Yöntem makalesi

Fare Kemik İliği monositlerin Takip İn Vivo

DOI:

10.3791/52476

⸱

27 Şubat 2015

 ,  ,  , 
1Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerçek zamanlı çoklu foton görüntüleme, fizyolojik 3 boyutlu ortamlarında hücre trafiğini ve hücreden hücreye etkileşimleri incelemek için harika bir fırsat sağlar. Bağışıklık hücrelerinin biyolojik aktiviteleri esas olarak motilite kapasitelerine bağlıdır. Kan monositlerinin kan dolaşımında kısa bir yarı ömrü vardır; Kemik iliğinden kaynaklanırlar ve yapısal olarak ondan salınırlar. Enflamatuar durumda, bu süreç artar, bu da kan monositozuna ve ardından periferik enflamatuar dokuların infiltrasyonuna yol açar. Kemik iliğinden vasküler ağa doğru monosit trafiğini kontrol eden biyomekanik olayların tanımlanması, monositin fizyopatolojik önemini anlamak için önemli bir adımdır. Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) farenin kafatası kemik iliğinin iki foton mikroskobu ile in vivo hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirdik. MacBlue faresi, vasküler ağ etiketlemesi ile birlikte bir miyeloid spesifik promotör 1'in kontrolü altında floresan raportörlerin gelişmiş camgöbeği floresan proteinini (ECFP) eksprese eder. Bu yaklaşımın, kemik iliği parankimi ve damar sistemi içindeki göç davranışını ve hücreden hücreye etkileşimleri daha da ölçmek için bireysel medüller monositlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesini nasıl sağladığını açıklıyoruz. Bu yaklaşım, kemik iliği monosit alt kümelerinin biyolojisi hakkında yeni bilgiler sağlar ve bu hücrelerin belirli patolojik durumlarda nasıl etkilenebileceğini daha fazla ele almaya izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği hematopoezde merkezi bir rol oynar ve kan ile medüller parankim arasında yapısal olarak yeniden dolaşan, kısa ömürlü dolaşımdaki monositler havuzunu yenileyen 2,3 ve kararlı durum doku makrofajlarının ve dendritik hücrelerin 4 yeniden yapılandırılmasına katılan ana monosit rezervuarını temsil eder. Enflamasyon sırasında veya geçici aplaziden sonra, monositler kemik iliğinden veya dalak 5, 6, 7'den aktif olarak mobilize edilir ve iltihaplı organları kolonize eder. Kemik iliğinden miyeloid hücre mobilizasyonu sürecinde çeşitli kemoatraktan eksen yer almıştır 8, 5, 6,9. Miyeloid bölmenin ötesinde, kemik iliği aynı zamanda T lenfosit astarının 10 önemli bir bölgesi ve immünolojik hafızanın 11,12 bir nişidir. Bu nedenle, bu doku hematoloji ve immünoloji alanındaki çok sayıda araştırma için merkezi öneme sahiptir. Medullar miyeloid hücrelerin yapısal organizasyonu hakkındaki bilgilerimiz esas olarak sabit dokuların histolojik kesitinin analizinden kaynaklanmaktadır 13. Bu statik görüş, fonksiyonel aktivitesinin temeli olan kemik iliğinin farklı bölmeleri arasındaki hücresel değişim dinamiğinin incelenmesine izin vermez.

İntravital görüntüleme, daha önce sadece in vitro sistemlerden tanımlanan hücre hareketliliği, hücre uyumu ve hücreden hücreye etkileşimlerin çalışmasında önemli bir biyolojik girdi oluşturmaktadır. Uygun intravital görüntüleme için teknik zorluklar arasında, ilgilenilen dokuya optik bir bakış açısıyla ulaşma ve fizyolojik (nefes, kas veya peristaltik kasılmalar) veya mekanik sürüklenmelerden (cerrahi sonrası doku bozulması ve uzaması ve mikroskop objektifine maruz kalmanın yanı sıra sıcaklık ve vasküler / oksijenasyon bozulmaları) izolasyonunu en üst düzeye çıkarma yeteneği yer alır. Mikroskobik sürüklenmeler, odağı uzun süre tutma yeteneğini sınırlayabilir ve hücre motilitesinin nicelleştirilmesinde artefaktlara neden olabilir. Bu teknik zorlukları azaltmak için birkaç doku için doğrulanmış bir alternatif, termostatlı ve oksijenli bir ortamda inkübe edilen ekilen doku üzerinde çalışmaktır; Bununla birlikte, lenfatik ve vasküler dolaşımın tamamen bozulması sorunlu olabilir. Kafatası kemik iliğinin intravital görüntülemesinin bu konularla ilgili çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, minimal cerrahi eylem gerektirir. İkinci olarak, bu bölgedeki kemiğin kalınlığı, kemik iliği nişlerinin aşındırma olmadan doğrudan görüntülenmesine olanak tanır ve böylece fizyolojik bozulmaları azaltır. Müller ağ, kemiğin parasagital bölgesinde görüntülenebilir; Bununla birlikte, sinüzoidler, kemik matrisinin daha ince olduğu fronto-parietal bölgede daha belirgindir12,14.

İntravital görüntüleme, ilgilenilen popülasyonu etiketleyen en doğru floresan raportörün mevcudiyetine dayanır. Evlat edinici transferden önce saflaştırılmış hücre popülasyonunun in vitro olarak etiketlenmesi, hematopoietik kök hücre nişlerinin 15 veya tümör aşılamasını destekleyen kemik iliği endotelyal mikro alanlarının 16 önemli karakterizasyonuna yol açtı ve immünolojideki temel kavramlar hakkında birkaç temel girdi sağladı 17 . Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle yüz binlerce hücrenin daha sonra in vivo olarak tespit etme şansı elde etmesini gerektirir. Bu, boyamayı takiben yüksek ölüm oranı, tüm vücuttaki seyreltme ve aktivasyon durumundaki değişiklik ile açıklanabilir, bu da önyargılı hedef aramaya yol açabilir. Transgenik fare sisteminden endojen etiketleme, bu sınırlamaların büyük ölçüde üstesinden gelir ve endojen osteoblast 8, megakaryositler 18 veya miyeloid-soy alt kümelerinin 6 davranışını görüntülemeye izin verir. Bununla birlikte, incelenen alt küme arasında floresan raportörün özgüllüğü göz önüne alındığında dikkatli olunmalıdır.

MacBlue fare 1 olarak adlandırılan Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, gerçek zamanlı görüntüleme 6 ile medüller monositleri incelemek için değerli bir transgenik sistemdir. Yüksek moleküler ağırlıklı rodamin-dekstranın intravenöz enjeksiyonu, medüller parankimi kemik iliğinin vasküler sinüzoid ağından ayırır. Bu yaklaşımı kullanarak, belirli bir fizyopatolojik ilgi bağlamında farklı medüller kompartmanlardaki monosit davranışını izlemek mümkündür. Ayrıca, spesifik bir antikor kullanarak in vivo etiketleme yoluyla monosit dinamiklerini nötrofillerinkiyle karşılaştırmak için ek bir strateji öneriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm deney protokolleri Fransız Hayvan Deneyleri Etik Kurul tarafından onaylanan ve sayı A-75-2065 ile "Hizmet Koruma et Santé Animales, Çevre'den" tarafından doğrulanmıştır. Örnek boyutları deneylerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için seçilmiş ve hayvan etiği düzenleme 3R göredir.

Mouse 1. Hazırlık

  1. Anestezi
    1. Görüntüleme kısa bir süre (en az 1 saat) için, ketamin (100 mg / kg) ve ketamin (10 mg / kg) ihtiva eden bir tuzlu su çözeltisi içinde 200 ul karın içinden enjeksiyonu ile fare uyuşturan.
    2. Alternatif olarak, görüntüleme uzun süre (4 saat kadar), bir uyarlanmış maske aracılığıyla O 2 / N 2 O, bir 70/30 karışımı içinde buharlaşmış izofluran% 2.5 bir inhalasyon ile fare uyuşturan.
    3. NOT: Bu şekilde daha kararlı bilinçsizlik sağlar ve ilaçların seri intraperitoneal önler.
    4. Fare uyuşturulduktan sonra, pense ile ayak pedi uyarılması yoluyla bilinç için kontrol edin.
  2. Vasküler boyama / ek boyama
    1. Vasküler boyama için: kuyruk damarından damardan Rodamin-Dextran 200 ul (2 MDA salin tamponu içinde 10 mg / ml) enjekte edilir.
    2. Nötrofil boyama için: kuyruk damarından salin çözeltisi 100 ul (klon 1A8) Ly6G-PE 2 ug enjekte edilir.
  3. Sabitleme
    1. Immobilizasyon için, mikroskop ve anestezik gaz İnhalatörde uyarlanmış bir ölçüye stereotaktik tutucu kullanın.
      NOT: sterotaktik tutucu hayvanın kafasını sıkmak için diğer çıkarılabilir ve uyarlanabilir iki metal plaka parantez, bir sabit olmak ve bir metal destek olduğunu.
    2. Nefes hareketleri izolasyonu sağlamak için tespit plakaları arasında fare kafasını takın. Istinat plakaları ve sk germek için kafa arasındaki kulaklarını sıkıniçinde. istikrarın ve hayvan nefes refahı için kontrol edin.
  4. Saç derisini çıkarın
    1. Dikkatle gözlerle temas kaçınarak, steril bir aplikatör ile kafa derisi saç ıslak etanol% 70 kullanın.
    2. Tam frontal kemik parietal kemiğin geriye doğru derisi kaldırmak için steril makas ve pense ile cilt kesin. Kapsamlı kanamayı önlemek için gözleri ve kulakları 3 mm'ye kadar uzak tutun. Kafatası (periost) kapsayan gevşek bağ dokusu çıkarın. Sıcak PBS-batırılmış kağıt havlu ile kalan saç yıkayın.
  5. Daldırma sistemi kurmak
    1. Doğrudan dağılımını kontrol etmek, küçük bir iğne kullanılarak kafatası cerrahi yapıştırıcı ile 18mm çapında bir lastik halka yapıştırın. (30 ul yeterli olmalıdır) sızmasını önlemek için kauçuk halka tüm çevresi boyunca tutkal.
    2. PBS-batırılmış kağıt havlu ile halka altında son bir kez kafatası temizleyin ve sonra tam daldırma için 37 ° C PBS ekleyinkafatası. Göz kuruluğu önlemek için fare her göz NaCl% 0.9 solüsyonu veya belirli oftalmik merhem bir damla ekleyin. Amaç altında stereotaktik tutucu sürükleyin.
    3. Yaklaşık doğrudan iletim yoluyla mikroskop oküler kullanılarak alanını yerleştirin.

2. İki foton Görüntüleme Edinme

  1. Seçici 680 1.080 nm ayarlanabilir, NUR ışık 140fs darbeleri sağlayan Safir kristal lazer, lazer ve güç kontrolü için bir acousto-optik modülatör: Ti ile birleştiğinde bir multiphoton mikroskop kullanın. 2 dikroik aynalar (565 nm ve 690 nm), 565/610 ve 500/550 bant geçiren filtreler kombinasyonu ile (3 floresan kanalları aynı anda kayıt etkin) 3 harici olmayan descanned dedektörleri (NDD) içeren bir yapılandırmayı kullanın ve bir 20 (NA = 1) suya daldırma hedefi × bir plan apochromat ile 485 kısa geçiren filtre,.
  2. ANAES iyi homeothermy izin vermek için, ısıtma odacığı ayarlamaanestezisi sağlanır fare.,
    NOT: Sıcaklık daha iyi stabilite için oturumu görüntüleme önce 1 saat ayarlanmış olabilir. Bizim durumumuzda, 32 ° C anestezi fare optimal vücut ısısını (36-37 ° C) elde etmek için seçilmiştir ve 4 saat kadar muhafaza edilir. Bu sıcaklık, kullanılan (dijital sistemi bu noktada kontrol etmek için kullanılabilir) sisteme adapte edilebilir. Buna ek olarak, kullanılan ısıtma odası siyah / koyu ve dış ışık kirlenmesini önlemek için sistemde (hedefleri ve motorlu plaka) bir kısmını kapsamaktadır.
  3. Sistemi açın
    1. Safir lazer, daha sonra tüm mikroskop sistemi: Ti açın. Toplama yazılımı başlatın. 870 nm lazer dalga boyu aralığını ayarlayın. Kayıt için uygun NDD seçin.
      NOT: Bizim durumumuzda, ikinci harmonik üretimi (SHG) 19 ve mavi floresan proteini (eCFP) 485 kısa geçiş filtresi sonra NDD tarafından tespit edilir. 500/550 bant geçiren filtre ve rodaminle dekstran t ile tespit edildikten sonra eCFP da NDD tarafından tespit edilirO NDD 565/610 bant geçiren filtre sonra.
  4. Satın alma ayarlarını yapma
    1. Yazılımın "canlı kazanım" görüntüleme komutunu kullanın ve mikroskop yön kontrolü kullanarak, eCFP ve Rodamin sinyali ile bir bölgeye odağı ayarlamak. En az foto-hasarı ile en iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için en az bir lazer güç.
      NOT: Kullanılan güç ayarı ilgi bölgenin derinliğine göre değişir. Genellikle AOM ayarları 15 mW civarında hedefi ötesinde bir lazer gücü temsil% 20 civarında, ayarlanır. Her NDD foto-ağartma ve fotoğraf zararı azaltmak için Proje Yönetim Ekipleri kazanç gücünü artırmak için daha iyidir. Tipik satın alma ayarları tek 1.58 us piksel bekleme süresi ile tarama ve 1.5 büyütme 512 x 512 piksel çözünürlük vardır.
  5. Ilgi Seç bölgeleri
    1. Kayıt parametreleri ayarlandıktan sonra, tekrar "canlı" satın alma komutunu kullanınve gerçek zamanlı olarak izlenmesi gereken bir arzu (x, y, z) alanını seçmek için doku anket.
      NOT: Genellikle, biz vasküler ve parankimal alanlar hem de dahil olmak üzere bir alan seçti.
    2. "Pozisyon" yazılım komutu ile alan kaydedin.
      Not: Bu komut x, y, farklı uzak alanlarda z koordinatlarını ezberler.
    3. Seçin ve aynı prosedürü kullanarak (3 kadar) ilgi ek alanları kayıt.
    4. Seçilen büyütme ile gerekli hacme göre birinci hafızaya pozisyona "z-yığın" yazılım komutu ile 3D z-yığını ayarlayın. İlk derin konumunu ve daha sonra yüksek konumunu ezberleyin. Derinliği ile lazer gücünü Normale.
      NOT: Birden fazla eşzamanlı alan görüntüleme için, 12 mikron kalınlığında bir hacim elde etmek her alan için 3 mikron z-adımlarla ayrılan 5 dilim kazanır. Bu ayarlar, çalışılan hücre tipine uygun olabilir.
  6. Başlat edinimi
    1. Seçmek220; zaman serileri "yazılım komutu ve zaman aralığı süresini ve döngü sayısını seçin. "Denemeyi başlatmak" yazılım komutu seçerek gerekli zaman atlamalı ve süresine göre zaman atlamalı görüntüleme başlayın.
      NOT: Bizim durumumuzda, biz 30 dakika gerçek zamanlı temsil 60 döngüleri sırasında bir hacim, her 30 sn kazanır. Daha küçük zaman atlamalı damardaki hızlı hücre haddeleme izlemek için gerçekleştirilebilir. Bu durumda ince z-yığın ve en fazla 2 farklı alanlarda aynı anda kaydedilebilir.
    2. Set up düzenli olarak izlenmesi.
      1. Her zaman bilinçsiz olduğundan emin olmak için hayvan izlemek.
        NOT: bıyık veya hayvanın bacakları Çalkalamalı canlanma göstergeleri vardır. Hayvanın solunum sarsıntılı durumda, izofluran miktarı biraz azaltılabilir. Edinimi sırasında Güçlü doku sürüklenme fare canlanma bir göstergesidir.
      2. Hedefi emin olunuz batırılır. 37 ° C PBS betwee yenileyinn iki satın almalar (30 dk).
        NOT: edinimi sırasında sinyal Aşamalı kaybolması PBS kaçak göstergesidir.
  7. Prosedürün Sonu
    1. Gerekli videolar kaydedilir sonra, hızla resüsitasyon önce servikal dislokasyon ile hayvan euthanize.
      Not: yara iyileşmesi uzunlamasına görüntüleme gerçekleştirmek için sınırlandırır 24-48 saat içinde bir yara oluşmasına yol açar.

3. Veri Analizi

  1. Drift düzeltme
    1. 3D Otomatik izleme için Imaris Bitplane yazılımını kullanın.
    2. Imaris 3D görüntü dizisi açın. Seçin komutunu "nokta", ve homojen alanda dağıtılan mümkünse, 4 farklı bağlantı noktaları en az her zaman noktalarında için manuel izleme (klik + shift) oluşturmak.
    3. "Düzenlemek parça" sekmesinde "Doğru sürüklenme" komutunu kullanarak sürüklenme düzeltme uygulayın.
    4. T edinO x düzeltme, y ve z özellikle kalite artefactual kararsız önlemek için.
      NOT: düzeltme değil tatmin edici değilse, diğer bağlantı noktalarını deneyin ya da analiz videoyu hariç.
  2. Hücre izleme
    1. Komutu "Yeni noktalar eklemek" kullanın ve algoritma ayarı "zamanla iz noktalar" seçeneğini seçin. Bir sonraki adıma gidin.
    2. "Kaynak kanalı" komutunu kullanarak ilgi tüm kanalda ya otomatik hücre izleme prosedürü uygulayın. 10 mikron Set nesneleri (yani, hücreler) çapı. Bir sonraki adıma gidin.
      NOT: seçim ölçülen sinyalin nesneler ve özgünlüğü arasındaki ayrım bağlıdır. Kısacası, tüm kanalda otomatik izleme Saptanan sinyal ilgi nesneye özgü yalnızca mümkündür. SHG ve eCFP hem 485 kısa geçiş filtresi sonra NDD tarafından tespit Çünkü, izleme daha spesifik ve 5 sonra NDD tarafından kaydedilen eCFP sinyalini kullanarak etkili olacak00/550 bant geçiş filtreleri. Kümelenmiş veya yoğun paketlenmiş nesneler 3.1.2 adıma benzer bireysel nesnelerin manuel seçim gerektirir.
    3. , "Kalite" filtre türünü seçin belirsiz nesnelerin izleme dışlamak için eşik ayarlayın. Bir sonraki adıma gidin.
    4. İki noktalar arasındaki "Max mesafe" ve "Boşluk boyutu" doğru parametreleri ile "Brown Algoritması Motion" seçiniz. Parça nesil doğrulayın.
    5. Parçalar otomatik olarak hesaplanır sonra, "parça süresi" filtre türünü seçin Tracks (4 kez puan temsil eden) daha kısa, 120 sn ortadan kaldırmak için eşiğini ayarlamak.
    6. Zorunlu: otomatik izleme sonra, parça kalitesini kontrol edin.
      1. Nesneleri parça yolları takip kontrol etmek için zaman çubuğunu önüne sermek. , "Düzenlemek" sekmesinde bulunan iz noktası düzeltme seçenekleri kullanın değilse: "delete" komutu (herhangi bir iz s silmek sahte veya uygunsuz parçaları silinoint ayrı ayrı) "kesmek" komutunu kullanarak. Parça yolu süreksiz ise, eksik zaman noktaları (klik + shift) ekleyin belirli bir yolda tüm noktaları seçin ve kullanmak "düzenlemek parça" sekmesinde komutunu "connect".
  3. Niceleme parametreleri
    1. "Tercihler" komutu "İstatistik" sekmesini seçin listesinde ilgi dinamik parametrelerini seçin. Seçin komuta ve oluşturulan excel dosyasını kaydetmek "dosyasına tüm istatistikleri verme".
      NOT: Çeşitli dinamik parametreler doğrudan böyle bir parça uzunlukları, anlık hız, ortalama hız gibi yazılım elde edilen ve doğruluk takip edilmektedir. Hareketlilik katsayısı 6, 20 tespit edilebilir ancak doğrudan yazılım tarafından sağlanan değil.
    2. Her hücre için, zaman (Dt), her dönem için değiştirmelerin ortalamasını hesaplamak (30 sn zaman atlamalı film için, ¨t 30, 60, 90 sn, vb olacak).Zaman aralığının bir fonksiyonu olarak kare yerinden ortalamasını çizilir. Eğrinin doğrusal parçası eğiminin hesaplanması ile motilite katsayısı elde edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kafatası yapısı intravital görüntüleme, kemik iliği fizyoloji çalışmak için iyi bir fırsat sunuyor. Ön-parietal alanı çevresinde ince olan kemik, kemiğin aşınma olmadan medulla nişler erişim elde etmek mümkündür. 1 MacBlue transgenik fare kafatası geniş bir 2D alanını temsil Şekil. kemik matriksi esas olarak SHG 19 tarafından kolayca tespit edilebilir kollajen oluşmaktadır. Rodaminle Dekstranın Enjeksiyon kemik iliği damar ağı lekeleri ve kemik matrisi ve gemilerin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vivo görüntüleme yönteminin kritik noktaları görüntüleme süresini maksimize etmek ve inflamatuar hücrelerin dinamiklerini etkileyebilecek bakteriyel kontaminasyon ve inflamasyon riskini en aza indirmek için odak istikrarı sağlamak için vardır. Cerrahi kemik iliği erişmek için minimal gerçekleştirilen gibi kafatası kemik iliği Görüntüleme bu amaçlarını izler. Steril malzeme ve antiseptik kullanımı hücre homeostazındaki pertürbasyon neden olabilecek enfeksiyon riskini sınırlamak için esastır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar editoryal yardım için Anne Daron ve Pierre Louis Loyher teşekkür etmek istiyorum, iki-foton mikroskop ve yardım damızlık fareler için hayvan Facility "NAC" ve Camille Baudesson yardım için Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS). Hibe sözleşmesi kapsamında bu sonuçlara önde gelen araştırma Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı fon aldı (FP7 / 2007-2013) n 304.810 ° - baskınlar, ve n Université Pierre et Marie Curie gelen Inserm den 241.440-Endostem, ° "Ortaya "la gelen" "dan," Ligue contre le kanser Derneği la Recherche sur le Kanser dökün "ve gelen" Agence Nationale de la Recherche "Program Doğuşu 2012 (ANR-EMMA-050). PH la "Ligue contre le kanser" tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KetaminMerial100 mg / ml, anestezik
XylazinBayer HealthCare10 mg / ml, anestezik
IsofluranBaxter% 2.5, anestezik
O2< / sub> / NO2< / sub>70/30 karışımı, anestezik
Rhodamin-DextranInvitrogen2 MDa, 10 mg / ml, Vasküler boyama
Ly6G-PEBecton-Dickinsonklonu 1A8, nötrofil boyama
Stereotaktik tutucuEv yapımıcerrahi
Etanol %cerrahi
Steril makas ve pensecerrahisi
Kauçuk halka18 mm çap, cerrahi
Glubran 2Queryo TıbbiCerrahi Tutkal, kauçuk halka fiksasyonu
Küçük ölçülü iğnelerTerumocerrahisi
Zeiss LSM 710 NLO multifoton mikroskobu Carl ZeissMikroskop
Ti: Safir kristal lazer & nbsp;NIR ışığının Tutarlı Bukalemun Ultra140 fsec darbeleri
Zen 2010Carl ZeissSatın Alma Yazılımı
Imaris Bitplane BitplaneAnaliz Yazılımı, 3D otomatik izleme
PBS 1XD. Dutschercerrahisi
Termostatlı odaCarl Zeissintravital görüntüleme
70

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
  2. Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
  3. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
  4. Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
  5. Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
  6. Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
  7. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  8. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
  9. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
  10. Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
  11. Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
  12. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  13. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
  14. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
  15. Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
  16. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  17. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  18. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  19. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
  20. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  21. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
  22. Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
  23. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ki Foton G r nt lemeCSF1R Reporter FareVask ler A EtiketlemeGer ek Zamanl zlemeH cre Trafi i AnaliziMonosit Mobilizasyonuntravital MikroskopiKafatas Kemik li iFloresan H cre zleme

İlgili makaleler