Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

7.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52460

⸱

17 Şubat 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

Bu makalede

Özet

Bu makale, zebra balığı embriyolarında mekanik damar yaralanması oluşturmak için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaralanma modeli, gerçek zamanlı mikroskopi için ideal olan bir organizmada hemostaz, yaralanmaya bağlı iltihaplanma ve yara iyileşmesini incelemek için bir platform sağlar.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio) embriyolarının, çeşitli gelişimsel ve hastalık süreçlerini incelemek için güçlü bir model olduğu kanıtlanmıştır. Dış gelişim ve optik şeffaflık, bu embriyoları özellikle mikroskopiye uygun hale getirir ve floresan proteinlerle belirli hücre tiplerini etiketleyen çok sayıda transgenik çizgi mevcuttur, bu da zebra balığı embriyosunu vasküler, hematopoetik ve diğer hücre tiplerinin etkileşimini görselleştirmek için ideal bir sistem haline getirir in vivo yaralanma ve onarım sırasında. Zebra balıklarında ileri ve geri genetik iyi gelişmiştir ve farmakolojik manipülasyon mümkündür. Hemostaz ve kan damarı onarımı dahil olmak üzere vasküler yaralanmaya verilen yanıtları incelemek için bu özelliklerin birçoğundan yararlanan mikromanipülasyon tekniklerini kullanan mekanik bir vasküler yaralanma modelini tanımladık. Video ve timelapse mikroskobunun bir kombinasyonunu kullanarak, bu vasküler yaralanma yönteminin hemostaz ve yara onarımı sırasında ölçülebilir ve tekrarlanabilir yanıtlarla sonuçlandığını gösterdik. Bu yöntem, bütün bir hayvan modelinde vasküler yaralanma ve onarımı ayrıntılı olarak incelemek için bir sistem sağlar.

Giriş

Zebra balığı, vasküler gelişim, anjiyogenez ve hematopoietik gelişim ve patoloji1-3 dahil olmak üzere vasküler biyolojideki çeşitli konuları incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Embriyolar, döllenmeden 1 gün sonra (dpf) 1,4,5 ile lökositler ve doğuştan gelen bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin yanı sıra fonksiyonel bir dolaşım geliştirir. Yaralanmaya karşı enflamatuar ve lökosit yanıtının korunması, zebra balığı embriyosunu tüberküloz enfeksiyonu, enterokolit ve doku rejenerasyonu6-9 gibi çeşitli enflamatuar süreçler için bilgilendirici bir model haline getirmiştir. Zebra balığı embriyoları, özellikle epitel yaralanması ve nötrofil yanıtı bağlamında yaralanmaya bağlı iltihabı incelemek için kullanılmıştır10,11. Embriyonun yaralanması, yaralanma bölgesindeki hücrelerden ve yaralanmaya yanıt vermek ve kararını düzenlemek için işe alınan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinden yüksek oranda korunmuş bir hücresel yanıt ile sonuçlanır11,12. Diğer yaralanma modelleri, nöronlar, kas hücreleri ve kardiyomiyositler13-15 dahil olmak üzere belirli hücre tiplerine yönelik yaralanmayı uzamsal olarak lokalize etmek için odaklanmış lazer darbeleri kullanmıştır.

Zebra balığı embriyoları, hem mekanik hem de lazerle indüklenen trombüs oluşumu16-19 kullanılarak, farmakolojik ve genetik manipülasyon koşullarında hemostaz ve trombozu incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Pıhtılaşma kaskadının bileşenleri iyi korunmuş gibi görünmektedir ve transgenikler, pıhtılaşma bölgesinde trombosit ve fibrin birikiminin ayrıntılı çalışmalarına izin vermiştir17,20,21. Bu yazıda sunulan prosedür, damar ihlali, trombüs oluşumu ve çözünürlüğü ve damar onarımı ile sonuçlanan mekanik damar yaralanmasını incelemek için bir sistem sağlayarak bu yöntemleri tamamlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Zebra balığı kullanarak Prosedürleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Araçlar 1. Hazırlık

  1. Bir iğne tutucu içine minutia pimini takın ve pin kelepçe.
  2. Ince uçlu forseps kullanarak, dikkatli bir hafif kanca oluşturmak için pimin ucunu bükün.
  3. Manipülasyon ve yaralanma sırasında embriyonun stabilizasyonu için, iğne-burun pense kullanarak bir insülin şırınga üzerine monte edilmiş bir 28 guage ½ inç iğne ucunu bükün.

Sakatlık için Zebra balığı Embriyolar 2. Hazırlık

  1. Zebra balığı yetiştiriciliği çiftleri kurmak ve daha önce 22 gösterildiği gibi yumurta su (60ug / ml akvaryum tuzları) yumurta toplamak.
  2. Embriyolar yaklaşık melanization önlemek için 8 saat sonra döllenme (hpf) olduğunda yumurta suya% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) ekleyin.
  3. Ince uçlu forseps kullanarak deney öncesinde dechorionate iki gün sonrası fertilizasyon (dpf) embriyolar.
    Not: dolaşım başladıktan sonra Embriyolar her zaman yaralı olabilir. Burada sunulan veriler embriyolar dpf'e 2 için, ama tekniği başarıyla 5 dpf'e kadar embriyolarda uygulanmıştır.
  4. % 0.02 tamponlanmış 3-aminobenzoik asit (Tricaine), önceki kontroller için yaklaşık 10 dakika ile embriyolar anestezisi.

3. Mekanik Gemi Embriyolar yaralanması

  1. Bir transfer pipeti kullanarak bir diseksiyon stereomikroskopta bir depresyon slayt anestezi embriyolar transfer.
  2. Dominant elin ile embriyo işlemek için şırınga iğnesi kısa düz tarafını kullanarak, uzak iğne bakan ventral yüzeyi ile yan embriyo yerleştirin.
  3. Ucu ile minutia pimi ürogenital açılış balık posterior ventral yüzeyine doğrudan işaret yerleştirin. Hafif bir açıyla minutia pimini yerleştirin böyle kavisli ucu kaudal ven (Şekil 1 periderm delip mümkün olduğunu/ Strong>).
  4. Embriyo işlemek için şırınga iğnesi kullanarak, hafifçe damar içine iğne kanca pin içine embriyo dokunarak minutia iğne ile kaudal ven delmek.
  5. Şırınga iğnesi kullanarak, kap içinde küçük bir gözyaşı oluşturmak için uzak minutia pin embriyo çekin.
    NOT: Başarılı bir yaralanma damarından derhal kanama neden olur.

Hemostazın 4. Analizi

  1. Gözle görülür bu işlem için kan hücreleri dolaşımdaki sadece embriyolar seçin.
  2. En kısa sürede minutia pimi kabından çekilir gibi zamanlayıcı başlamak için hazırlayın.
  3. En kısa sürede kan kaybı yaradan görüntülenmiştir edilebilir Sayacı başlatmak. Yaradan kan kaybı kesildiğinde, Sayacı durdurmak ve Zaman Kanama gibi toplam süreyi kaydetmek. Pıhtılaşma engellenir ise, artık gözle görülür dolaşan kan hücreleri varken zaman kaydedin.

Yara Şifa 5. Analizi

  1. Aktarım posmikroskopi için cam alt görüntüleme yemekleri üzerine t-yaralanma hayvanlar.
  2. Yumurta suyun çoğunluğu çıkarın.
  3. ºC 42 ila 45 kadar ısıtılır ve% 0.02 Tricaine ile takviye agaroz yumurta suda çözünmüş 0,3-1,2% düşük erime embriyolar, örtün.
  4. Forseps kullanarak kendi yüzüne Pozisyon embriyolar.
  5. Agaroz soğuduktan sonra, yumurta, su içinde% 0,02 Tricaine ile çanak doldurun.
  6. Aydınlık, Epifloresans veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntü elde.
  7. Forseps kullanarak agaroz embriyo çıkarın ve yumurta suya geri aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mekanik damar hasarı embriyolar (- C Şekil 2A) dpf, 2 gerçekleştirilmiştir. Hızlı ve güvenilir bir pıhtılaşma yanıt olarak yaralanma sonucu (Şekil 2D) kanamanın durdurulması zaman ile ölçülmüştür. Pıhtılaşma karşılık olarak fark ölçülebilir olup olmadığını belirlemek için, pıhtılaşma önleyici Hirudin (için hemen önce (5-10 nl su içinde çözülmüş hirudin ul başına 1 ünite) yaralama ile Cuvier'in gösterilen kanal içine enjekte embriyolar uygulanmıştır Cuvier ve Duct içine enjeksiyonu g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Balığı 10 yaralama lazer yaralanması 13-15, lazer kaynaklı tromboz 16 ve epiteliyal da dahil olmak üzere yaraların farklı türleri için bir model olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu çalıştırmak için basit ve gerçek zamanlı mikroskopi için son derece müsait olan bir in vivo modeli olarak kontrollü bir yaralanma üreten mekanik yaralama için bir yöntem sunulmaktadır. Hızlı ve ölçülebilir hemostatik tepki ve görüntü ve timelapse mikroskopi kullanılarak izlenebilir tekrarla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, yararlı tartışmalar için Dr. Stephen Wilson ve Lisa Wilsbacher'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen NIH HL054737 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Minutia PimleriGüzel Bilim Araçları26002-10Uç çapı 0,0125 mm, çubuk çapı 0,1 mm
Pim TutucuGüzel Bilim Araçları26016-12
Dumont #5 İnce Uçlu ForsepsGüzel Bilim Araçları11254-20
Cam Çöküntü KaydırağıSucul Eko-SistemlerM30
Düşük Erime Noktalı AgarozLonza 5008142 °C'ye önceden ısıtılmış; C
N-Feniltiüre (PTU)Sigma AldrichP7629
3-aminobenzoik asit (Trikain)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Cam alt görüntüleme plakalarıMattekP35G-1.5-14-C
Diseksiyon mikroskobuOlympusSZH10
Floresan mikroskobuZeissAxio Observer
Akvaryum tuzları28,5
İnsülin şırıngasıBecton Dickinson 
G iğneli Instant Ocean 329461

Kaynaklar

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351(2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682(2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48(2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hemostaz DeğerlendirmesiZaman Atlamalı MikroskopiYara Onarım AnaliziMikromanipülasyon TeknikleriKonfokal MikroskopiTransgenik HatlarKanama Süresi ÖlçümüVasküler Yaralanma Modeli
Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.