Myh6-Promotörle Seçim ile kombinasyonu ES-Hücre-Programlama dayanarak Kemirgen Kardiyak Kalp Pili Hücre Agregaların Üretimi

Özet

Bu protokol, kemirgen pluripotent kök hücreler (PSC) fonksiyonel sinüs düğüm doku üretmek açıklamaktadır. T-Box3 (TBX3) ekspresyonu artı kalp Myosin ağır zincir (Myh6) promotör antibiyotik seçimi son derece saf kalp pili hücre agrega yol açar. Bu "İsteyerek-sinoatrial-organları" ("iSABs"), son derece dayak oranları arttı göstermek% 80'in üzerinde kalp pili hücreleri içeren ve miyokard ex vivo pace edebiliyoruz.

Özet

"Hasta sinüs sendromu" Tedavi yapay kalp pili dayanmaktadır. Bunlar pil arızası ve enfeksiyonlar gibi tehlikeleri ayı. Ayrıca, hormon eksikliği yanıt ve genel prosedür maliyeti yoğundur. PSC'ler oluşturulan "Biyolojik kalp pilleri" bir alternatif haline gelebilir, ancak Embriyoid Oluşumu kalp pili hücrelerinin tipik içeriği (EBS) son derece düşüktür. açıklanan protokol Myh6-organizatörü bazlı antibiyotik seçimi ile sinüs düğümü indükleyici TBX3 yoluyla kemirgen PSC'lerin "ileri programlama" birleştirir. Bu>% 80 fizyolojik fonksiyonel kalp pili hücrelerinin tutarlı kardiyomiyosit agrega verir. Bu "uyarılmış-sinoatrial-organları" ("iSABs") kendiliğinden fare kalplerinden izole düğüm hücrelere karşılık gelen henüz ulaşılmamış frekanslarda (400-500 bpm) olarak sözleşme ve kemirgen miyokard ex vivo pace edebiliyoruz. Açıklanan protokol oldukça saf sinüs kullanmaNodal tek hücreler in vitro ilaç testi için kullanılabilir, ki burada, örneğin oluşturulabilir. Ayrıca, bu protokole göre üretilen iSABs kalp doku mühendisliği yolunda çok önemli bir adım olabilir.

Giriş

dönem "hasta sinüs sendromu" kalp pili sisteminin bozulmasına yol açan birden hastalıkları özetler. Bu patolojik, semptomatik sinüs bradikardi, sinoatrial blok, sinüs tutuklama yanı sıra taşikardi-bradikardi sendromu oluşur. Böylece, bir "hasta sinüs sendromu", genellikle böyle bir iskemik kalp hastalığı, kardiyomiyopati ya da miyokardit gibi genel kalp hastalıkları eşlik ediyor. Şu anda, tedavi yaklaşımları elektrik pili implantasyonu dayanmaktadır. Ancak, bu tür enfeksiyonların ve pil arızası gibi risklerin bir dizi ile birlikte gider. Genel olarak, komplikasyonların insidansı halen hastaların yapay kalp pili implante olan çok yüksektir. Endojen kalp karşı Ayrıca, bu cihazlar, hormon stimülasyonuna yanıt vermez.

Gelecekteki bir alternatif olan PSC'ler hizmet verebilir "biyolojik kalp pili" durumu güveniyor olabilirUygun bir hücre kaynağı olan ve aynı zamanda in vitro ilaç testi için oldukça yararlı olacaktır. Ancak, büyük bir sorun embriyoid organları (EBS) içindeki sinüs düğüm hücrelerin çok nadir görünüm yatıyor - bu genellikle ~% 0.5 ¹ aşmaz.

Daha önce, bu özel kardiyomiyosit alt tiplerine karşı "ileri programlama", yani ilgili Mesoderm-özgü arka 1 (MesP1) ve NK2 transkripsiyon faktörü, lokus 5 (Nkx2.5) ² gibi farklı erken kardiyovasküler transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi yoluyla mümkün olduğu ^{gösterilmiştir, 3.} Normal boyut ve sinoatriyal düğüm (SAN) bir fonksiyonu için, T-box transkripsiyon faktörü Tbx3 pili gen programının başlatılmasını ve SAN ⁴ farklılaşmasını kontrol ettiği gösterilmiştir olan, son derece önemlidir. Bu fonksiyonel kalp pili hücrelerinin görünümünü gelişmiş iken, içeriği hala tüm cardiomyocytic hücre popülasyonu içinde ~ 40% geçmedi.

Bu nedenle, ek bir Myh6-organizatörü bazlı antibiyotik seçimi adım ⁵ bizim tarafından tanıtıldı. In vitro ekili bir kemirgen kalbin olanlar ve karşılaştırılabilir yaklaşıldığıdır ilk kez in vitro yüksek artış yenerek frekansları (> 400 bpm) sergilerler; Bu sonuçta henüz farkedilmemiş kardiyomiyosit agrega (iSABs "" uyarılmış Çin-atriyal organları ") yol açar bir murin kalp ⁶ izole sinüs düğüm hücreleri. İzoprenalin yönetimi altında 550 bpm bile dayak frekansları elde edilir. Özellikle, iSABs ⁷ analizleri geniş fizyolojik itibaren belirgin% 80'in üzerinde fonksiyonel düğüm hücreleri oluşur. Son zamanlarda, çeşitli yaklaşımlar doğrudan yeniden programlama ¹⁹ kullanılarak Sinus düğüm hücreleri oluşturmak için, yüzey ^16,17 tarif edildi küçük moleküller ile ¹⁴ ya da farmakolojik tedavi işaretler. Ancak, bu yöntemlerin hiçbiri kalp pili hücrelerinin böyle bir yüksek saflıkta yol açtı ve murin yakın frekansları yenerek osanat iSABs görüldüğü gibi.

Dahası, spontan dayak aktivitesini kaybetmiş ekili yetişkin fare ventriküler dilimleri bir ex vivo modelde, iSABs, dilim dokusu içine entegre böylece kendiliğinden aktif kalan ve sağlam kasılmaların ⁷ kalp dilimleri pacing yeteneğine sahiptir. Bu iSABs üretimi için ayrıntılı bir protokol bu yazıda açıklanmıştır.

Protokol

1. Öneriler Başlamadan Önce

1. Onlar sinüs düğümü hücrelerine doğru ayırt çünkü mikoplazma ile kontamine PSC'ler kullanmayın. Protokolü başlamadan önce mikoplazma kontaminasyonu için test. Mikoplazmalar hızlı, son derece duyarlı bir PCR kiti kullanılarak bu yapın ve, üreticinin protokolü izleyin.
2. Her bir Petri kabı (aşama 2.3.4), kaplama, bir 10 sm, 37 ° C'de 1 saat boyunca soğuk su balığı deri steril 7 mi,% 0.1 jelatin ile ² hücre kültür çanağı için. Steril bir tezgah steril koşullar altında çanak kuru jelatin çıkarın ve izin.
3. Bir memeli ifade vektörü kullanılarak TBX3 i) Kurucu aşırı ifadesi: Eğer farklılaşma protokolü başlamadan önce aşağıdaki özellikleri içeren bir çift transfekte kararlı fare ES hücre hattı klonu gerekir. Ii) Myh6-destekleyici ⁵ kontrolü altında G418 direnç geni.
4. farklılaşmamış PSC hücreler, bir P-yetiştirmek olmalıdırtarif edilen ¹ gibi standart koşullar altında ışınlanmış besleyici hücreler d.

2. Farklılaşma Prosedürü

1. İki Gün Farklılaşma önce - besleyici hücreleri PSC'ler çıkarın.
   1. 10 ml fosfat tamponlu tuzlu su, PBS ile yıkama hücreleri, ortam aspire 7 mi kollajenaz IV, bir çözeltisi eklenmekte ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca kuluçkalayın. 50 ml'lik bir tüp içinde bir steril 40 mikron filtre yerleştirin.
   2. Dikkatle PSC koloniler durulama yukarı ve aşağı 5 kez kollajenaz çözüm pipetleme (besleyici hücreleri çıkarmak için kaçının).
   3. , 40 mikron filtre hücre süspansiyonu aktarın 8 ml PBS ile filtreyi üç kez yıkayın. Filtre etrafında döndürün ve baş aşağı bir petri yerleştirin. Filtrenin tabanına 10 mi PBS pipetleme PSC hücre kolonileri çıkarın.
   4. 300 x g, 5 dakika boyunca 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın.
   5. 1 ml Accutase ve i hücreleri askıya, PBS Kaldır5 dakika boyunca 37 ° C'de ncubate.
   6. 10 ml PBS ilave 300 x g 5 dakika boyunca aşağı 5 kez ve santrifüj yukarı pipetleme ve hücre çözeltisi karıştırılır.
   7. , PBS çıkarın, 10 ml ekimi ortamda hücrelerin askıya ve hücre sayısını belirlemek.
   8. Tohum 15,000 hücre / 75 ^cm2 filtre şişesi üzerine dayanan ^cm2 ve 37 ° C,% 5 CO2 ve 2 gün süreyle yetiştirilir. 2 gün sonra, şişe,% 50-70 konfluent olmalıdır.
2. Gün 0 - Farklılaşma Başlangıç
   1. Ortamı çıkarın ve 10 ml PBS ile yıkama hücreleri.
   2. , PBS aspire 2 mi Accutase ilave et ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkalayın. 50 ml'lik bir tüp içinde bir steril 40 mikron filtre yerleştirin.
   3. 40 um'lik bir filtreden hücre süspansiyonu transferi, 10 mi PBS ekleyin 10 ml PBS ilavesiyle ve santrifüj ile filtre durulama akış yoluyla 300 x g, 5 dakika karıştırıldı.
   4. 10 ml farklılaşma ortamda hücreleri Askıya ve hücre sayısını belirlemek.
   5. T seyreltinO 20,000 hücre / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar farklılaşma ortamı ile süspansiyon hücre.
   6. Pipet 20 ml su ve HDS kurutulması çıkmasını engellemek için bir ikinci derece Petri kabındaki damla (HD) çözeltisi asılı 5 mi.
      NOT: Her 24 plaka içeren iSABs için 16 Petri kapları ile başlar (bölüm 2.8.6.4/2.8.7 bakınız).
   7. Bir tepsiye 50 mi hücre süspansiyonu kadar Pipet.
   8. Petri kapağı etrafında çevirin. 12 kanallı pipet kullanarak kapak üzerine 180 HDS her içeren 20 ul (400 hücre / HD) hücre süspansiyonu yerleştirin.
   9. Dikkatle kapak dönüp Petri kabı üzerine yerleştirin.
      NOT: Kapağın etrafında dönme hızı çok önemlidir. Kapak çok yavaş ya da çok hızlı döndü ise, hücre süspansiyonu yüzey gerilimi asılı kapağındaki damlaları korumak için yeterince yüksek değil. Orta 20 ul damla kapak etrafında dönen ilk kez uygulama için HDS üretmeye çalışıyor önce.
   10. 3 2 gün boyunca hücrelerin kültive7 ° C,% 5 CO ₂ onları EBS formu izin.
       NOT: 5 Petri kapları bir yığının üzerine su dolu yerleştirin, bir petri. Aksi takdirde, üst petri HD kurur.
3. Gün 2
   1. Dikkatle kuadratik Petri kabı kapağının etrafında çevirin ve 50 ml tüp iki Petri kapları (360 EBS) türetilen EBS aktarmak.
   2. EBS tüpün dibinde yerleşmek izin 10 dakika bekleyin (EBS santrifüj etmeyin).
   3. Aspire mümkün olduğu kadar ortam olarak, 10 mi farklılaşma ortamda EBS askıya ve 10 cm Petri için süspansiyonun aktarın.
4. Gün 2-6 Süspansiyon kültürü
   1. 37 ° C'de 4 gün boyunca süspansiyon içinde EBS yetiştirmek,% 5 _CO2, 2 gün sonra ortam değiştirin.
      Not: EBS genellikle yüzeye eklemek (bir hücre kültürü tabağına aksine) petri tabağı kaplı değildir bile. EBS ekli EBS, her gün ve gerektiğinde kopmakta eğer petri kapları kontrolNazik pipetleme yüzeyinden. İsteğe bağlı: süspansiyon kültürü döneminde sürekli petri kapları çalkalayın. Çalkalayıcı hızıyla dikkatli olun. EBS ne ortasında birikir ne Petri yemekleri sınırına yüzer gerekir.
5. Gün 6
   1. Bir jelatin kaplı 10 cm ² hücre kültürü çanak bir Petri kabı EBS aktarın.
6. Gün 7-12
   1. Hücreler 8-12 gün sonra yenmek için başlamalıdır. Günlük mikroskop altında hücrelerin odakları yenerek kontrol edin. hücreler, bir tabaka oluşturmak için başlar.
   2. Orta gazetesine değiştirin.
      NOT: orta değiştirdikten sonra, hücreler kurtarmak ve tekrar dayak başlamak için 3-4 saat gerektirir.
7. Sinüs düğüm hücrelerin Gün 12-15 seçimi.
   1. Hücreler (günlük 12-15 civarında) çarpmaya başladı olan üç gün sonra, hücreler, 400 ug / ml G418 içeren taze farklılaştırma ortamının orta ve pipet 10 ml aspire.
8. Dört gün seçimi başlangıcından sonra hücre katmanı ayırmak.
   NOT: Bu hücre tabakası önceden yüzeyinden ayrılır mümkündür.
   1. Hücre katmanı aspire etmeden dikkatlice orta çıkarın.
   2. PBS 10 ml ekleyin ve hücre tabakası aspire etmeden dikkatlice PBS kaldırmak.
   3. 50 ml'lik bir tüpe hücreleri transferi ve 5 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe hücreleri, kollajenaz IV, 10 ml solüsyonu ekleyin.
   4. Şiddetle yukarı pipetleme ve 10 kat aşağı süspansiyon karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Küçük kümeler bir süspansiyon meydana gelmelidir. Hala sol katmanın büyük parçalar varsa, o adım 2.8.4 iki kez daha tekrarlayın.
   5. 300 x g, 10 dakika boyunca 20 ml PBS ve santrifüj ekleyin.
   6. PBS dikkatle aspire.
      NOT: iSABs adım 2.8.7 devam elde edilecek ise. Isab türetilmiş sinüs düğüm tek hücre oluşturulur olursak adım 2.9 ile devam.
   7. Hücreleri Askıya12 ml farklılaşma karışımı, 400 ug / ml G418 ihtiva eden ve kaplanmış jelatin 6 kuyu 24 kuyu (/ oyuk 2 mi) üzerine tohum.
9. Tek düğüm hücrenin üretilmesi.
   1. 5 mi Accutase adım 2.8.6 gelen süspanse edildi ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Şiddetle yukarı pipetleme ve 10 kat aşağı süspansiyon karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
   3. 300 x g, 5 dakika boyunca 20 ml PBS ve santrifüj ekleyin.
   4. 400 ug / ml G418 ihtiva eden 12 mi farklılaşma ortamı içinde süspanse 24 kuyu (2 ml / oyuk) kaplanmış bir jelatin 6 kuyu bunları tohum.
10. Ayrışma sonrası Gün 2, orta aspire ve PBS ile hücreler üç kez yıkayın. Iyi / 1 ml farklılaşma ortamı ekleyin.
11. Gün 4-8 ayrışma sonra, her ^2. gün Orta değiştirin. Ayrılma kullanımı iSABs veya isab edilen sinüs 10 gün sonra düğüm tek hücre, daha fazla analiz için kullanılabilir.

Sonuçlar

açıklanan protokol fare kalp dayak frekansına yakın (film gösterilir) PSC'ler yaklaşık 450 bpm bir dayak frekansı ile iSABs üretimi sağlar. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, iSABs ayrışmasından (aşama 2.8.8) sonra gözlenen tek hücre sinüs düğümü (mil ve örümcek hücreleri) hücrelerin, tipik şeklini gösterir. Bu hücreler bilinen yüksek hızlı protein fonksiyonu için önemli olduğu hiperpolarizasyon aktive siklik nükleotid kapılı katyon kanalı 4 (Hcn4), Connexin45 (CX45), Connexin30.2 (Cx30.2) ve Myh6 (-

Tartışma

yetenek "biyolojik kalp pili" anlamında uygun kalp ritminin sulandırma izin verebilir hücre kaynaklı kalp pili kök hücreler üretmek için. Aynı şekilde, in vitro uyuşturucu testi onların durumu yararlanacaktır. PSC'leri kalp pili hücresi özellikleri ^{8,9,10,11,12,13} ile kardiyomiyositlere dahil memeli vücudunun herhangi bir hücre türüne yol açabilir. Ancak, genellikle "Embriyoid Bodies" içinde hücre popülasyonları kaçınılmaz güvenilir bir seçim ve izolasyon stratejilerinin gereksinimine ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Iscove'un stabil glutamin içeren sıvı ortamı	Biochrom AG	FG 0465
DMEM Na-piruvat içermeyen sıvı ortam, stabil glutamin ile	Biochrom AG	FG 0435
CLS tip IV, CLS IV	Biochrom AG	C4-22
Esansiyel olmayan amino asitler	Biochrom AG	K 0293
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
Sodyum piruvat (100 mM)	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC sıvı (kullanıma hazır solüsyon), steril	Biochrom AG	A 2912
Reaktif rezervuarı PP f. çok kanallı pip. 60ml, steril	Marka	703409
Accutase	eBioscience,Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, elektronik pipet	Eppendorf	4861000155
Falcon Hücre Süzgeci 40 & m	Falcon	352340
Penisilin / Streptomisin	GE Healthcare	P11-010
Petri Kapları	Greiner BioOne	663102
Ca ve Mg içermeyen DPBS	PAN-Biotech	P04-36500
Fetal sığır serumu	PAN-Biotech	P30-3302
Lösemi inhibitör faktör	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
Kuadratik petri kapları	Roth	PX67.1
Soğuk su balık derisinden elde edilen jelatin	SigmaAldrich	G7765
2-Merkaptoetanol	SigmaAldrich	M3148 ve nbsp;
1-Tiyogliserol	SigmaAldrich	M6145
Doku kültürü kapları	TPP	93100
Doku kültürü şişesi	TPP	90076
Doku kültürü test plakaları (24 kuyulu)	TPP	92424