Bu makale, zebra balığı embriyolarında mekanik damar yaralanması oluşturmak için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaralanma modeli, gerçek zamanlı mikroskopi için ideal olan bir organizmada hemostaz, yaralanmaya bağlı iltihaplanma ve yara iyileşmesini incelemek için bir platform sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı (Danio rerio) embriyolarının, çeşitli gelişimsel ve hastalık süreçlerini incelemek için güçlü bir model olduğu kanıtlanmıştır. Dış gelişim ve optik şeffaflık, bu embriyoları özellikle mikroskopiye uygun hale getirir ve floresan proteinlerle belirli hücre tiplerini etiketleyen çok sayıda transgenik çizgi mevcuttur, bu da zebra balığı embriyosunu vasküler, hematopoetik ve diğer hücre tiplerinin etkileşimini görselleştirmek için ideal bir sistem haline getirir in vivo yaralanma ve onarım sırasında. Zebra balıklarında ileri ve geri genetik iyi gelişmiştir ve farmakolojik manipülasyon mümkündür. Hemostaz ve kan damarı onarımı dahil olmak üzere vasküler yaralanmaya verilen yanıtları incelemek için bu özelliklerin birçoğundan yararlanan mikromanipülasyon tekniklerini kullanan mekanik bir vasküler yaralanma modelini tanımladık. Video ve timelapse mikroskobunun bir kombinasyonunu kullanarak, bu vasküler yaralanma yönteminin hemostaz ve yara onarımı sırasında ölçülebilir ve tekrarlanabilir yanıtlarla sonuçlandığını gösterdik. Bu yöntem, bütün bir hayvan modelinde vasküler yaralanma ve onarımı ayrıntılı olarak incelemek için bir sistem sağlar.
Giriş
Zebra balığı, vasküler gelişim, anjiyogenez ve hematopoietik gelişim ve patoloji1-3 dahil olmak üzere vasküler biyolojideki çeşitli konuları incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Embriyolar, döllenmeden 1 gün sonra (dpf) 1,4,5 ile lökositler ve doğuştan gelen bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin yanı sıra fonksiyonel bir dolaşım geliştirir. Yaralanmaya karşı enflamatuar ve lökosit yanıtının korunması, zebra balığı embriyosunu tüberküloz enfeksiyonu, enterokolit ve doku rejenerasyonu6-9 gibi çeşitli enflamatuar süreçler için bilgilendirici bir model haline getirmiştir. Zebra balığı embriyoları, özellikle epitel yaralanması ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Zebra balığı kullanarak Prosedürleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Araçlar 1. Hazırlık
- Bir iğne tutucu içine minutia pimini takın ve pin kelepçe.
- Ince uçlu forseps kullanarak, dikkatli bir hafif kanca oluşturmak için pimin ucunu bükün.
- Manipülasyon ve yaralanma sırasında embriyonun stabilizasyonu için, iğne-burun pense kullanarak bir insülin şırınga üzerine monte edilmiş bir 28 guage ½ inç iğne ucunu bükün.
Sakatlık için Zebra balığı Embriyolar 2. Hazırlık
- Zebra balığı yetiştiriciliği çiftleri kurmak ve daha önce
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mekanik damar hasarı embriyolar (- C Şekil 2A) dpf, 2 gerçekleştirilmiştir. Hızlı ve güvenilir bir pıhtılaşma yanıt olarak yaralanma sonucu (Şekil 2D) kanamanın durdurulması zaman ile ölçülmüştür. Pıhtılaşma karşılık olarak fark ölçülebilir olup olmadığını belirlemek için, pıhtılaşma önleyici Hirudin (için hemen önce (5-10 nl su içinde çözülmüş hirudin ul başına 1 ünite) yaralama ile Cuvier'in gösterilen kanal içine enjekte embriyolar uygulanmıştır Cuvier ve Duct içine enjeksiyonu g.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Balığı 10 yaralama lazer yaralanması 13-15, lazer kaynaklı tromboz 16 ve epiteliyal da dahil olmak üzere yaraların farklı türleri için bir model olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu çalıştırmak için basit ve gerçek zamanlı mikroskopi için son derece müsait olan bir in vivo modeli olarak kontrollü bir yaralanma üreten mekanik yaralama için bir yöntem sunulmaktadır. Hızlı ve ölçülebilir hemostatik tepki ve görüntü ve timelapse mikroskopi kullanılarak izlenebilir tekrarla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, yararlı tartışmalar için Dr. Stephen Wilson ve Lisa Wilsbacher'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen NIH HL054737 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Minutia Pimleri | Güzel Bilim Araçları | 26002-10 | Uç çapı 0,0125 mm, çubuk çapı 0,1 mm |
| Pim Tutucu | Güzel Bilim Araçları | 26016-12 | |
| Dumont #5 İnce Uçlu Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11254-20 | |
| Cam Çöküntü Kaydırağı | Sucul Eko-Sistemler | M30 | |
| Düşük Erime Noktalı Agaroz | Lonza | 50081 | 42 °C'ye önceden ısıtılmış; C |
| N-Feniltiüre (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoik asit (Trikain) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Cam alt görüntüleme plakaları | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Diseksiyon mikroskobu | Olympus | SZH10 | |
| Floresan mikroskobu | Zeiss | Axio Observer | |
| Akvaryum tuzları | 28,5 | ||
| İnsülin şırıngası | Becton Dickinson |
Kaynaklar
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
- Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
- Ellett, F., Lieschke, G. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
