Yöntem makalesi

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

DOI:

10.3791/52451

⸱

19 Nisan 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina hastalığının hayvan modellerinde kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü araştırmak için, retinal nöronları ve gliaları etiketlemek için araç olarak birkaç adeno-ilişkili virüs (AAV) varyantı kullandık. Virüs aracılı raportör gen ekspresyonu daha sonra retinal bariyer geçirgenliğinin bir göstergesi olarak kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Müller hücrelerinin retina ana glial hücreler bulunmaktadır. Bunların son ayak, dış ve iç sınır membran (ILM) retinanın sınırlarını oluştururlar ve astrositler, perisitlere ve endotelyal hücreler ile bağlantılı olarak, kan-retina bariyerini (BRB) oluşturmaktadır. ILM retina ve vitreus boşluğuna arasında histolojik sınırı tanımlayan bir bazal membran gibi davranır ise BRB kan ve retina arasındaki malzeme taşıma sınırlar. Müller hücrelerinin etiketlenmesi bu hücreler BRB ve ILM ayrılmaz bir parçası olarak, retina bariyerinin fiziksel durumunu incelemek için özellikle önemlidir. BRB ve ILM Hem sık retina hastalığında değişmiş ve hastalık belirtileri sorumludur vardır.

Böyle Evans mavisi deney veya floresein anjiyografi gibi brb bütünlüğünü incelemek için birkaç köklü yöntemler vardır. Ancak bu yöntemler BRB geçirgenlik t ölçüde bilgi vermemektedirnanometre aralığı içinde daha büyük moleküller, o. Ayrıca, böyle ILM gibi diğer retina engellerin durumuna ilişkin bilgi vermemektedir. Retina ILM ile birlikte BRB geçirgenliğini incelemek için, hastalık durumlarında ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin durumunu gösteren ancak daha büyük moleküllere BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi sağlayan bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. AAV5 Fotoreseptörlerin için doğal bir tropizm vardır ama ILM sağlam olduğunda (vahşi tip retina yani) vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 glial hücrelerine karşı güçlü bir tropizm vardır ve seçici sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller glia etiketleyecektir. ShH10 ILM tehlikeye retina daha verimli gen teslim sağlar. Immunohistokimyası ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral hastalığın araçlar retina engellerin durumuna da ışık tutacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Müller hücreleri retinanın büyük glial bileşenidir. Morfolojik, onlar, vitreus ile temas radyal retina ve endfeet, yayılan ILM ve ikinci gizli bileşenleri karşı karşıya. ILM on farklı hücre dışı matris proteinleri (laminin Agrin, perlekan, nidojen, kollajen ve çeşitli heparin sülfat proteoglikanlar) oluşan bir taban zarıdır. Gelişimi sırasında, kendi varlığı ganglion hücrelerinin 1-3 retina histogenezisleri, optik akson navigasyon, ve hayatta kalmak için vazgeçilmezdir. Ancak, ILM yetişkin retinada önemsiz olduğunu ve cerrahi retina hasarı 4 neden olmadan belirli patolojilerin kaldırılabilir. Gen terapisi, bu membran intravitreal enjeksiyonu 5 ile AAVS kullanarak retinanın verimli iletimi için fiziksel bir bariyer haline gelir.

Süreçlerini geniş arborization sayesinde, Müller hücreleri beslenme ve düzenleyici Suppo sağlamakoda sıcaklığı, retina nöronlarının ve vasküler hücrelerin hem de. Müller hücrelerinin de BRB 6 oluşumu ve bakım, retina homeostazının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Sıkı bağlantılar retina kapilar endotelial hücreler arasında, Müller hücrelerin, astrositlerin ve perisitler BRB oluştururlar. BRB diyabetik retinopati, retina ven tıkanıklığı ve solunum yolu hastalıkları gibi birçok hastalığın retina.In girmesini bazı maddeler önler, retinanın hipoksi BRB 7-9 ile sızıntı neden olur. Bu yırtılma vazojenik ödem, retina dekolmanı ve retina hasarına yol açan damar geçirgenliği bir artış ile ilişkilidir.

Müller hücrelerinin sıkı hem BRB ve ILM bütünlük içinde önemli bir rol oynayan, kan damarları ve bazal membran ile ilişkilidir. Sonuç olarak, Müller glial hücreler etiketleme bu retina engellerin fiziksel durumunun çalışmaya özellikle önemlidir.

Klasikortağı BRB geçirgenliği plazma albümini ile kovalent olmayan bir şekilde bağlanan Evans mavi boya, sistemik enjeksiyonundan oluşan Evans mavisi analizi kullanılarak ölçülür. Bu tahlil retina içine kan damarlarının 10 (Protokoller Bölüm 5'e bakınız) albumin kaçağı (orta büyüklükte protein, ~ 66 kDa) ölçer. Alternatif olarak, vasküler sızıntı floresan sızıntı doğrulayan floresan retina anjiyografi ile görüntülendi olabilir (küçük molekülü, ~ 359 Da; Protokoller Bölüm 6) 11. Bununla birlikte, her iki yöntem küçük moleküller ve proteinlere BRB geçirgenlik değerlendirilmesini sağlar ancak ILM bütünlüğü hakkında bilgi vermemektedir.

Bu nedenle, BRB geçirgenliğini incelemek için, biz, daha büyük moleküller (örneğin, AAV parçacıklar 25 nm çapında) için BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi veren bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. Nitekim, bizim yöntem öneririz, hangi kan AAV transgen varlığını tespit edebilir ~ 25 nm çapında parçacıkları olurkana sızmak mümkün. Bu yöntem, aynı zamanda patolojik durumlarda ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin yapısı hakkında bilgi içerir. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. Subretinally enjekte AAV5 fotoreseptör ve retina pigment epiteli 12 için doğal bir tropizm var ama sağlam ILM 5,13 ile yabani tip retina vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 özellikle nöron 14,15 fazla glial hücreler hedef için işlenmiş olan bir AAV varyantıdır. ShH10 seçici tehlikeye engelleri 16 retina artan verimlilik ile sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller hücreleri etiketler. Immuhistochemistry ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral araçlar retina engellerin devlet ve hastalık onların katılımı (Şekil 1) hakkında bilgi verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Tablosuna göre bakım ve ele alınmıştır.

HEK-293 hücrelerinden 17,18 süreli transfection ile Rekombinant AAV (rAAV), 1. Üretim

NOT: McClure C, (2011) 19 vallahi bak.

  1. AAV vektörü plazmid geniş ölçekli bir plazmid hazırlama (en az 1 mg / ml) ile saflaştınlır. 3 plazmidler kullanın. AAV ters terminali olmadan çoğaltma ve kapsid genleri taşıyan AAV yardımcı plazmid ITR'ler, AAV ITR transferi plazmid olarak anılacaktır taşıyan transgen ifade kaseti, adenovirüs ve yardımcı genleri E2, E4, ve VA RNA genleri tedarik plazmid sevk edilen tekrarlar pHELPER olarak.
  2. Bu 3 plazmidler polietilenimin (ya da diğer transfeksiyon reaktifi) kullanılarak 293 hücreleri transfekte. Transfeksiyon verimi% 80 üzerinde iyi vi için gerekli olanral verimleri.
  3. Bir iyodiksanol degrade üzerinde 293 hücre lisatlanndan rekombinant AAV arındırın. % 15,% 25,% 40,% 60 iyodiksanol gradyanı elde etmek için kullanılır. AAV parçacıkları ihtiva eden% 40 iyodiksanol fraksiyonu toplamak% 0.001 Pluronic PBS'ye 1 saat karıştırıldı ve tampon değişimi (fosfat tamponlu tuzlu su) için 500,000 x g'de ultrasantrifugasyon sonra fraksiyonu konsantre edilir.
  4. Viral genomik titresi 20 belirlemek için, qPCR ardından DNAz ProteinaseK özet gerçekleştirin. ileri ve geri primerler AAV2 ITR bulunan 62 bp bölgesini yükseltmek. Plazmid standart için, prob FAM ile etiketlenmiş ve (BHQ) söndürücü bir kara delik vardır.
  5. ITR primeri, 100 nM ileri ITR primeri, 100 nM, AAV2 ITR probu, 0.4 mM dNTP, 2 mM MgCI2, 1 x Platin Taq tampon, 1U Platin ters 340 nM kullanılarak 25 ul nihai hacim içinde qPCR (kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu) yapınız Taq ve 5 ul şablonu (standart, numune ve hiçbir şablon kontrolü).
  6. Içinstandart seri seyreltileri ile 10 katı 7 x transfeksiyon için plazmid kullanımı (5 ul 10 Ekim-10 Nisan genomları / ml nihai bir konsantrasyonda elde edilen, 2 x 10 9 3 10 ila 2 x genomları / ml her biri).
  7. Denatürasyon için 40 döngü, ardından 15 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı programı başlayın 1 dakika tavlama / uzatma için 95 ° C 'de 1 dakika süre ile 60 ° C'de ilave edildi. Kısa süreli depolama için veya uzun depolama süreleri boyunca -20 ° C 'de 4 ° C' de muhafaza edin.

AAV 2. Intravitreal

  1. Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile C57BL6J fareler anestezi ve refleks, uygun bir anesthetization gösteren çekme refleksi ve kuyruk kıskaç yanıt doğrultma kaybını kontrol edin. Neosynephrine% 5 kornea uygulama ile öğrencilerin genişletmek ve göz damlası% 0.5 mydriaticum. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze veteriner merhem kullanın.
  2. Bir ultra ince 30 G disposab geçmekle ekvator boyunca iğne ve vitreus boşluğuna, limbusa yanındaki (Chiu K, vallahi (2007) 21). Vitröz kavitesine merkezi iğne, doğrudan gözlemiyle ShH10-GFP veya rAAV5-GFP 1 ila 10 x 4 11 vp ihtiva eden 1 ul stok (Şekil 1) enjekte edilir. ILM deney için bir kontrol olarak, bir göz kullanın. BRB deneyler için her iki gözleri enjekte edilir. Enjekte gözleri bir anti-inflamatuar ve antibakteriyel topikal tedavi uygulayın.
  3. Neosynephrine ile öğrencileri genişletmek ve mydriaticum göz görüntüleme için düşer. GFP (Yeşil Floresan Protein) ifadesi 1 hafta, 2 hafta, 1 ay, intravitreal enjeksiyondan sonra 2 ay (Şekil 1) takip göz fundus kamera ile fundus muayeneleri gerçekleştirin. CO 2 inhalasyon 1 ila 2 ay sonrası enjeksiyon yoluyla fareler Kurban.

3. İmmünohistokimya

  1. Retina cryosections (Şekil 1) için, l kaldırmak için enüklee gözleri teşrih1 saat süresince% 4 paraformaldehit içinde sapiens ve kornea ve daldırma düzeltme.
    1. Oda sıcaklığında 1 saat, oda sıcaklığında bir saat için% 20 sakroz,% 10 sukroz içinde daha önceden belirlenmiş gözleri cryoprotect. Gece boyunca 4 ° C'de% 30 sukroz çözeltisi içerisinde cryoprotect. Freeze ve Cryo-matris olarak reçine gömme eyecups embed. 10 mikron cryosections olun ve özel dondurulmuş doku bölümleri için tedavi slaytlar üzerine monte ve boyama sırasında doku uyumu artırmak.
    2. 5 dakika boyunca PBS pH 7.4 içinde% 0.1 Triton X100 ile bölümleri geçirgenliği. PBS Yıkama 2x ve blok,% 1 BSA ile PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat,% 0.1 Tween 20.
  2. Retina flatmounts (Şekil 1) için, diseksiyon kolaylaştırmak için, 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde enüklee gözleri düzeltin.
    1. 15-30 dakika içinde, kornea ve lens çıkarmak için gözleri teşrih. Ora serrata etrafında keserek retina pigment epiteli (RPE) ve sklera gelen retina ayırın veoptik sinir. Retina ve kalıt retina hücrelerinde floresan proteini (tespit 24 saat aşmamalıdır) sabitlemek için başka bir 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde bırakın. Steril PBS, pH 7.4 içinde 5 dakika yıkanır.
    2. (% 1 BSA,% 2 normal keçi ya da eşek serumu PBS,% 0.5 Triton X-100), bloke edici tampon ile PBS değiştirin ve oda sıcaklığında 4 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de ya da blokaj tamponunda inkübe edilir.
  3. Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de ya da 4 saat süre ile blokaj tamponu içinde primer antikorlar ile dokuların inkübe edin. PBS ile yıkayın 3x.
    NOT: Aşağıdaki olarak kullanılan antikorlar: Anti-laminin (/ 1,000 1) etiketleme ILM anti-rodopsin klon 4D2 (1/500) etiketleme çubuklar, anti-glutamin sentetaz klonu GS-6 (1 / 1.500) etiketleme Müller hücreleri PNA lektin (1/40) etiketleme kozalakları.
  4. Oda Tempe 1 saat (halinde kriyoseksiyonlar) ya da 2 saat (flatmounts) blokaj tamponunda Alexa Fluor konjuge sekonder antikor: 500 oranında seyreltilmiş 1 ile dokuları inküberature ve ışıktan korunan. PBS ile yıkayın 3x.
  5. Retinaya giderici kesim yapmak ve fotoreseptör veya retina ganglion hücre (RGH) iki tarafında yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine flatmount. 4 ° C'de lamel ve mağaza uygulamak, sulu mountingmedium ekleyin.
  6. Lazer tarama konfokal mikroskop konfokal mikroskopi gerçekleştirin. Uyarma ve emisyon karışma azaltmak için, satır görüntüleri sırayla, çizgi edinin. Nyquist-Shannon örnekleme teoremine göre adım boyutunu tanımlayın. Son görüntülerde doygun piksel en aza indirmek pozlama ayarlarını kullanın. Z-proje fonksiyonu altında maksimum şiddeti kullanarak ve nihayet 8-bit RGB renk moduna dönüştürmek tek düzlemde FIJI ile Süreci 12-bit görüntüleri, proje Z-bölümleri.

Fare Kan Örneklerinin 4. PCR Analizi

  1. Anestezi C57BL6J farelerin penil ven içine bir AAV-GFP 1 10 4 x 11 partikülleri içeren 100 ul stok (izofluran% 5 enjekteultra-ince 6 mm'lik bir iğne ile bir insülin şırıngası kullanılarak yakın bir bölmesi içinde indüksiyon ve ameliyat sırasında bir burun konisi ile izofluran% 2,5) dir. Bu hayvan AAV tanecikleri dolaşan bir pozitif kontrol olarak görev yapacak.
  2. Enjeksiyon ve 3 saat, 24 saat, 2 gün ve 3 gün ShH10 intravitreal enjeksiyonu sonrası veya intrapenile enjeksiyon (Şekil 1) önce sonra fare kuyruğu örnek kan. 10-20 ul heparin tüpler toplanır. Prosedürün tamamlanmasından sonra CO 2 inhalasyon fareler Kurban.
  3. Seçtiğiniz ekstraksiyon kiti kullanılarak, kan örneklerinden genomik DNA ayıklayın.
  4. Genomik DNA, PCR amplifikasyon yapın. Bu protokol için aşağıdaki primer çifti kullanın: GFP, 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-antisens CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3' seziyorum. Aşağıdaki PCR programı gerçekleştirildi: 95 ° C'de 2 dakika (1 döngü); 95 ° C, 45 sn, 55 ° C, 1 dakika, 72 ° C, 45 sn (30 döngü); 72 ° C'de 5 dakika (1 döngü);4 ° C tutun.

5. İsteğe bağlı Evans Mavisi Yöntemi

NOT: Evans mavisi yöntemi kullanılarak 10 retina içine kan damarlarından albümin kaçağı ölçerek damar geçirgenliği niceliğini.

  1. 5 um'lik bir filtreden 5 ultrasonik banyoda dakika ve filtreleme için normal tuzlu su çözeltisi (6 mg / ml), sonikasyon içinde çözülerek Evans Mavisi boya hazırlanır.
  2. (Adım 4.1, izofluran solumaktan) C57BL6J fareler anestezi refleksi, geri çekme refleksi ve uygun bir anesthetization gösteren kuyruk tutam yanıt doğrultma kaybını kontrol ve penil ven (Şekil 1) ile Evans mavisi (45 mg / kg) enjekte edilir. Farelerin pençeleri, namlu ve kulaklar, Evans mavisi enjeksiyonu takiben boya alımını ve dağılımını teyit açıkça mavi hale olmadığını kontrol edin.
  3. Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile, boyanın enjeksiyonundan sonra C57BL6J fareler 3 saat anestezisi ve rightin kaybını doğrulamakg doğru anesthetization gösteren refleks. Örnek intrakardiyak 500 heparin tüplerde kan ul bir sitrat tampon maddesi ile sol ventrikil yoluyla 2 dakika boyunca fareler serpmek (0.05 M, pH 3.5; sitrik asit 7.8 g damıtılmış su, 1 L sodyum sitrat ve 3.8 g çöz) vazokonstriksiyon önlemek için 37 ° C sıcaklığa daha önceden ısıtılmıştır. Fareler perfüzyon yoluyla kurban edilir.
  4. Dikkatle perfüzyon, aydınlatmak ve sonra retina toplamak için bir işletim mikroskop altında her iki gözleri teşrih (Bölüm 3.2). Santrifüjlü bir buharlaştırıcıda Kuru retina gece boyunca, tartılmakta ve (100 xg) çalkalanarak 65 ° C'de 18 saat formamid 100 ul ile retina inkübe edilerek Evans mavisi ekstrakte edin. 4 ° C'de 2 saat süre ile 20,798.5 xg'de 30K omega filtre tüpleri Santrifüj retina örnekler ve santrifüj kan örnekleri 4 ° C sıcaklıkta 15 dakika boyunca 20,798.5 xg'de.
  5. Absorbansı ölçmek için, her iki süpernatantlar kullanın. Absorbans en fo çıkarılarak her numunenin absorbansı belirlemek740 nm'de absorbans minimum 620 nm mavi r Evans. Formamid Evans mavisi, standart bir eğriden plazma ve retinada Evans mavisi konsantrasyonu hesaplanır. Saatte kuru retina (plazma / g retina kuru ağırlık / saat ul) gram Evans mavisi mikrolitre içinde BRB geçirgenliği ifade eder.

6. İsteğe bağlı Floresein Anjiyografi

Not: farelerdeki retinal kan damarlarından Kaçak sodyum fluoresein intraperitonal enjeksiyon ile görselleştirilebilir.

  1. C57BL6J fareler anestezi (izofluran solumaktan, adım 4.1) ve göz (neosynephrine ve mydriaticum) düşer Öğrencileri dilate. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze veteriner merhem kullanın.
  2. Floresein anjiografi 0.1 ml steril tuzlu su içinde% 10 sodyum fluoresein karın 0,01-0,02 ml enjekte edilir.
  3. Bir göz fundus kamera kullanarak enjeksiyon sonrası her iki gözün görüntüleri toplayın. Yanlısı sonra CO 2 solumaktan fareler Kurbanketencik.
    NOT: retinal damarlar anjiyografide görünür hale gelebilmesi için 20 sn gereklidir. Görüntüler floresein enjeksiyondan sonra 3-10 dk maksimum arasındaki yakalanan gerekir. kaçak noktalar (mevcut ise) 2.5 dakika sonra gözlenebilir. Daha sonra zaman noktalarında görüntü kalitesi nedeniyle sodyum floresein kısa bir süre analiz için kullanılan sonra elde edilen camsı, böylece sadece görüntü içine difüzyon kaybolur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan modeli ILM (- B Şekil 2A) yapısındaki düzensizlikler gösterir eğer biz ShH10 kullanarak Müller glial hücrelerin retina iletimini artış bekliyoruz. Örneğin, Dp71 yokluğunda göstermiştir, ShH10 hedefler özel olarak, fakat daha etkili Müller yabani tip farelere 16 (Şekil 2C - F) ile kıyaslandığında, bu fare çizgisinde ILM artan bir geçirgenlik gösteren intravitreal enjeksiyon ile glial hücreleri.

RAAV5 da ILM geçirgenlik bir g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BRB kan ve retina arasındaki moleküller değişimini kontrol eder. Bu dökümü diyabetik retinopati veya yaşa ilişkin makula dejenerasyon (AMD) gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. Son zamanlarda geçirgen BRB görüntüleyen bir distrofin nakavt fare üzere retina adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) tarafından aracılık edilen gen aktarımı için daha geçirgen hale göstermiştir. Ancak, BRB geçirgenlik AAV parçacıklar rağmen göz içine bu modelde göz bölmeye sınırlı kalmak enjekte. Sonuçlarımız, sistemik yan etkiler ilave riskle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Institut de la Vision'ın görüntüleme platformuna teşekkür ederiz. Fransız Musküler Distrofi Derneği'ne (AFM) O.V. ve Allergan INC.'e doktora bursu için teşekkür ederiz. LABEX LIFESENSES [referans ANR-10-LABX-65] çerçevesinde gerçekleştirilen bu çalışma, ANR tarafından yönetilen Fransız devlet fonları tarafından desteklenmiştir. Peggy Barbe ve Mélissa Desrosiers'e AAV hazırlıkları konusundaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Stéphane Fouquet'e konfokal mikroskopideki mükemmel teknik yardımı ve sonuçların yorumlanmasıyla ilgili uzman girdileri için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL6J fare suşuJANVIER LABSfareler
Ketamin 500Virbac Fransaanestezik
Ksilazin Rompun %2Bayer Sağlıkhizmetleri anestezik
Neosinefrin %5 FaureEurophtadilatant
Mydriaticum %0.5Theadilatant
SterdexNovartisanti-enflamatuar
Kriyomatris gömme reçineThermo Scientific6769006
Superfrost Plus Yapışma SlaytlarıThermo Scientific10143352slaytları
anti-lamininSigmaL9393antikor
anti-rodopsin klonu 4D2MilliporeMABN15antikor
anti-glutamin sentetaz klonu GS-6MilliporeMAB302antikoru
Anti-Glial Fibriler Asidik ProteinDako334antikoru
PNA LektinInvitrogenL32459probu
Alexa flor konjuge ikincil antikorlarInvitrogenantikoru
Fluorsave reaktifiCalbiochem345789montaj ortamı
QIAmp DNA Mikro KitiQIAGEN56304
GoTaq DNA polimerazPromegaM3001
Evans Mavi boyaSigmaE2129boya
5 & mikro; m filtreMillipor
Sodyum sitratSigmaS1804
Sitrik asitSigmaC1909-2.5KG
Formamid spektrofotometrikSigma295876-2L
FloreseinSigmaF2456boya
Micron IIIPhoenix Araştırma Laboratuvarları3-CCD renkli kamera, çerçeve yakalayıcı ve kullanıma hazır yazılıma dayalı mikroskopi sistemi, araştırmacıların fare retinalarını görüntülemesini sağlar.
İnsülin ŞırıngalarıTerumoSS30M3109
Şırınga 10 ve mikro; l HamiltonDutscher74487Beze 1701
İğne RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332İntravitreal Enjeksiyon
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3Çok yönlü enjektör, pikolitre hacimleri sağlamak için mikroşırıngalar kullanır
SYS-Micro4 Kontrol Cihazı ile UltraMicroPump (UMP3) (bir)UMP3-1Dijital kontrolör
Binoküler büyüteç SZ76ADVILABADV-76B2Yakınlaştırma 0,66 x 5 x LED, standlı epi ve çap / Retina diseksiyonu
Yaylı makas düz - 8,5 cmBiyonik Fransa S.a.r.l15003-08Retina diseksiyonu
kavisli Vanna makas15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti 96 Kuyulu Termal DöngüleyiciYaşam teknolojileri4375786Thermocycler
Ultrasonik temizleyiciLaboratuvar MalzemeleriG1125P1T
Nanosep 30k omega tüpleriVWR
Speedvac FisherScientificSC 110 A Spektroflorometre
TECANsonsuz M1000
%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
  2. Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
  3. Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
  4. Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
  5. Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
  6. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  7. Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
  8. Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
  9. Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
  10. Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
  11. Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
  12. Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
  13. Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
  14. Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
  15. Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467(2009).
  16. Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
  17. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
  18. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
  19. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  20. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  21. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313(2007).
  22. Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
  23. Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329(2009).
  24. Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kan Retina BariyeriS n rlay c MembranM ller H creleriAAV5ShH10ntravitreal EnjeksiyonKonfokal Mikroskopimm nohistokimya

İlgili makaleler