Yöntem makalesi

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma'nın Roman modelleri oluşturmak için

DOI:

10.3791/52443

⸱

22 Şubat 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, University of Michigan School of Medicine, 3Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak yeni glioblastomları (GBM) indüklemek, izlemek ve analiz etmek için verimli ve çok yönlü bir protokolü açıklıyoruz. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histo-patolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erişkinlerde en sık görülen primer beyin tümörü olan insan glioblastomlarının (GBM) patogenezine ve ilerlemesine yeni genlerin katkısını test etmek için acil bir ihtiyaç vardır. Yeni potansiyel tedaviler hızla tezgahtan ortaya çıkıyor ve insan hastalığının göze çarpan özelliklerini yakından yeniden üreten deneysel modellerde sistematik testler gerektiriyor. Burada, plazmit DNA'nın yenidoğan farelerin subventriküler bölgesinin hücrelerine transpozon aracılı entegrasyonu ile yeni GBM modellerini indüklemek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak genomik entegrasyona uygun yeni transpozonları klonlamanın basit bir yolunu sunuyoruz ve biyolüminesans, histoloji ve immüno-histokimya kullanarak plazmit alımının ve hastalık ilerlemesinin nasıl izleneceğini gösteriyoruz. Ayrıca yeni birincil GBM hücre hatları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz. İdeal olarak, bu rapor, Uyuyan Güzel transpozon sisteminin beyin tümörü araştırmacıları arasında daha fazla yayılmasına izin vererek, GBM patogenezi ve ilerlemesinin derinlemesine anlaşılmasına ve hastalar için etkili tedavilerin zamanında tasarlanmasına ve test edilmesine yol açacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerrahi, radyasyon tedavisi, kemoterapi ve 1 ile tedavi edildiklerinde glioblastoma multiforme (GBM) 15-21 aylık bir medyan sağkalım, erişkinlerde en sık (% 60) primer beyin tümörü olduğunu. GBM için yeni tedaviler zorunludur. Deneysel tedaviler yeterince insan hastalığının belirgin özelliklerini yeniden hayvan modellerinde test gerektirir. Kemirgenler glioma hücre hatları 2 kullanılarak kimyasal alkilleyici ajanlarla mutagenezini, mikrop hattı veya somatik genetik değişiklikler, ya nakli dahil Stratejiler GBM ikna etmek. En yaygın olarak kullanılan model, beyin içine veya deri altına aynı genotipe sahip hayvanlarda singeneik hücreleri kullanıla....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm hayvan protokolleri Hayvanlar Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) tarafından onaylanmıştır.

Yeni Uyuyan Güzel transposonların içine İlgi Sıra 1. Klonlama

NOT: genleri veya Sleeping Beauty transposaz sistemini kullanarak (shRNA gibi) önleyici unsurlar eklemek için, bir pkt veya pT2 plazmid omurgası haline ilgi dizisi klonlamak. Klonlama yönlendirin düzenleyici elemanlar, faiz ve belirteçlerin gen ters tekrarlar (IR / DR) tarafından çevrili kalmasını böyle. Aşağıda ayrıntılı bir PKT omurgasına PDGFβ klonlama bir örneği (bakınız ayrıca Şekil 1b).

  1. Reaksiy....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SB-kaynaklı glioblastomlar histo-patolojik özellikleri karakterize etmek için, C57 / BL6 fareleri, neonatal plazmidler onkojenik DNA, örneğin, NRAS (Pt / CAGGS ile transpozonlar kodlayan ile kombinasyon halinde bir plazmid kodlayan lusiferaz (pT2 / SB100x-Luc) ile P1 enjekte edilmiştir -NRASV12) SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Şekil 3c) veya PDGFβ ile kısa saç tokası p53 ve NRAS (Şekil 3d ile kombinasyon halinde bir GFP raportör (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) kodlayan bir plazmid). Ha.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, biz detay yenidoğan farelerin subventriküler bölgesini çevreleyen hücrelerin içine onkojenik plazmid DNA SB transposase- aracılı entegrasyon kullanarak GBM yeni modeller üretmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem. Biz yeni ilgi genleri ile Transposon plasmidlerini oluşturmak için bir protokol mevcut, canlı hayvanlarda tümörlerin ilerlemesini izlemek için nasıl, bu tümörlerin histopatolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize nasıl göstermektedir.

Laboratuarı.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. John Ohlfest ve Dr. Stacey Decker'a13 cömert plazmid armağanı ve bu yöntemde ustalaşmak için verilen eğitim için teşekkür ederiz. Parafine gömülü bölümlerin Hematoksilen-Eozin boyama prosedürünün standardize edilmesine yardımcı olduğu için Marta Dzaman'a teşekkür ederiz. Ayrıca bu el yazmasını incelediği ve yararlı önerilerde bulunduğu için Molly Dahlgren'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, MGC ve PRL'ye NIH/NINDS hibeleri, MCG ve PRL'ye Leah's Happy Hearts Foundation hibesi ile desteklenmektedir. Alex'in Limonata Vakfı genç Araştırmacı Ödülü ve St. Baldrick's Vakfı CK'ye bursu.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Stoelting'in Sıçan ve Fare Adaptörlü Laboratuvar StandardıStoelting51670Diğer şirketler de benzer çerçeveler üretiyor, bunlardan herhangi biri küçük fare adaptörlerine sahip 
Özetin Özeti Stereotaksik Enjektör (QSI)Stoelting53311Enjeksiyonlar onsuz yapılabilir, ,ama      otomatik enjektör daha fazla tekrarlanabilirlik ve rahatlık sağlar
10 & mu; l 700 serisi elle takılan MİKROLİTE şırıngaHamiltonModel 701Bu şırınga modeli, 0,5 ila 500 ul çözeltiyi güvenilir bir şekilde teslim edecektir. Diğer sistemler (fro örnek 5 ul, Model 75) ayrıca
30 gauge hipodermik iğne
(1.25", 15o< / sup> eğimi) de kullanılabilir;		HamiltonS/O# 197462Bu iğne, diğer invaziv prosedürlere ihtiyaç duymadan yenidoğan bir farenin derisini ve kafatasını delmek için idealdir. Donuklaşırsa (cilde kolayca girmezse), değiştirilmesi gerekir.
in vivo-jetPEIPolyplus Transfeksiyon201-10GAliquot küçük hacimlerde ve -20 oC 'de tutun;
D-Luciferin, Potasyum TuzuGoldbio.comLuckK-1gDiğer ateşböceği lusifierase kaynakları da aynı derecede yeterlidir
Hematoksilen Çözeltisi, Harris ModifiyeSigma AldrichHHS128-4L
Doku-Tek OCT Bileşik ElektronMikroskobu Bilimleri62550-01Kriyoseksiyon ve immünohistohemistri için beyinleri gömmek için
Gelişmiş DMEM/F-12, glutamin yokHayat Teknolojiler12634-010Nörosfer kültürü için
B-27¨ Takviye (50X), serumsuz Yaşam Teknolojileri17504-044Nörosfer kültürü için serumsuz takviye
N2 Takviyesi (100x)Yaşam Teknolojileri17502-048Nörosfer kültürü için serum içermeyen takviye
NormocynInvivoGenant-nr-1Nörosfer kültürü için anti-mikoplazma ajanı
Rekombinant İnsan EGFPEPROTECHAF-100-15Kültür için büyüme faktörü takviyesi  nöroküreler
Rekombinant İnsan FGF-temelPEPROTECH100-18BNörokürelerin kültürü için büyüme faktörü takviyesi <
Hücre Ayırma Reaktifi Thermo ScientificSV3003001Nörosferlerin ayrışması için
Kimble-Chase Kontes Pelet HavaneliFisher ScientificK749510-0590Yeni diseke edilmiş tümörlerin ayrışması için
Falcon Hücre Süzgeçleri ağ boyutu 70 umFisher Scientific08-771-2Ayrışmış nörosferlerin tek hücreli süspansiyonlarını oluşturmak için
Ksilenler Histolojik sınıfFisher ScientificC8H10
Protokolü Harris Hematoksilen Cıva içermez (asitleştirilmiş)Fisher Scientific245-678
Protokolü Eosyn Y Çözeltisi (yoğunlaştırılmış)Fisher Scientific314-631
td colspan="4">[header]HyClone HyQTase 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
  2. Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
  3. Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Ri....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plazmid DNA EnjeksiyonuGlioblastoma ModelleriSleeping Beauty SistemiBiyol minesans G r nt lemeHistolojik Analizmm nohistokimyaPrimer H cre Hatlar

İlgili makaleler