Yöntem makalesi

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

17K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52469

⸱

2 Şubat 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

Bu makalede

Özet

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Özet

Kanser ilerlemesi (başlangıç, büyüme, invazyon ve metastaz), kötü huylu hücreler ile çevredeki tümör stromal hücreleri arasındaki etkileşimler yoluyla gerçekleşir. Tümör mikroçevresi, hücre dışı matrikse (ECM) gömülü fibroblastlar, immün hücreler, vasküler endotel hücreleri, perisitler ve kemik iliği türevi hücreler gibi çeşitli hücre tiplerinden oluşur. Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), çözünür faktörlerin salgılanması, anjiyogenez ve ECM'nin yeniden şekillenmesi yoluyla pro-tümörjenik bir role sahiptir. Kanser hücresinin hayatta kalması, çoğalması, göçü ve istilası için deneysel modeller çoğunlukla iki boyutlu tek hücreli ve tek katmanlı doku kültürlerine veya Boyden odası tahlillerine dayanmıştır. Bununla birlikte, bu deneyler hastalıklı bir organdaki fizyolojik veya patolojik koşulları tam olarak yansıtmaz. Tümör stromal veya tümör matriks etkileşimlerini daha iyi anlamak için, çok hücreli ve üç boyutlu kültürler, hücreler arası iletişimi ve kanser hücresi davranışının ECM'ye bağlı modülasyonunu araştırmak için daha güçlü araçlar sağlar. Bu tür bir çalışma için bir platform olarak, kanser hücrelerinin CAF'lerin birincil kültürleri ile gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlendiği deneysel bir model sunuyoruz.

Giriş

Kanser dokusu, kanser ile tümör stromal mikroçevresi arasındaki yakın etkileşimler yoluyla gelişen, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), bağışıklık hücreleri, tümör damarları ve hücre dışı matristen (ECM) oluşan bir organ türü olarak algılanabilir. CAF'ler, kanser hücreleri üzerinde mitojenik, pro-migrasyon ve pro-invaziv etkiler gösteren çözünür faktörlerin (sitokinler, büyüme faktörleri ve kemokinler) ana kaynağıdır. Ayrıca tümör damarı oluşumunu uyarırlar ve kemik iliği türevi hücreler (BMDC) gibi öncü hücreleri işe alırlar. Aktive edilmiş CAF'ler, ECM'nin üretiminde ve yeniden modellenmesinde rol oynar, böylece kanser hücrelerinin büyümesini ve yayılmasını teşvik eder1. CAF'ler ayrıca tümör hücresi kolonizasyonunu ve metastazı kolaylaştıran ve kök hücre fenotiplerini komşu kanser hücrelerine verebilen bir niş sağlar. Patolojik gözlemler, kanser dokularındaki stromal reaksiyonların veya fibrotik değişikliklerin kötü prognozun göstergesi olduğunu göstermektedir. Son çalışmalar, gen imzası gibi tümör stromal özelliklerinin hasta prognozunu öngörebileceğini de göstermiştir. Ayrıca, CAF'tan türetilmiş faktörler kemoterapiye duyarlılığı modüle edebilir ve CAF'lerin ilaç duyarlılığını ve direncini belirlemedeki rolünü vurgulayabilir2.

CAF'lar, tümör mikroçevresi içindeki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlere aracılık eden sinyal yolları yoluyla tümör ilerlemesinin desteklenmesinde çok yönlü bir rol oynadığından, kanser tedavileri için yeni hedefler olarak artan ilgi görmüşlerdir. Kanser mikroçevresi içindeki hücre popülasyonlarının heterojenliği, CAF'leri hedeflemek için bir engel teşkil etmektedir. α-düz kas aktini (α-SMA), fibroblast aktivasyon proteini (FAP) ve fibroblast spesifik proten-1 (FSP-1: S100A4 olarak da adlandırılır) gibi CAF'lar için çeşitli belirteçler önerilmiştir; bununla birlikte, bu moleküler belirteçler, CAF'leri kanserli olmayan dokularda bulunan diğer hücrelerden ayırt etmek için spesifik değildir3. Bu nedenle, CAF'lerin spesifik özellikleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu amaçla, primer kültürlenmiş KAF'leri hasta uyumlu normal fibroblastlarla karşılaştırmak bilgilendiricidir.

Son zamanlarda, çeşitli kanser türlerinde hasta kaynaklı CAF'ler üzerinde yapılan analizler bildirilmiştir ve kanserli olmayan dokulardan türetilen fibroblastlarla karşılaştırıldığında benzersiz gen ekspresyon paternleri ve hücre davranışları ortaya çıkmıştır. İnsan akciğer kanseri dokularından izole edilmiş CAF'leri kullanarak, akciğer CAF'lerinin özelliklerini değerlendirmemizi sağlayan üç boyutlu bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu modelde, CAF'lerin akciğer kanseri hücre invazyonu, proliferasyonu ve kollajen jel kontraksiyonu üzerindeki etkilerini araştırdıkve bu da akciğer CAF'lerinin tümör teşvik edici rollerini deneysel olarak özetledi 4.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu çalışma, uygun Etik Komiteleri tarafından onaylandı.

İnsan Akciğer Fibroblastları 1. İlköğretim Kültürü

  1. Akciğer dokusunun Koleksiyon:
    1. Doğrudan cerrahi ameliyathane insan akciğer doku örnekleri edinin. Olabildiğince uzak olarak tümör toplanan kanserli olmayan numune ile, kanserli ve kanserli olmayan akciğer dokusundan yaklaşık 1 cm 3 blok toplayın.
    2. Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.25 ug / ml amfoterisin B (serumsuz ortam) ile takviye edilmiş (DMEM) içinde örnekleri askıya alındı. Steril 50 ml tüpler içinde asılı örnekleri koruyun ve laboratuvara transfer.
      Not: Fibroblastlar yüksek göçmen ve epitel, endotel ve düz kas hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında, proliferatif. sonucudur yöntemi fibroblastların bu özelliklerinden yararlanmak ve outgro alırdoku kesitlerinden kanat hücreleri fibroblastlar bol miktarda bulunmaktadır. Çeşitli hücre geçiş sonrası, diğer hücre tipleri saflaştırılmış fibroblast hücre kültürlerinde elde edilen hayatta ve% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile birlikte DMEM yaymak için başarısız olur. hücrelerin, birincil kültür, aşağıdaki 3-7 geçişleri kullanılabilir.
  2. Hücre akıbet için eksplant kültürü ve iklimlendirme:
    1. Modifikasyonlar 5 ile önceden bildirilen protokolü kullanarak fibroblast primer kültürünü gerçekleştirin.
    2. Laboratuarda, kültür ortamında 10 cm uzunluğunda bir doku kültür tabağına, doku numuneyi ve küçük bölümler halinde kesilir ~ steril forseps ve bir neşter kullanılarak boyut olarak 2-3 mm arasındadır. Bu süreçte, aksi halde hücre akıbet verimliliği bozulur, bölüm kuru yapmamak.
  3. Epitel hücre tabakası ve bağ dokusu Ayrılması:
    1. 4 ° C 'de 16 saat süre ile kültür 2000 poliüretan / ml dispaz I içeren ortamda ve kültür kesme doku bölümleri bekletin.
    2. Bir çanak için doku bölümleri transfer ve bitişik bağ dokusundan epitel hücre katmanı ayırınız. Mikroorganizmaların kirlenmesini önlemek için temiz bir tezgah bölümleri işleyin.
      Not: epitel hücrelerinin ana bir kültürü gerekirse, adım 1.3 gerçekleştirin. Sadece fibroblastlar izole edilmesi ise daha sonra eksplant kültürü ve hücre geçişleri saflaştırılmış fibroblast popülasyonları elde epitel hücreleri için elverişsiz olması nedeniyle, adım 1.3 sayın.
  4. Doku kesitlerinin Ek:
    1. İki neşter kullanılarak 1 mm'lik parçalar halinde dokuları kıyma. Adet kadar küçük değilse, bunlar çanak daha kolay ayırmak ve hücreler çanak yüzeyinde büyümek için başarısız olur.
    2. Her parça çevreleyen boş bir alana korumak için birbirinden küçük akciğer dokusu bölümleri yerleştirin. Doku bölümlerinin bağlanmasını kolaylaştırmak için bir bisturi bıçağını kullanarak doku kültürü çanağı yüzeyinde çizikler yapın.
      NOT: TaraklıAyrıca hücrelerin göç hangi boyunca kesitler sunmak, hücre büyümesini kolaylaştırmak için görünür.
      1. Seçenek olarak ise, ayrı ayrı, bir 6-yuvalı plakanın her oyuğuna kıyılmış doku parçaları yerleştirmek ve bir kayar kapak ile kapak. Silikon gres kullanılarak plaka yüzeyine kapak kayma takın.
      2. Her iyi steril bir iğne kullanarak 1.5 cm arayla iki noktada silikon gres yerleştirin. Doku parçaları Kapsama çeşitli pasajlar aşağıdaki hücre akıbet ve hücre yayılımı etkinliğini artırır.
  5. Müteakip eksplant kültürü:
    1. Numuneler kurumaya eğer etkin hücre akıbet çoğunlukla kaybolur gibi doku bölümleri, kurumasına önce hafifçe çanak kültür ortamı ekleyin. Çok hızlı doku bölümleri ayırmak gibi orta dökmeyin.
    2. % 10 FBS'li DMEM içinde kültür hücreleri. Ek yüzdürme gelen dekolmanı teşvik gibi, yüzen sağlar ki çok sadece doku karşılamak için yeterli ortamı kullanın, ancakçanak.
  6. Hücre geçişi:
    1. Kültür çanağı tekrar hareket doku bölümlerinin ayrılması yol gibi her zaman dikkatli bir kültür ortamı kullanın.
    2. 5-7 gün boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde kültür kaplarına yerleştirin. Her gün orta Refresh, orta değişiklikleri sırasında minimal kültür yemekleri anlaştım. Fibroblastlar önümüzdeki birkaç hafta içinde doku kesitlerinin kenarından büyümek.
      Not: ~ 2-3 hafta sonra, üzerinde büyüme fibroblastlar neredeyse yüzey alanının miktarına bağlı olarak, kaynaşmaya eriştikten.
    3. 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve plakasına tripsin 1 ml.
    4. Tripsinizasyondan sonra,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM 9 ml kullanarak hücreleri ayırmak. Doku kesitleri ile birlikte bir 10 ml tüp içinde ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler toplanır. Hücre topakları oluşturmak üzere santrifüjden sonra, yeni bir ortam içinde elde edilen pelet yeniden süspanse edin.
    5. Yeni bir cul üzerine hücreleri ve doku bölümleri TohumTure çanak, hangi noktada doku hücreleri yapışır ve büyürken çanak eklemek başarısız. Ertesi gün, aspirasyon ile yüzen doku parçaları kaldırmak ve orta değiştirin. Ekli fibroblastlar sonraki kültürlerle yaymak.

İnsan akciğer fibroblastlan ve Kanser Hücreleri 2. Üç boyutlu Co-kültür

  1. Hücre ve reaktiflerin hazırlanması:
    1. Yaklaşık 2 x 10 5 epitel hücreleri ve kuyu başına 2.5 x 10 5 fibroblastlar kullanın. (3 mg / ml, pH 3) FBS (% 100), yeniden oluşturma tamponu (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO 3, 200 mM HEPES), 5x DMEM DMEM fibroblast kültürü için% 10 FBS ile takviye edilmiş kolajen tip IA hazırlanması ve 3D ko-kültür ortamı (1: kanser hücreleri fibroblast kültür ortamı ve kültür ortamına 1 karışımı).
    2. Kültür A549 akciğer adenokarsinoma hücreleri, fibroblastlar ve DMEM A549 3D ko-kültür,% 10 FBS ile takviye edilmiştir.
  2. Kollajen jel formation:
    1. 1x PBS ile 10 cm çanak kültüre fibroblast yıkayın, ve ben plakasına tripsin 1 ml ekleyin. 37 ° C'de ~ 5 dakika boyunca tripsinizasyondan sonra,% 10 FBS ile takviye edilmiş, 9 ml DMEM kullanılarak hücreleri ayırmak. 10 ml'lik bir tüp içinde bir ortam içinde süspansiyon haline hücreleri toplamak, ve hücre topakları oluşturmak üzere 200-300 xg'de santrifüj.
    2. 5 x 10 5 / ml'lik bir yoğunlukta% 100 FBS içinde elde edilen pelet yeniden süspanse.
    3. Buz üzerinde kolajen jel hazırlayın. Aşağıdaki prosedüre önce bir soğutucuda reaktifler, pipet ve tüpler soğutun. Hatta, buz üzerinde, karışım bir ölçüde katılaştığı ve toplam hacim, tüm bileşenlerin toplamından daha azdır.
    4. Her bir oyuğa olarak, FBS fibroblast süspansiyonu (2.5 x 10 5 hücre), 0.5 mi, 2.3 mi türü IA kollajen, 670 ul 5x DMEM ve 330 ul sulandırma tamponu karıştırılarak kollajen jel hazırlamak. Jeller oda sıcaklığında kolayca ayarlamanıza olanak verir.
      1. Şiddetle homojen bir mil sağlamak için pipetsoğutun. Pipetleme işlemi sırasında hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
    5. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna karışım (3 mi) ilave edilir ve 30-60 dakika boyunca bozukluğu olmadan 37 ° C'de inkübatör içinde jelatinleştirilmesi için izin verir.
  3. Kollajen jel üzerinde Kanser hücre kültürü:
    1. 6 değişiklikler ile daha önce rapor protokol kullanılarak, üç boyutlu bir ko-kültür yapın.
    2. 1 x 10 5 / ml'lik bir yoğunlukta 3D ko-kültür ortamı içinde (ya da A549 hücrelerinin durumunda,% 10 FBS'li DMEM içinde) yeniden süspanse edin, kanser hücreleri.
    3. Her jel yüzeyi üzerine yeniden süspanse hücre çözeltisi (2 x 10 5 hücre) 2 ml dökün. Deney koşullarına bağlı olarak ko-kültür kanser hücreleri ya da fibroblastlarının hücre sayısını değiştirir.
  4. Jel daralma:
    1. Kanser hücreleri kolajen jel ile uygun böylece 37 ° C'de gece boyunca jeller inkübe edin. Her jel ayırın ve o her iyi bir 'yüzen kültürü' oluşturmak6-çukurlu plaka f.
      NOT: Bir yüzen kültürü kullanarak, jelin, boyutu çeşitli değişiklikler birlikte kültüre kanser hücreleri ve fibroblastlar arasındaki hücresel etkileşim aracılık eder mekanik gerilim ve kolajen degradasyonu ile uyarılmaktadır.
    2. Kuyunun kenarına her jel ayırmak için açılı 21 G iğne veya küçük spatula kullanın. Her 2-3 günde bir, 3 boyutlu ortak-kültür ortamı içinde 2 ml ile kuyu yenileyin. 5 gün boyunca her gün, her jelin boyutu ölçülür.
  5. Kolajen jellerin analiz:
    1. Böyle Sircol tahlili gibi kollajen kantitasyon yöntemleri kullanarak her jel kollajen içeriğini ölçün. Jeller 5 RNA topladıktan sonra Transkriptomik analiz veya kantitatif RT-PCR gerçekleştirin.

3. Hava-sıvı Arayüz Kültür ve Invasion Testi

  1. 5 gün boyunca 37 ° C 'de, kolajen jel kültürlendikten sonra yeni 6- bir ağ örgü üzerinde (70 um gözenek boyutu) yerleştirerek hava almasına jeller maruzhavuzlu plakalar hazırlanmıştır. Akış sitometrisi için kullanılan ticari olarak temin edilebilen hücre süzgeçler mesh olun.
  2. Yavaşça 3D ko-kültür ortamı 11 ml her bir doldurun.
  3. Steril bir kaşık kullanarak örgü üzerine jeller yerleştirin ve jeller kalan orta kaldırmak. Havaya jel üst yüzeyini açığa ederken bu durum üzerinde, orta jeller daldırın. Hava-sıvı arayüzü olarak bu kültürün durumu tanımlayın.
    Not: kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de hava-sıvı arayüzü kültür muhafaza 5-7 gün sonra, invazif kanser hücrelerinin jel içine göç ederler. Hücre tipine ve hücresel etkileşimler sonucu olarak, kanser hücrelerinde hücre morfolojik değişim değişik derecelerde hava-sıvı arayüzü kültürü ile uyarılmaktadır.
  4. Histolojik değerlendirme için, oda sıcaklığında bir gece boyunca formalin jel saptamak ve parafin içine gömmek. Hematoksilen ve eosin (H & E) ile dikey bölümleri (4 mikron) Leke. Immünohistokimyasal analiz o gerçekleştirinn bölümler 4.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu ko-kültür yöntemi, tümör mikro taklit, kollajen jeller gömülü kanser hücreleri ve fibroblastlar arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir araçtır. Kolajen jel kasılması, kanser hücresi yayılımını tamamen ve morfolojik değişim önceki çalışmada, üç parametre, bu deneysel modelinde değerlendirildi. Kanser hücre çoğalması da Ki67 immün 4 kullanılarak tahmin edilmiştir. Akciğer doku örnekleri bir rezeksiyon akciğer lobu (Şekil 1A) kanserli ve kanserli olmayan bölümlerde toplanmıştır. Örnekle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Cafs kanser hücrelerini çevreleyen ECM'nin bir bileşenini oluşturmaktadır ve tek tümör için bir iskele sağlar, ancak aynı zamanda aktif tümör gelişiminde 7 katılmaz. Biriken deliller CAF-aracılı tümör ilerlemesi 8 kritik rolleri vurgulayarak, nihai prognozu cafs veya ilgili moleküllerin etkisini unravels.

Bir önceki çalışmada, akciğer cafs 4 izole etmek sonucudur yöntem kullandı. Bu deneyde, bulaşık yüzeyi üzerine doku kesiti yapışma bakım kritiktir. Hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 ve 25460137) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Kollajen tip IANitta jelatin Inc.CELL-1A
Sulandırma tamponuNitta jelatin Inc.
Kapak kaymasıNUNC174934
Silikon gresDow, Corning, TorayYüksek vakumlu gres
Dispase IWAKO386-02271
6 oyuklu plakaBD Falcon353046
Hücre süzgeci (70 & mu; m)BD Şahin352350
, , , , , , , ,

Kaynaklar

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62(2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747(2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kollajen Jel K lt rKanserle li kili FibroblastlarT m r Mikro evresiAkci er Adenokarsinoma H creleriHava S v Aray zH cre nvazyon AnaliziEkstrasell ler MatriksHistolojik Analiz

İlgili makaleler