yol açacaktır kanser hücreleri ve CDK2 / siklin A inhibisyonu ortaya çıkar ve geçerli bir kanser hedef ⁷ olarak kabul edilebilir.

Klinik olarak incelenmiştir CDK inhibitörleri, insan kinome den büyük 500 protein kinazlar arasındaki reaktivite çapraz gelen, yüksek düzeyde korunan ATP bağlama bölgeleri hedeflemek ve potansiyel etkileri ve toksisiteyi ⁹ yan yol açan. Alternatif bir yaklaşım CBG aracılığıyla substrat işe hedefleyerek olmayan ATP rekabetçi inhibisyonusiklin pozitif düzenleyici alt birimi mevcut ve bu nedenle farklı ve site ^10,11 ATP bağlama uzak olan. CBG esas siklin A, siklin D ve siklin E içinde bulunması, bir hidrofobik oyuk olup substratlar ve tümör baskılayıcı bulunan bir konsensüs sekansı tanımak için gösterilmiştir. Izole edilmiş bir peptit olarak, siklin bağlanma motifinin (MBP) CBG bağlanır ve hücre döngüsü CDK kinaz aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. MBP İlaçla için molekül ağırlığının arasında iyi bir denge gösteren bir pentapeptid için ayrıca kesik (HAKRRLIF, CDK2 / siklin A IC ₅₀ 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / siklin D _IC50 0,88 ± 0,34 uM) bir oktapeptit ve optimize edilmiştir benzerlik ve gücü (RRLIF, CDK2 / siklin A IC ₅₀ 1.01 ± 0.17 uM, CDK4 / siklin D, _IC50 25,12 ± 2,97 uM) ^12,13. CBGs bir acidi tarafından köprülü büyük bir birincil ve ikincil küçük hidrofobik cebine oluşurc bölgesi (Glu220, Glu224 ve Asp283 içerir). HAKRRLIF anahtar bağlayıcı belirleyicileri asidik bölge ve primer lipofilik site Leu6 ve Phe8 tamamlayıcılık bir yüksek derecesi ile Lys3, Arg 4 ve Arg5 ikincil hidrofobik cep, iyon eşleştirme ve hidrojen bağları ile Ala2 etkileşimini içerir. Ile7 primer cebine en uygun temas sağlayan bir ara tortu olarak hareket Buna ek olarak, çok sayıda hidrojen bağları peptit omurgasından katkıda bulunmaktadır. Bağlanma modu ve CBG ile HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 'de gösterilmiştir.

MBP / CBG, protein-protein etkileşimi hedefleyen CDK2 / siklin A, CDK2 / siklin E ve CDK4 / siklin D kinaz aktivitesini inhibe eden ve normal hücreleri ⁷ etkilemeyen bu E2F1 kanser hücrelerinin apoptozu tetiklemesi. MBP türetilmiş peptitler hücre döngüsü CDK etkili inhibitörleri olan, ancak, bunların nedeniyle metabolik ilaç olarak faydalı olması muhtemel değildiristikrarsızlık ve hücre geçirgenliğini genel eksikliği. Bu amaçla, CDK2 / siklin üzerinden bir inhibisyon deregüle E2F1 istismar anti-tümör tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla ilaç benzeri bileşikler içine bu güçlü peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için DEĞİŞTİR strateji uyguladık. Aşağıdaki protokol siklin oluğuna REPLACE uygulamasında tamamlanmıştır çalışmalarını özetlemektedir. İlk olarak, HAKRRLIF N-terminal tetrapeptid ilaç-benzeri başlık grubu değiştirmeleri tespit edilmiştir. Bundan başka, bu grupta gelişmeler DEĞİŞTİRME için ek bir doğrulama araştırıldı. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar Örnek sunulmaktadır.

Protocol

Potansiyel Küçük Molekül Kapak Kapatma Gruplarının 1. Hesaplamalı Tanıtımı

Not: Prensip olarak, yerleştirme veya farmakofor ara çeşitli yöntemler potansiyel kapatma gruplarını tahmin etmek için de kullanılabilir. DEĞİŞTİRME hesaplama çalışmaların amacı, ikame edilmiş amino asitlerin özelliklerini ve etkileşimlerini muhafaza eden küçük moleküllerin tespit etmektir.

1. LigandFit yerleştirme protokolünün ¹⁴ Doğrulama

Not: Daha önceki çalışmalarda, yerleştirme yöntemi (LigandFit ^15, moleküler modelleme programı takımında bir modül, Discovery Studio 3.0) bu algoritma bilinen Ncaps bağlayıcı modlarını çoğaltmak ve sonuçlar elde göstermek için yeterli olduğundan emin olmak için doğrulandı bilinmeyen bileşikler ¹⁴ tahmini vardır.

1. Aşağıdaki adımları (1,2-1,5) kullanılarak aşağıdaki gibi LigandFit için optimal parametreleri tespit: PLP1 enPoz nesil, oluşturulan pozlar azaltılması ve pozlar analizi için PLP1 puanlama fonksiyonu için ji ızgara.
2. Elde edilen konformasyonlar sınırlamak ve kaplanmış peptidin kovalent bağ oluşumu için uygun ligandlar konumlandırmak amacıyla, hidrojen bağları için etkileşim filtre sırasıyla Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın.
3. Tasarım ve A reseptörü (2UUE) siklin / CDK2'nin içine fragmanı alternatifleri bir kütüphane rıhtım. Sentez ve PLP1 puanlama, CBG ile etkileşim filtreleri ve tamamlayıcılık ile etkileşim dayalı ticari kaynak potansiyeli kapak kapatma gruplara öncelik. Aşağıdaki gibi LigandFit yerleştirme için gereken çeşitli adımlar vardır.

2. Reseptör bağlanma sitesi ¹⁴ Hazırlanması
   1. Yazılımda bir görselleştirme penceresine: CDK2 / siklin A kristal yapısı (2UUE pdb id) İthalat. Bu yapı, daha önce tanımlanmış olan FLIP ihtiva 5-metil-1-fenil-1 H-1, 2,4-triazol-3-karboksamido (3,5-DCPT) RLIF siklin yivine bağlıdır (Şekil 3).
   2. Sil veya yerinde kalıntıları RLIF (C-terminali) tutmak. Peptit sekansı muhafaza edildiğinde, ligand için etkileşim filtresi olarak peptidin N-terminal amino grubu kullanılır. "Reseptör-ligand etkileşimleri" araçlardan, N-cap Göster / Gizle sitesi alandan 3,5-DCPT etrafında bir küre oluşturun. Küre ligand-reseptör etkileşimleri bağlanması esnasında oluşmasına izin verilir bağlanma yeri aktif bölgeyi tanımlamak için oluşturulur.
   3. "Seçilen ligand hacmi olarak bulabilirsiniz sitesinden" dan daha bağlanma bölgesini tanımlar ve proteinden Ligandı 3,5-DCPT silin. Oluşturulan alanı içinde bağlayıcı hacmini tanımlamak için bu adımı uygulayın.
   4. Hidrojen bağlanması için etkileşim filtreleri olarak artıkları Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. Etkileşimi filtreleri ayarlama böylece bütünleşmesini yalnızca pozlarset kalıntılarının atomları ile ract nedenle demirledi pozlar önemli etkileşimleri koruyarak yerleştirme sürecinde filtre edilecektir.
3. Ligandlar ¹⁴ Hazırlanması
   1. Molekül ağırlığı 500'den daha az ikincil cebinde kesik peptit ve van der Waals etkileşimleri için uygun hidrofobik grupların (ikame edilmiş fenil grubu) dahil edilmesi ile ligasyon için bir karboksilat grubun varlığı da dahil olmak üzere ölçütlere göre 100 potansiyel kapaklama gruba kütüphane Tasarım Tablo 1 'de gösterilmiştir.
   2. Trp217 ve ikame edici ile peptid, hidrojen bağı etkileşimlerini almışlardır heterosiklik halkalar seçin HAKRRLIF arasında bazik yan zincirler, iyon-çiftlenmesi etkileşimlerini değiştirmek için dahil. Karbonil oksijen ile bir kaynak peptidin (Tablo 1) 'de peptit omurgasına benzeyen Gln254 amid azot atomu ile etkileşime girebilir, böylece ilgili aldehid moleküller olarak ligandları bağlantı istasyonu.
   3. Önce docKral, düşük enerjili konformasyon için tasarlanmış ligandların en aza indirmek ve "ligandlar hazırlayın" protokolünü kullanarak uygun bir iyonizasyon devlet hazırlar. Beraberlik ve yazılım içine ithal edilen bir tablo için ChemDraw'a içinde .sdf dosyası biçiminde bu potansiyel N kapaklar ihracattan önce.
      Not: ligandlar protokolünü hazırlayın tüm ligandlar en aza indirmek için kullanılan en düşük enerji durumlarına demirledi edilecek ve iyonizasyon ücrete atomların uygulanmıştır. Varsayılan parametreler bu aşama için kullanılır.
4. Siklin A Groove ¹⁴ ligandlann Yerleştirme
   1. Yazılımın reseptör-ligand etkileşimleri protokolü setinden LigandFit rutin seçin. Reseptörü ve bu protokol için girdi olarak hazırlanmış ligandlar kullanın.
   2. Enerji şebekesine olarak bu çalışır seçkin PLP1 için, bu enerji minimize olacak pozlar ve 10 olarak oluşturulan pozlar sayısı varsayılan değerlerine tüm diğer parametreleri bırakın belirtin.
      Not: LigandFit olduğuMonte Carlo yapısal arama algoritması ile kombine bir şekil tabanlı karşılaştırma filtre kullanarak bir proteinin aktif site ile yüksek tamamlayıcılık ve potansiyel yakınlık pozlar tanımlamak ve üretebilir bir yerleştirme yöntemi. Yerleştirme programı tarafından kullanılan enerji ızgara ligand-reseptör etkileşimleri ve potansiyel pozlar üretmek için güç alanıdır. PLP1 özellikle hidrojen bağlayıcı etkileşimleri önceleyen ve parçalı lineer potansiyeli PLP atom türü her hidrojen olmayan ligand atom veya hidrojen olmayan reseptör atomu için tahsis nerede.
5. Sonuçların analizi
   1. İlk etapta, ekran PLP1 puanı değerlerini azalan göre sıralama sonra visualizer programında pozlar ve. Aday ligand göre yerleştirilmiş bir ligandın bağlanma afinitesi, hedef reseptör yapısı ile geometrisi ve kovalent olmayan bir etkileşim teşkil tahmin etmek için örneğin PLP1 skorlama fonksiyonlarını kullanın.
      Not: Burada PLP1 puanlama fonksiyonu g bulunduhidrojen bağının tahmini içerdiğinden en iyi sonuçları ive.
   2. Bilinen kapama grubuna değerini en az 2 Å (göreceli ortalama kare sapma (RMSD sahip)) ile görsel 1 için attı pozlar üst% 25 analiz) ile üst üste, 2) siklin yivli etkileşim filtreleri ve 3) görsel tamamlayıcılık yerine . O kabul edilen bir doğru (bir deneysel yapıya kıyasla) poz demirledi <2 Å bir RMSD değerine sahiptir.
   3. Bilinen yapı-aktivite ilişkileri ile tutarlı bir şekilde, bağlama cebinin etkin dolgu maddesine sahip olarak tanımlanır, görsel tamamlayıcılığı için pozlar inceleyin. Etkileşim filtreleri bağlanması ve / veya amid bağı oluşumu için uygun geometride bir potansiyel kapama grubunu yerleştirmek için gerekli olan kritik olduğu bilinen, moleküller arası temas gerektiren atomu kısıtlamaları dahil etmek için ayarlanır. Interactio ile hidrojen bağı oluşturur potansiyel N-kapatma grupları yerleştirilmiş pozlar üç örnekn adet filtre, Şekil 4'te gösterilmiştir.

2. Sentezi ve Potansiyel N -capping Gruplar Karakterizasyonu

1. N-kapatma grupların sentezi.
2. Elde edilen sentezi için, ticari başlangıç ​​materyalleri, solvent ve reaktifler kullanılır. Geleneksel sentetik organik kimya (bir örnek için Şekil 5, ^12,13) ​​ile potansiyel N-kapatma gruplarını sentezleme.
3. Reaksiyonları izlemek için, silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi (TLC) uygulayın.
   1. Mobil faz olarak bir başlangıç ​​materyali reaksiyon karışımı (1 mg) çözündürün ve kılcal borular kullanılarak TLC plakası üzerinde nokta onları.
   2. (A 35:65 oranında etil asetat ve heksan), mobil faz içeren bölmeye TLC plaka koyun. Mobil faz TLC plakası% 90 ulaştığında, kaldırmak ve hava plakasını kurulayın.
   3. Görünür noktalar olarak başlangıç ​​malzemesi ve reaksiyon karışımları tespit etmek için UV ışığı kullanın. CalBütün noktalar R _{f (nokta} ve mobil faz mesafenin oranı) hesaplanmalıdır.
      Not: başlangıç ​​malzemesinin _Rf görülen hiçbir yerinde olduğu zaman, reaksiyon tamamlanmıştır.
4. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, sulu bir asit veya baz çözeltisi ile bir ayırma hunisi ve yıkamada yerleştirerek reaksiyon karışımı kadar çalışır. Vakum altında elde edilen ham ürün, organik çözücü madde döner bir buharlaştırıcı içinde toplamak buharlaştırılmak ve kurutun.
5. Uygun bir çözücü, 3-5 ml ham ürün, 500 mg çözülür ve silika ya da RP 18 Samplet bir 1 g eklemek ve hava altında kurutulur. Silis / RP SNAP flaş kartuşlarında ham ürün ihtiva eden Samplet yerleştirin ve% 6 etil asetat ile başlayarak gradyanı çalışma ile SNAP 100 g kolonu kullanılarak (üreticinin protokolüne göre) otomatik yüksek performanslı flaş kromatografisi kullanılarak ham materyal saflaştırılması: 94 % 50% etil asetat heksan ve tekrar% 50 hekzan15 kolon hacmi.
6. Kuruyana kadar tüm çözücüyü buharlaştırarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak hızlı kromatografi ile ilgili çözücü içinde toplanan saflaştırılmış ürün kurutulur ve daha fazla kalan tüm çözücüleri uzaklaştırmak için vakum altında ürün kurutulur. NMR, MS ve analitik HPLC ile arıtılmış ürünün karakterizasyonu gerçekleştirin.
   1. ^1H NMR ve ^{13C NMR} için, saflaştınlmış numuneye yaklaşık 10 mg ağırlığında uygun bir deuteratlanmış çözücü içinde çözünmesi, ve NMR spektrumları ^2,14 kayıt için kuru bir NMR tüpü içeriği aktarın.
   2. ¹ H NMR ve yüksek alan NMR Spektrometresi (en az 300 MHz) ile ¹³ ° C NMR spektrumları kaydedin. Bir QTOF (uçuş kütle spektrometresi Tandem dört-1 defa) kullanarak kütle spektrumları, elektrosprey iyonizasyonu (ESI) veya VG 70S Edinme (Çift odaklama manyetik sektör kütle spektrometresi, EI) ^2,14.
   3. Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile ürünlerin saflığını analiz ile donatılmışBir C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 um analiz sütunu. 30 dakika boyunca% 60 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 100 su (% 0.1 trifloroasetik asit) başlanarak gradyanı çalıştırmak kullanarak ve 4 dk için gradyanı tutun. 226 ve 254 nm ^2,14 olarak kromatogramlar ayıklayın.
      Not: değerlendirildi bileşiklerin analitik saflık>% 95 idi.

Döndürür ² Üretimi için 3. Katı Faz Sentezi

1. N-kapaklı çevirir sentezi
   1. Aşağıdaki adımları kullanılarak standart katı faz sentez yöntemleri ile N-uçlu peptidik bileşikler bir araya getirin.
      1. 2 ml O -Benzotriazole- N, N, N ', N-tetrametil-uronyum-heksafluoro-fosfat (HBTU, 221,93 mg) 4,4 eşdeğer olarak C-terminal amino asit (Fmoc-Phe) 5 eşdeğer etkinleştirme 5 dakika boyunca, DMF. Diizopropiletil amin 6 eşdeğer kullanılarak Rink reçine üzerine Fmoc-Phe HBTU karıştırılmalıdır (DIPEA, 103,13oda sıcaklığında 1 saat için mg) eklenmiştir.
      2. 10 dakika boyunca 3 ml DMF içinde% 20 piperidin kullanılarak C-terminal tortusu Fmoc koruma grubunun çıkarılması. Çift sonraki amino asitler (örneğin, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) adım adım. Her bir adımda, DIPEA (103,13 mg) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanarak bir sonraki amino asidin çift 5 eşd.
      3. Yıkama döngüleri, yukarıda tarif edilen bir amino asit birleştirme ve koruma giderme adımları sonra Fmoc DMF (DCM + 5 x 10 ml 5 x 10 mi) uygulanır. Peptit montajı kurulduktan sonra, çift, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde DIPEA (103,13 mg) ve HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanılarak gruplar N-kapatma.
      4. Peptidin montajının tamamlanmasından sonra, bölme karışımı 2 ml reaksiyon karışımı tedavi (: 5: 90 5 TFA / _H2O / TIPS) O / N yan zincir koruyucu gruplar çıkarmak ve ayırmak reçineden çevirir. Soğuk dietil çökeltilmesi için eter ve I 'ile elde edilen ürünün toz haline getirinBir döner buharlaştırıcı içinde f gerekli konsantresi.
2. N-başlıklı-C-başlıklı çevirir sentezi
   1. O ile birlikte (16.1 mg, 0.02 mmol) diklorometan içinde ve ek [4- (3-klorofenoksi) piridin-2-il] metanamin (Cı-kapak) tartılır ve N-terminal olarak kapatılmış ve korunan Arg-Leu peptidi eritmek - benzotriazol-, N, N, N ', N' -tetrametiluronyum heksaflorofosfat (HBTU; 16.7 mg, 0.02 mmol) ve N, N-diizopropiletilamin (DIPEA, 6.5 mg, 0.02 mmol) eklenmiştir.
   2. Karıştırın ve TLC / HPLC, başlangıç ​​materyalinin tamamen tükendiğini gösterene kadar oda sıcaklığında reaksiyonu izleyin. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, etil asetat ve su arasında döner bir buharlaştırıcı ve daha sonra bir bölüm ile ham tepkime karışımı konsantre hale getirin.
   3. Sulu ve organik tabaka ayrılır; 1 N NaOH, 1 N HCI ve tuzlu su ile organik tabaka yıkayın. Sodyum sülfat ile yaklaşık 1 g organik katman kurutulur ve döner bir buharlaştırıcı içinde ürün konsantre edilir. Fina(: 2.5: 2.5 trifluoroasetik asit / H _{2 O} / İPUÇLARI 95) korumanın kaldırılması için Lly bölünme karışımı ile ürün O / N davranın.
   4. Soğuk dietil eter ile ve döner bir buharlaştırıcı içinde gerekli olan tüm çözücünün konsantre çıkarılması için tamamen kuruluk derecesinde şekilde elde edilen ürün toz haline getirin. Bundan başka, tüm çözücü kalıntısını uzaklaştırmak üzere, vakum altında ürün kurutulur.
3. Arıtma ve döndürür karakterizasyonu
   1. Yarı preparatif ters-faz HPLC yöntemleri kullanılarak ham olarak döndürür arındırın. Arıtılmış döndürür liyofilize ve kütle spektrometresi ^2,14 kullanarak molekül kütlesi karakterize eder.
   2. Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile döndürür ve analitik saflıkta belirlemek 250 x 4.6 mm, 5 um kolonu, bir C 18 (2), 100 A ile donatılmıştır. % 95 _H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 5 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 35 _H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 65 asetonitril (% 0.1 trifluoroace başlayarak gradyanı yöntemi kullanın-asetik asit), 30 dakika boyunca, 4 dakika boyunca gradyanı tutun. Özü 226 ve 254 nm 'de kromatogra-.

Rekabetçi ^2,14 Bağlama Tayini İçin Bağlanma Tahlili 4. Floresan Polarizasyon

1. Siyah 384-kuyu (138 ul) aşağıdaki prosedürü kullanarak plakalarda tahlil gerçekleştirin.
2. Örnekleri, izleyici peptidleri (4 nM), ve kinaz kompleksleri seyreltin (CDK2 / siklin A - 18 ug / ml, CDK4 / siklin D - 37 ug / ml), deney tamponu (25 mM HEPES pH 7, 10 mM gerekli olan konsantrasyonlara NaCl,% 0.01 Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT).
3. 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, eklemek: CDK4D1 ya CDK2CA (0,3 ug / kuyu saflaştırılmış rekombinan insan kinaz kompleks), 5 ul bileşik çözeltisi, 30 nM izleyici peptid (fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val 5 ul 5 ul -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly ya fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracer peptid). Her bir DMSO (% 6), Buffe 5 ul kullanınr, radyoaktif izotop ve 5 ul DMSO (% 6), kinaz kompleksi, kontrol çukurları olarak izleyici
4. Tüm bileşenler ilave edildikten sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca (41,16 xg) 500 rpm'de plaka santrifüj ve daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika boyunca çalkalama ile plaka kuluçkalayın. 485 nm / 535 nm eksitasyon / emisyon filtresi ve dikroik ayna ile donatılmış bir çok modlu bir plaka okuyucusu ve detektörü kullanılarak kuyulu bir levhadaki her Floresein yoğunluğu okuyun.
5. Aşağıda gösterilen eşitlik kullanılarak tüm test örnekleri için göreceli ortalama kutuplaşma (mp) hesaplayın. Göreceli milletvekillerini ilişkilendirilmesi ve konsantrasyonları test ederek Yatırım Ortamı logaritmik regresyon ile ₅₀ değerleri belirlemek.

Results

Siklin yivli HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 de gösterilmiştir. Temel bağlama determinantları olarak temsil peptit tortuları başka kalıntılar küçük katkılar ^12,13,18 sağlayan Ala2, ARG4, Leu6 ve Phe8 bulunmaktadır. Bu vaka çalışmasında DEĞİŞTİRİN strateji öncelikle Ala2 ve ARG4 etkileşimlerini taklit HAKRRLIF N-terminal tetrapeptidde kalıntılar için fragman alternatifler bulmak amacıyla kullanılmıştır. Potansiyel UKEP parçalarının (Tablo 1) ihtiva eden bir kütüphane ölçütleri...

Discussion

İlaç keşfinde protein-protein etkileşimlerini (PPI) hedeflemek oldukça zordur, çünkü bunlar tipik olarak çok sayıda ve yaygın temastan oluşan büyük bir sığ temas arayüzü içerir¹⁹. Ayrıca, ilaç keşfine uygun PPI'ları inhibe eden peptidik bileşikler, daha yüksek moleküler kütleleri, metabolik dengesizlikleri ve zayıf biyoyararlanımları nedeniyle sorunludur²⁰. ÜFE inhibitörlerinin geliştirilmesi için uygulanan mevcut stratejiler, proteomimetiklerin tasarımını ve fragman tabanlı tasarımı içerir. Proteom...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hesaplamalı Kimya
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex İş İstasyonları
Synthetic Organic Chemistry<
Floresan Polarizasyon Testi
>384 mikro kuyu plakaları, Mikro pipetler	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 ve CDK2CA (iyi saflaştırılmış rekombinant insan kinaz kompleksi)	BPS Bio Sciences	40094 (CDK4 / Cyclin D), 41101 (CDK2 / Cyclin A)
tahlil tamponu (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl,% 0.01 Nonidet P-40, 1  mM ditiotretiol (DTT))
25 nM HEPES	CALBIOCHEM
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	ABD Biyolojik	N3500
DTT	Aldrich-70
&# 176; C dondurucu	Revco (Ultima II)
DTX880 çok modlu dedektör 485  nm/535  nm uyarma/emisyon filtreleri ve floresein için uygun dikroik ayna	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 kuyulu plakalar	Fisher
U2OS (osteosarkom) ve DU145 (prostat kanseri) hücre hatlarının dondurulmuş stokları	ATCC
NU serumu, DMEM ortamı, tripsin, PEN/STRIP, MTT reaktifi	Fisher, Yaşam teknolojisi, Alfa Aesar
Hemositometre	VWR-70
& # 176; C dondurucu	Revco (Ultima II)
Kuluçka makinesi	Termo elektron şirketi
Santrifüj	Eppendorf	5804 R
Buzdolabı 4-8 & # 176; C	Isotemp Fisher
DTX880 çok modlu dedektör 595  nm filtresi	Beckman Coulter, Brea, CA