Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Atomik kuvvet spektroskopisi yüzeyleri ve arayüzleri de molekülleri incelemek için ideal bir araçtır. Kovalent bir AFM ucu üzerine çift tek moleküllerin büyük bir çeşitlilik için deneysel bir protokol sunulmuştur. Aynı zamanda AFM ucu ucuna AFM bağlı tek molekülleri incelemek için bir ön koşuldur ucu ve alt tabaka arasındaki spesifik etkileşimleri önlemek için pasifize edilir. Analizler yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu, kısa bir süre sunulmaktadır ve ileri okuma için dış referanslar verilmektedir katı yüzeyler ve biyo-arayüzleri bu moleküllerin serbest enerjisini belirlemek için. Örnek molekülleri, poli (amino asit) polytyrosine olan ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfoetanolamin). Bu moleküller CH 3 -SAMs gibi farklı yüzeyler, hidrojen sona elmas kusturulmuş ve çeşitli çözücü koşullarda lipit katmanlarını desteklenmektedir. Son olarak,kuvvet spektroskopik tek bir molekül deneyler avantajları gerçekten tek bir molekülün deneyde incelenmiştir belirtilen yöntemler karar da dahil olmak üzere ele alınmaktadır.
Giriş
Son 30 yılda, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) her üç boyutta molekül uzaysal çözünürlüğü sağlar ve çeşitli çözücü çalıştırılabilir beri biyolojik 1,2 ve sentetik 3 malzeme ve yüzeyleri incelemek için değerli bir görüntüleme tekniği olduğu ortaya çıktı etti ortamları. Buna ek olarak, AFM-tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) rejimi μN için pN arasında değişen kuvvetleri ölçmek için sağlar ve 4,5 katlama protein içine örneğin görülmemiş içgörü, polimer fiziği 6 vermiş - 8, ve tek bir molekül yüzey etkileşimi 9 - Tek molekülleri yerine moleküllerin bir topluluk okuyan arkasında 12 .The mantık....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: hazırlık, veri toplama ve veri analizi adımları içeren proses akışının genel bir bakış için Şekil 2'ye bakınız.
1. Reaktif Kurulumu
NOT: Tüm kimyasallar dikkatle ele alınması gerekir ve böylece laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması kullanılmalıdır. Tüm işlemler, bir laboratuar ocak içinde gerçekleştirilmelidir. Özellikle, özel eldivenler kloroform kullanılması durumunda kullanılmalıdır.
- Kuru hızla kloroform ve mağaza kuru ama bir haftadan daha uzun olmayan düşük su içeriği ile kimyasalları kullanın. APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) ve PEG (polietilenglikol)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aşağıda yukarıda belirtilen sonuçları örneğin molekülleri, yani polimer poli (amino asit) polytyrosine tarif ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE sunulmaktadır. İlk olarak her örnek için temin edilmiştir, veri toplama ve veri hazırlama için özel ayrıntıları deney. Daha sonra, bu moleküller, farklı yüzeylerden dezorbe deneylerde için örnek sonuçlar (CH 3 -SAMs, hidrojen sona elmas ve lipid bilayers) gösterilmektedir. Yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu ve serbest enerji belirlenmesi tanıtıldı.
.......Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son on yılda, tek bir molekül deneyler moleküler mekanizmaları görülmemiş anlayışlar sağladı ve yaşam bilimleri ve ötesinde paha biçilmez bir yaklaşım olduğu ortaya çıktı oylandı. SMFs deneyler, ideal olarak, tek ve aynı molekül deney bütün boyunca kullanıldığı iyi ve anlamlı istatistikleri elde etmek için. Moleküllerin toplulukları ile deneylerde aksine, SMFs deneyleri nadir olaylar ve gizli moleküler devletleri tespit edebiliyoruz. Tek bir molekül deneylerin başka bir avantajı, moleküler dinamik simülasyonları 24.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar maddi destek için DFG'ye (Hu 997/2-2) teşekkür eder. FS, Hanns-Seidel-Stiftung'u (HSS) kabul eder. SKr, Elitenetzwerk Bayern tarafından Karmaşık Arayüzlerin Malzeme Bilimi doktora programı çerçevesinde desteklenmiştir. SKi, finansal desteği için SFB 863'e teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Hellmanex III alkali sıvı konsantre (deterjan çözeltisi) | Hellma | ||
| RCA (ultra saf su, hidrojen peroksit (%35), amonyak (%32); 5:1:1(h/h/v))Sigma | |||
| Vectabond reaktifi / APTES (3-Aminopropil)trietoksisilan | Vectorlabs | ||
| Kuru aseton (< 50 ppm H< sub>2O) | Sigma | ||
| Kuru kloroform (> %99,9) | Sigma | ||
| Trietilamin | Sigma | ||
| Ultrasaf su | Biochrom, Almanya | ||
| Di-sodyum tetraborat (> %99,5) | Biochrom, Almanya | ||
| Borik Asit Biochrom | , Almanya | ||
| Tek Fonksiyonlu &alfa;-metoksi-ω-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS" | Rapp, Almanya | ||
| Heterobifonksiyonel α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, " NHS-PEG-NHS" | Rapp, Almanya | ||
| Heterobifonksiyonel &alfa;-maleimidoheksanoik- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS" | Rapp, Almanya | ||
| Prob molekülü (polimer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Yeterli miktarda emzikli cam kristalleştirici kaplar (10 ml), cam Petri kapları (500 & mikro; l) ve cam kapaklar | VWR International GmbH, Almanya | ||
| [header] | |||
| Laboratuvar fırını modeli UF30 | Memmert, Almanya | ||
| Sıcaklık kontrollü sonikatör | VWR International GmbH, Almanya | ||
| Plazma sistemi "Femto", 100 W | Diener, Almanya | ||
| Her organik çözücü için ayrı bir cam şırınga | VWR International GmbH, Almanya | ||
| Vorteks karıştırıcı | VWR International GmbH, Almanya | ||
| Mikrosantrifüj tüpleri (0,5 ml veya 1,5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipetler: 10-100 ve mikro; l, 50-200 ve mikro; l ve 100-1.000 & &mikro; l | Eppendorf | ||
| AFM (örneğin Biyoısıtıcılı MFP-3D) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN konsollar, tipik olarak silisyum nitrürden (SiN) yapılır (yay sabiti 100 pN/nm'den az, örn. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara | ||
Kaynaklar
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
