Yöntem makalesi

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

13.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52475

⸱

19 Şubat 2015

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Parkinson hastalığı sırasında orta beyin dopaminerjik nöronlarının dejenerasyonunun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel kültür sistemleri, bu nöronların nörofizyolojik özelliklerinin incelenmesi için önemli bir araç sağlar. Burada, nörodejenerasyonun in vitro modellemesi için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mezensefalik dopaminerjik (mesDA) nöronların dejenerasyonu, Parkinson hastalığının patolojik özelliğidir. Fizyolojik işlevlerde yer alan biyolojik süreçlerin ve bu nöronların savunmasızlığının ve ölümünün incelenmesi, altta yatan nedenleri anlamak ve bu yaygın nörodejeneratif bozukluğun tedavisini çözmek için önemlidir. MesDA nöronlarının birincil kültürleri, hastalığın seyri sırasında bu nöronların gelişimini, uzun süreli sağkalımını ve dejenerasyonunu anlamak için moleküler, biyokimyasal ve elektrofizyolojik özelliklerin araştırılması için bir araç sağlar. Burada, E12.5 fare (veya E14.5 sıçan) embriyolarından orta beyin dopaminerjik nöronlarının izolasyonu, kültürü ve bakımı için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu protokoldeki optimize edilmiş hücre kültürü koşulları, aksonal ve dendritik projeksiyonların, sinaptik bağlantıların ve diğer nöronal morfolojik özelliklerin varlığına neden olur, bu da kültürleri bu nöronal popülasyonun fizyolojik, hücre biyolojisi ve moleküler özelliklerinin incelenmesi için uygun hale getirir.

Giriş

Substantia nigra gelen dopaminerjik nöronların kaybı compacta Parkinson Hastalığı (PH), ikinci en yaygın nörodejeneratif bozukluk kardinal motor belirtiler neden pars. Bu mezensefalik nöronal nüfusun ölümü yatan nedeni bilinmemektedir. Kullanılmıştır geliştirilmesi ve nörofizyolojik özellikleri ve mesDA nöron, bir kaç hücre kültürü ve hayvan modeli sistemlerinde hayatta modüle edilmesi için sorumlu biyokimyasal yollar incelenmesi. Sıçan dopaminerjik hücre çizgisi 1RB 3, 27 (N27), insan dopaminerjik nöroblastoma hücre çizgisi SH-SY5Y, MN9D ve insan mezensefalik hücreleri LUHMES fare dopaminerjik melez hücre hattı olmak üzere ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri, biyokimyasal ve sınırlı mekanik çalışmalar 1 kullanılmaktadır -5. MesDA nöronların spesifik kaybı çalışmada, birkaç nörotoksin bazlı ve genetik modeller 6-8 geliştirilmiştir. Primer ventral orta beyin kültürlerDopaminerjik nöronlarının nöronal ve sinaptik özellikleri ve bu ortak hastalık patojenezinde rol yolları çalışmak için vazgeçilmez bir araç sağlar.

Burada daha yüksek yaşama şansına sahiptir her embriyo için lamelleri verim artışı ile sonuçlanan değişiklikleri içeren mezensefalik dopaminerjik nöronların izolasyonu için detaylı bir protokol mevcut. Önceden olgun E12.5 fare mezensefalona (sıçan E14.5) kullanımı beka geliştirir. Bu yaşta nöronlar diseksiyonu sırasında sağlam hücreleri bırakır, henüz akson geliştirilen ve böylece önemli ölçüde canlılığını arttırarak stresi en aza indirir değil. Ayrıca, bu protokolün 2. bölümünde açıklandığı gibi ventral orta beyindeki dikkatli diseksiyon, daha beka geliştirir. Embriyo başına lamelleri sayısını artırmak için, alternatif bir kaplama yöntemi, bu protokolün 4. bölümde sunulmuştur. Bu altında 4 lamelleri ile karşılaştırıldığında embriyo başına en fazla 10 lamelleri bir ürün verimine yol açarStandart kaplama koşulları dolayısıyla deney başına hayvan miktarını azaltarak.

Akson ve dentrites kültür sergi akıbet nöronlar, sinaptik bağlantıları oluşturmak ve canlı hücre görüntüleme, İmmünositokimya'da ve elektrofizyolojik çalışmalar için bu kültürlerin uygun hale nöronal ve sinaptik belirteçlerinin varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, sinir hücresi kültürlerinde kullanılması genetik ve farmakolojik manipülasyonunu daha da kolaylaştırır. In vitro olarak 2 gün itibaren dışa doğru büyümesini geliştirme çalışmaları sağlar. Ayrıca, kültür uzun dönem hayatta kalmaları (en fazla altı hafta) bu nöronların yavaş ilerleyici dejenerasyonu çalışma için uygun hale getirmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: hayvanlar muhafaza ve onaylanan kurumsal kurallar ve tüm hayvan prosedürlere uygun ele Imperial College'ın Hayvan Refahı tarafından edildi ve Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve Ev Ofis ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Federal ve eyalet yönetmeliklerine uygun olarak.

1. Reaktif ve Ekipmanları Kurulum

  1. Çözülme, kısım ve -80 ºC mağaza 1 mg / ml laminin çözümü. 1-2 ug / cm2 'lik bir kaplama konsantrasyonunda elde edilen 1 ml DMEM / F12 içinde 2 ul çözülür.
    NOT: yavaşça buz üzerinde ve plakaları / lamelleri eklemek hemen soğuk DMEM / F12 çözülür ve çözülme laminin.
  2. 4 ° C'de 75 ml% 0.01 425 ml PBS Poly-ornitin L-ve mağaza içinde seyreltin.
    NOT: Çalışma çözümün raf ömrü bir ay kadardır.
  3. Bir ye kadar 4 ° C'de% 25 (ağırlık / hacim) PBS içinde BSA, pH 7.4, ve mağaza çözülürar.
  4. (HBSS)% 50 FBS devre dışı bırakma ortamı hazırlayın.
  5. (+) - - Glikoz (ağırlık / hacim),% 0.25 BSA (ağırlık / hacim), 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 x N2 ek,% 5 (hacim / hacim) FBS,% 0.36 ilave edilmesi ile tam bir ortam hazırlama DMEM / F12 ve mağaza 4 ºC'de.
    NOT: raf ömrü 10 gün kadardır.
  6. En az 30 dakika boyunca% 70 (hacim / hacim) kaynayan etanol içinde yer lamelleri yağ ve otoklavın kalıntılarını gidermek için.
  7. Talep 24 oyuklu plakalarda lamelleri ve her bir oyuğa 500 ul Poli-L-ornitin solüsyonunu ilave edin. Oda sıcaklığında doku kültürü başlık altında 1 saat inkübe ve daha sonra 500 ul su ile 3 kez yıkanır. Her plaka için 500 ul, laminin solüsyonu eklenir ve 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde, O / N inkübe edin.
    NOT: yıkamalar 24 saat kültürden sonra hücrelerin ölümü ile poli-L-ornitin en az üç kez yıkama sonuçlarını laminin tedaviden sonra gerekli olsa da.
  8. Doğal gaz veya meşale f üzerinde cam pipetler ipuçları parlatmaktopal.
    NOT: Bu adımdan sonra ucu çapı normal boyutunun yaklaşık yarısı olmalıdır.
  9. Bir otoklav makas ve otoklav kullanarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kapakları kesilir.

Embriyonik ventral orta beyindeki 2. Diseksiyon

  1. Uyuşturmak zamanlanmış-gebe (E12.5) CO 2 inhalasyon yoluyla barajlar ve daha sonra servikal dislokasyon ile euthanize.
  2. % 70 etanol ile karın Sprey ve rahim keseler tüm maruz kadar bir karın kesi yapmak. Forseps vajinal eki kesme ve rahim kaldırmak. 100 mm Petri kabındaki, buzla soğutulmuş HBSS rahim yerleştirin.
  3. Forseps (Şekil 1C) kullanarak, rahim ve amniyon kesesi embriyolar çıkarın. Buzla soğutulmuş HBSS yer embriyolar.
    NOT: Şekil 1D dikdörtgen embriyonik ventral orta beyindeki yerini gösterir.
  4. Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında embriyolar yerleştirin ve mezensefalik teşrih, berzah ve mezensefalik-diensefalik sınır bölgesinde beyin kesme bioscissor ve forseps kullanarak kemer (Şekil 1E, kesi hatları için 1A Şekil bakınız).
  5. Tüm Ortabeyin dışarı aldıktan sonra, mediodorsal orta beyin (Şekil 1F) bir kesim yapmak.
  6. İki forseps (Şekil 1 H) kullanarak, meninksler çıkarın.
    NOT: KRİTİK ADIM: Bu adım, optimum verim ve nöronal hayatta kalmak için gereklidir. Kültür şartları, beyin hücreleri için uygun olduğu için, çevreleyen dokudan hücrelerin en kaplamadan sonra ölür ve bu dokudan apoptotik sinyal kültürlerinin bütünlüğüne zarar verebilir.
  7. Bir sterilize tıraş bıçağı (Şekil 1 H, I) kullanılarak, kelebek şekli gözlemlemek ve her kanat yaklaşık yarısını kesmek için Petri kabı orta beyin doku düzeltin.
    NOT: Şekil 1J izole ventral Ortabeyin göstermektedir.
  8. Transferi15 ml konik tüp buz-soğuk HBSS içine ventral orta beyindeki parça ve bir sonraki embriyo devam edin.
    NOT: 2,1-2,8 fazla 1 saat almamalıdır adımlar. Buz üzerinde bu zaman dilimi dışında embriyolar tutulması önemli ölçüde hücre canlılığını azaltır.

Ventral Orta beyin hücrelerinin 3. Ayrılma

  1. Laminer akış kaputun altında ventral orta beyindeki parçalarını aktarın. HBSS çıkarın ve (ventral orta beyindeki kadar 12 adet yeterli hacim) konik tüp içine önceden ısıtılmış, 1 ml (37 ° C),% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 5-10 dakika süreyle 37 ° C'de doku inkübe edin.
  2. Kaputun altında tripsin-EDTA çıkarın ve doku 1 ml de-aktivasyon orta (serum tripsin devre dışı bırakır) ekleyin.
  3. Devreden Ortamı çıkarın ve iki kez tam bir ortam 1 ml doku yıkayın.
    Not: ayrışmış hücreleri atmadan önlemek için, boru tüm orta çıkarılması ve doku pipetleme kaçının.
  4. 1ml tam orta ve trit ekleBir yangın cilalı cam pipet ile doku ürat. Kabarcıkların oluşumunu önlemek ve tek hücre süspansiyonu elde edilinceye kadar triturating devam edin.
    NOT: Genellikle 8-10 tam ayrışması için gerekli olan kısıtlı ucu geçer.
  5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve ortam maddesinin ayrılması.
  6. Yeniden askıya yavaş yavaş pipetleme tam orta 1 ml pelet ve aşağı yukarı dört kez.

4. Kaplama Ventral Orta beyin Hücreler

  1. 90 ul Trypan mavi çözeltisi ile hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve bir hemositometre ile hücre sayısı.
    Not: Hücrelerin canlılığı, aynı zamanda, bu aşamada kontrol edilebilir.
  2. Kapaklar üzerine her seferinde bir forseps, birini kullanarak, 100 mm Petri tabaklarda steril mikrosantrifüj tüpü kapaklar yerleştirin ve Poli-L-ornitin / laminin kaplanmış lamelleri aktarın.
    NOT: lamelleri yıkamayın ve bu uneve neden olabilir çünkü, laminin kurumasını önlemekN kültürleri ve hücre hayatta kalma azalma.
  3. (Hacim harcanmadan, lamel yüzeyini kaplamak için uygun olan) tam orta eklenerek 1 ul başına 1500 hücre hacmini ayarlamak ve her bir lamel üzerine hücre süspansiyonu 100 ul (150,000 hücrelerin toplam) ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde Petri kapları kapatın ve 1 saat süre ile inkübe (37 ° C,% 5 CO2).
    Not: KRİTİK ADIM: Bu adım, hücre eki ve canlılığını geliştirmek için ve her embriyo için lamelleri sayısının arttırılması için gereklidir. Seçenek olarak ise, hücreler direkt olarak oyuklara (ihtiva lamelleri), ancak hücre sayısı (yerine 150,000) oyuk başına 350,000 artırılmalıdır aktarılabilir. Doğrudan transferi nedeniyle (yanında veya lamelleri altında) plakaları takmak hücrelerin, yaklaşık 3-4 lamelleri verir iken, diğer bir deyişle, bu yöntemi kullanırken, 8-10 lamelleri, elde edilebilir. Ortalama viabiliBu yöntemi kullanarak, kültürlerin Ty, yaklaşık% 90 idi.

5. Kültür Büyüme ve Bakım

  1. Inkübasyondan 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde 400 ul önceden ısıtılmış (37 ° C kadar) tam bir ortam ihtiva eden 24 oyuklu plakalar içinde ortam dahil olmak üzere lamelleri transferi (toplam hacim: 500 ul). 37 ºC hücreleri O / N inkübe.
  2. Kuyular inkübasyonundan sonra, 24 saat içinde yavaşça, her bir oyuğa 500 ul komple ortam ekleyin.
    Not: ilk birkaç saat dopaminerjik nöronların hayatta kalma ve bu noktadan sonra önemli ölçüde değişmez hayatta kalan hücrelerin sayısı en kritik aşamadır.
  3. İlk iki hafta için veya orta sarı olana kadar kültürlere ek ortam eklemeyin. Iki haftadan daha uzun veya taze tam önceden ısıtılmış medya (genellikle her iki hafta) sarı, medyanın değişim yarısı (500 ul) orta renk değişiklikleri için kültürleme edin.
    NOT: içinde dopaminerjik nöronlarkültürler bu koşullar altında daha 6 hafta boyunca hayatta olurdu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tirozin hidroksilaz (TH) karşı İmmünohistokimya kültürdeki hücre 0.5-1 arasında,% dopaminerjik olduğunu göstermektedir. Tirozin hidroksilaz (TH) ve mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) antikorları (Şekil 3) kullanılarak, nöronal projeksiyonları kaplama sonra 2 saat içinde ortaya çıkar ve ilk gün, akson ve dendritler ayırt (Şekil 2). nöronlar fazla altı hafta boyunca hayatta ve kapsamlı akıbet göstermektedir. daha önce gösterildiği gibi kültürler nöron-glia oranı doğrudan ortam içinde se...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Orta beyin dopaminerjik nöronları, merkezi sinir sisteminde dopamin ana kaynağıdır. Üç gruba ayrılır, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventral tegmental alan (VTA) ve retrorubral alanı (RRF), 10, 11. SNpc ve VTA'da nöronlar gibi duygu, motivasyon ve motor davranışlarının kontrolü gibi işlevleri dahil, mezokortikal mezolimbik ve nigro-striatum büyük dopaminerjik yollar, yol. SNpc ve nigrostriatal sistemi fonksiyonel bozulma nöronların ölümü, ikinci en önemli nörodejeneratif bozukluk, Parkinson hastal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması beyan edilmedi.

Teşekkürler

Bu çalışma, Imperial College London Beyin Bilimleri Bölümü, Tıp Bölümü, K.N.A.'ya sağlanan başlangıç fonları kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle orta besin karışımı F-12Invitrogen11330
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (1X), sıvıInvitrogen24020-117
Fetal sığır serumu, ısıyla inaktive edilmiş (FBS)Invitrogen16140
N2 Takviyesi (100X), sıvıInvitrogen17502-048
D-(+)-Glikoz su içinde çözelti (ağırlıkça %45 (ağırlıkça/hacim)) SigmaG8769
Sığır serum albümini BSASigmaA9430
Engelbreth-Holm-Swarm murin sarkomu bazal membranından LamininSigmaL2020
Penisilin / streptomisinInvitrogen15070
Tripsin (% 0.05 (wt / vol)Invitrogen25300
Sığır serumu albümin (BSA) hücre kültürü test edildiSigma A9418
Fosfat tamponlu salin (PBS)SigmaP3813
Anti-Tirozin hidroksilaz (Th) antikoruPel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poli-L-ornitin,% 0.01 çözeltiSigmaP4957
Anti-Map2 (Mikrotübül ile ilişkili protein-2A ve -2B) antikoruMilliporeMAB3418
Anti-Sinapsin-1 antikoruMilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG ve nbsp;   antikorMoleküler ProblarA-21206
Alexa Fluor 594 eşek anti-tavşan IgG & nbsp;   antikorMoleküler ProblarA-21207
Alexa Fluor 488 eşek anti-koyun IgG & nbsp;   antikorMoleküler ProblarA-11015
Alexa Fluor 594 eşek anti-koyun IgG & nbsp;   antikorMoleküler ProblarA-11016
Alexa Fluor 594 eşek anti-fare IgG & nbsp;   antikorMoleküler ProblarA-21203
Tripan mavisi çözeltisi (ağırlıkça% 0.4 (hacimçe / hacim))Biowhittaker17-942E
Stereo MikroskopCarl ZeissStemi 2000-C
Ters faz kontrast mikroskobuCarl ZeissAxiovert 40 C
Dumont Forsepsİnce Bilimsel AraçlarMayıs-45
Kapak Kaymalı Forseps – Dumoxelİnce Bilimsel Aletler11251-33
İki Dumont #45 Forseps – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Bıçak Tutucu/Kırıcı Düz Kavrama - 11cmFine Scientific Tools10052-11
Öğrenci İris Makası - Düz 11,5 cmİnce Bilimsel Aletler91460-11
Fiber optik halojen aydınlatıcıNikonMKII
Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör PipetleriFisherbrand13-678-20C
HemositometreProscitechSVZ2NIOU
0.2 & m steril filtre üniteleriNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm Petrikapları BD Biosciences351005
Yuvarlak Kapak Kayma # 1 Kalınlık Alman Camı 12 mmBellco Cam1943-10012 

Kaynaklar

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11(2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27(2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primer N ron K lt rVentral Mezensefalon DiseksiyonuDoku Disosiyasyonumm nofloresan MikroskopiTirozin Hidroksilaz BoyamasH cre Canl l AnaliziL mel Haz rlamaLaminin KaplamaUzun S reli N ron Bak m

İlgili makaleler