Yöntem makalesi

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

9.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52480

⸱

7 Ocak 2015

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

Bu makalede

Özet

akışından lökositleri için iltihaplı endotel kabiliyeti mezenkimal stromal hücreler tarafından düzenlenir. Biz akışından nötrofil işe değerlendirmek ve mezenkimal stromal hücreler bu süreci düzenleyen oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir birincil insan hücreleri içeren iki in vitro model tarif.

Özet

Stromal hücreler, komşu endotel hücreleri ile çapraz konuşma ile inflamasyon sırasında, dolaşımdaki lökositlerin işe düzenler. Burada iltihaplı endotel hücreleri tarafından akışından nötrofillerin dolaşımdaki işe okuyan iki in vitro "vasküler" modelleri açıklar. Bu modellerin önemli bir avantajı, in vivo olarak meydana gelen gibi, sırayla lökosit yapışma kademeli olarak her adımda analiz yeteneğidir. Biz de hem modeller lökosit düzenleyen, bu durumda mezenkimal kök hücrelerin (MSC) stromal hücrelerin rolü, çalışma adapte edilebilir açıklanmıştır.

Primer endotelyal hücreleri, Ibidi lamlara veya 24 saat süre ile bir Transwell filtrenin ters tarafta doğrudan temas eden insan MSC ile tek başına veya birlikte kültürlenmiştir. Kültürler, 4 saat süre ile, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) ile uyarılır ve bir akım bazlı yapışma deneyinde dahil edilmiştir. Nötrofil bolus serpildi4 dakika için endotel üzerinde. nötrofil ve endotel ile etkileşimlerini akan yakalama faz-kontrast mikroskobu ile görüntülendi.

Her iki modelde de, sitokin uyarım, doza bağımlı bir şekilde akan nötrofil endotel işe artmıştır. Işe nötrofillerin davranış analizi haddeleme doza bağımlı azalma, endotelyum içinden geçişe doza bağımlı bir artış göstermiştir. Ko-kültür olarak, MSC TNFa-uyarılmış endotele nötrofil yapışma bastırdı.

Bizim akış tabanlı-yapışma modelleri dolaşımdan lökosit işe başlangıç ​​aşamalarını taklit. Lökosit ek olarak, bu tür terapötik olarak uygulandığı, MSC veya dolaşımdaki tümör hücreleri gibi diğer hücre türleri, işe incelemek için kullanılabilir. Çok katmanlı ko-kültür modelleri MSC pro-enflamatuar sitokinlerin tepkilerini değiştirmek için endotel ile iletişim göstermiştir, alterinötrofil işe ng. Bu tür modeller kullanılarak daha fazla araştırma tamamen farklı doku ve koşullar (inflamatuar bozukluklar veya kanser) için nasıl stromal hücreler anlamak enflamasyon sırasında lökositlerin etkilemek için gereklidir.

Giriş

Enflamasyon çözünürlüğü 1,2 izin vermek için, iltihaplı doku sıkı lökosit girişi düzenleme ve çıkış gerektiren mikrobik enfeksiyon veya doku yaralanmasına karşı koruyucu bir cevaptır. Endotel hücreleri (EC), bu hat, kan damarları, dolaşımdaki lökositlerin doku yerleşik stromal hücreler arasındaki çapraz konuşma Bu işlemi 3 koordine için gereklidir. Ancak, lökositlerin kontrolsüz alımı ve etkisiz boşluk kronik inflamatuar hastalıkların 4 gelişimini destekleyen. Sağlıkta ve hastalıkta lökosit işe Mevcut anlayış eksik ve daha sağlam modeller bu süreci analiz etmek gereklidir.

sonrası kılcal venüllerin vasküler EC kanın lökosit işe destek mekanizmaları iyi 1,2,5 tarif edilmiştir. Dolaşım halindeki lökositler, özel bir reseptör (örneğin, VCAM-1, E-selektin, P-selektin) tarafından çekildiğiiltihaplı endotel üzerinde yukarı-regüle edilir. Bu geçici etkileşimler lökosit yüzey bağlı kemokin ve lökositler 6- 11 tarafından ifade integrinler aktive lipit kaynaklı mediatörler (kökenli endotel veya stromal ya) ile etkileşim sağlar. Bu da endotel genelinde ve doku 12- 15 içine yapışma ve sürücüler göç dengeler. Doku içinde, lökositler kendi motilite, fonksiyon ve yaşam 16,17 etkileyen stroma türevli ajanlara maruz işe. Büyüyen kanıtlar güçlü sinyaller gelecek için işe alım süreci şartları lökositlerin her aşamasında alınan düşündürmektedir. Ancak, lökosit işe anlayışımız eksik kalır ve çok az doku içindeki bileşenler şekillendirme lökosit hareketi hakkında bilinmektedir.

Birmingham biz lökositlerin işe incelemek için in vitro "vasküler" modelleri birkaç geliştirdik9,18,19 akar. Biz şimdi lökosit işe vasküler AK hareket olarak acil regülatörleri kendi yerel mikroçevresinin değişikliklere yanıt anlıyoruz. Özellikle, doku yerleşik stromal hücreler aktif işe 3 rollerini etkilemek için komşu vasküler AT ile söyleşmek kısmen, inflamatuvar yanıtı düzenler. Daha önce çeşitli stromal hücreler, bir doku-spesifik bir şekilde yapışmasını ve lökositlerin geçişini desteklemek için AT yeteneğini modüle göstermiştir, ve bu etkiler, kronik hastalıkların 13,16,20,21 değişmiş da yol açabilir. Böylece, stromal hücreler her inflamatuar yanıt 22 bağlamı tanımlamanızı doku 'adres kodları' kurmak. Daha yakın bir zamanda, kemik iliği türevli MSC (BMMSC) potansiyel olarak her iki nötrofillerin alımına bir azalmaya yol açan, sitokinlere EC tepkisini aşağı regüle ve 23 lenfosit olduğunu göstermiştir.

mekanizmalar governing işe aydınlatmıştır in vitro ölçüde izole bir tek hücre tipi (örn, AK) veya protein içeren deneyleri kullandık. Ancak bu çalışmalar dikkate almayın lokal doku çevrenin etkileri (örneğin, stromal hücrelerin varlığı) lökositlerin ve doku içine onların sonraki göç. Burada, stromal hücreleri, spesifik olarak mezenkimal kök hücreler içinde iki akış tabanlı yöntemler (MSC) tarif EC 23 ile birlikte kültürlenmiştir. Bu modeller bize akışından lökosit işe desteklemek için özellikle kendi yeteneği endotel tepkiler üzerine stromal hücre etkisini incelemek için izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim İnsan endotel hücrelerinin ve Mezenkimal Kök Hücre

  1. İzolasyon ve Kültürü İnsan göbeğine yakın damar endotelial hücreleri (HUVEC):
    1. Kağıt havlu ile bir tepsi üzerinde göbek kordonunu koyun ve% 70 etanol ile sprey. Bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her iki ucunda ven ve cannulate belirleyin. Sabitlemek için kanüle sonuna etrafında bir kablo bağı yerleştirin.
    2. PBS bir şırınga kullanarak venöz kan yıkayın. Hava ile şırınga doldurun ve kaldırmak ve artık PBS atmak için ven geçer.
    3. Ve 10 mg / ml kollajenaz tip Ia çözülme 1 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar (bunlar kalsiyum ve magnezyum klorür) ile PBS içinde 1:10 seyreltin. Her iki kanüller dolana kadar damara kollajenaz çözümü geçirin. Her iki ucunda kanüller kelepçeler kapatın.
    4. Doku ile tepsiyi örtün ve% 70 etanol ile sprey. 37 ° C'de 20 dakika% 5 CO2 için bir kuluçka makinesi içine kablosu yerleştirin.
    5. Dışarı kablosunu çekinve inkübatör kablo bağları sıkın. 1 dakika boyunca hafifçe kablosunu masaj. 10 ml PBS ile bir hücre süspansiyonu yıkayın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde toplayın.
    6. Hava ile şırınga doldurun ve aşama 1.1.5 kullanılan bir 50 ml santrifüj tüpüne PBS toplama iki kez, herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için damar içinden geçmektedir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
    7. 1 ml tam AT orta aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet. EC ortam 35 ug / ml gentamisin sülfat, 10 ng / ml insan epidermal büyüme faktörü, 1 ug / ml hidrokortizon, 2.5 ug / ml amfoterisin B, ve% 20 cenin dana serumu ile takviye edilmiş M199 oluşur.
    8. 25 cm2 şişeye AT orta ve AT süspansiyonu 4 ml ilave edilir. Ertesi gün orta ve daha sonra her 2 günde değiştirin.
    9. AK Arnavut kaldırımı gibi morfoloji (Şekil 1Ai) sergiler. Yapışma deneyleri için, AK genelde% 100 izdiham ulaştığınızda (Bölüm 1.4 bakınız numaralı seribaşı ).
  2. İnsan kordon Wharton jöle mezenkimal kök hücrelerin (WJMSC) İzolasyonu:
    1. Taze kordon ya da zaten EC izole etmek için kullanılmıştır kablolarından Wharton jöle-türetilmiş MSC (WJMSC) ayırın. 5 cm uzunluğunda parçalar halinde göbek kordonu kesti. Kan damarlarını ortaya çıkarmak için uzunlamasına her parça kesin (2 arterleri [beyaz, sert] ve 1 ven [sarı, şişmiş]).
    2. Steril makas ve forseps kan damarlarını çıkarın ve atın kullanma. 3 mm 3 adet - 2 içine tüm doku kesin. 50 ml'lik santrifüj tüpüne 3 mm 3 adet - forseps yerde 2 Kullanma.
    3. 100 mg / ml stok kolajenaz tip II çözülme ve 1 seyreltin: 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar, 10 ml PBS içinde 100. 20,000 U / ml stok hiyaluronidaz çözülme ve 1 seyreltin: 400 kolajenaz çözeltisi içinde 50 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona seyreltildi.
    4. Doku parçaları içeren santrifüj tüpüne enzimatik kokteyl ekleyin. Doku fragmen inkübeYavaş bir döndürücü üzerinde, 37 ° C'de 5 saat için ts.
    5. Hücre süspansiyonu 1 seyreltin: 5 PBS. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne 100 um gözenek filtresi yerleştirin. 100 um gözenek filtresi üzerine hücre süspansiyonu dökün.
      NOT: doku parçaları Kalan filtre üzerinde muhafaza edilecektir ve hücreler 50ml santrifüj tüpüne tahsil edilecektir.
    6. Filtreyi atın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. 12 ml tam WJMSC kültür ortamı (DMEM, düşük glukoz,% 10 FCS ve 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml streptomisin karışımı) aspire süpernatan ve tekrar süspansiyon WJMSC pelet.
    7. 75 cm2'lik doku kültür şişesi tüm hücreleri Tohum. 12 mi tam WJMSC kültür ortamı ile, 24 saat sonra ortam değiştirin. 3 gün - her 2 orta değiştirin. 2 hafta içinde% 80 izdiham - Hücreler 70 ulaşmalıdır. Passage WJMSC 70 ulaştığınızda -% 80 izdiham (Bölüm 1.4 bakınız).
  3. Kemik iliğinden türetilen MSC (BMMSC) genişlemesi:
    1. Daha önce tarif edildiği gibi 24, insan kemik iliği kökenli MSC (BMMSC) izole edin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine 10 ml önceden ısıtılmış MSC büyüme ortamı (MSCGM) ekleyin.
    2. 2 dakika için 37 ° C su banyosu içine yerleştirmek suretiyle p2 BMMSC bir şişe çözülme. MSCGM ihtiva eden bir santrifüj tüpüne BMMSC süspansiyonu ekleyin. Pipetleme tarafından iyice karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Aspire tamamen süpernatanlarına.
    4. 1 ml MSCGM yeniden süspanse hücreleri ve böyle bir cellometer gibi bir hemositometre veya dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
    5. 12 mi MSCGM olarak cm2 başına 6000 hücrelerinin - 5.000 yoğunluğunda 75 cm2'lik kültür şişeleri içine tohum hücreleri. 12 ml MSCGM 24 saat sonra orta değiştirin. 12 mi MSCGM ile besleme hücreleri her 2-3 gün.
    6. Passage BMMSC 70 ulaştığınızda -% 80 izdiham (Bölüm 1.4 bakınız). Hücreler, bir fibroblastik morfolojisi (Şekil 1Aii) bulunmaktadır.
  4. EC ve MSC Dekolmanı:
    1. 25 cm 2 kültür şişelerinden orta aspire. Yaklaşık 2 dakika süre ile% 0.02 EDTA 2 ml ilave edilir. Aspire EDTA ve 2 ml tripsin ilave (2.5 mg / ml) eklenmiştir. Mikroskop altında Görünüm hücreleri yuvarlak hale gelene kadar.
    2. Hücreleri ayırmak için şişeyi dokunun. 8 ml kültür ortamı eklenerek tripsin inaktive, bir 15 ml santrifüj tüpüne kültür şişesine transfer süspansiyonuna (hücre tipine bağlı HUVEC, BMMSC için WJMSC ve MSCGM için DMEM LG EC ortamı).
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi aspire süpernatan ve topak, yeniden süspanse edin.
      1. MSC, 3 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon pellet geçirilmesi için. Üç ayrı 75 cm2'lik kültür şişeleri içine 11 ml kültür ortamı ekleyin. (: 3 bölünmüş 1), her bir kültür şişesine 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin. Geçiş WJMSC ve ko-kültürü deneylerinde kullanılmadan önce BMMSC 3 kez (p3).
      2. Yapışma tahlillerinde AK veya MSC tohumlama için - Bölüm 2 ve 3 bkz.
  5. Donma MSC:
    1. Geçidi 3 ayırmak MSC de Bölüm 1.4 de tarif edildiği gibi. 3 ml buz gibi soğuk CryoSFM aspire süpernatan ve süspansiyon haline getirin. 1.5 ml buz gibi soğuk cryovials hücre süspansiyonu pipetle 1 ml'lik eş payları. Bir donma kapta cryovials koyun.
    2. -80 ° CO / N de kabı saklayın. Sıvı azot transfer. MSC çözülme flakon (takip 1.3.1 adımları - 1.3.6). 5 ml kültür ortamı içinde yeniden süspanse MSC 25 cm2 şişe içine ve tohum (uygun WJMSC veya BMMSC ortamını seçin).

2. Ibidi lamlara üzerinde endotel-mezenkimal kök hücre Co-kültürler oluşturulması

  1. (; Bölüm 1.4 olarak ~ 1.5 x 10 6 hücre) EC bir birleşik 25 cm 2 şişesi Trypsinize. Süspanse EC 380 ul MSCGM içinde (1 x 25 cm 2 şişe yapışma deneyleri tüm cep ty için iki adet 6-kanallı Ibidi lamlara (~ 1.25 x 10 5 / kanal), tohum olacakPes) MSCGM kültürlenir. Her kanala AK süspansiyonu 30 ul ekleyin (bu kılcal eylem yoluyla büyüme alanı kapsayacak). 1 saat boyunca CO2 37 ° C'de Ibidi mikroslayd inkübe ve% 5.
  2. Her kanala 140 ul MSCGM ekleyin ve sonra aspire. 3 yıkamadan toplam iki kez tekrarlayın. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübatör içinde 140 ul MSCGM ve yer ekleyin ve% 5.
  3. Ko-kültürler için MSC (Bölüm 1.4) ayırın. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak bir hücre sayımı yapın. 1.5 x 10 5 hücre / ml olacak şekilde MSC konsantrasyonunu ayarlayın.
  4. (Orta kanalın sadece büyüme alanını terk) Ibidi kanallardan aspire aşırı ortam. Ibidi kanal MSC süspansiyon 30ul ekleyin. Kanalın büyüme alanı çıkartıldı, orta aspire ve MSC süspansiyon bir 30 ul ekle. Bir kez daha tekrar ve daha sonra 37 ° C ve% 5 CO2 Ibidi mikroslayd yer1 saat / sub>.
  5. Her kanala 140 ul MSCGM ekleyin ve sonra aspire. 3 yıkamadan toplam iki kez tekrarlayın. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübatör içinde her bir kanalın ve yerine 140 ul MSCGM bir son hacim ekleme ve% 5.
  6. 1 x 10, 5 U / ml stok TNFa çözülme ve 1 seyreltin: 100 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona (eşdeğer ± 10 ng / ml) MSCGM ise 1.000. 10 U / ml elde etmek üzere MSCGM olarak 1:10 ile 100 U / ml TNFa seyreltilmesi ile bir seri seyreltme yapın. 1 U / ml elde etmek üzere MSCGM olarak 1:10 ile 10 U / ml TNFa seyreltin.
  7. Tahlilden önce 4 saat boyunca 37 ° C'de, TNFa ile kanal tedavi edin. Sitokin tedavisi sırasında sıcaklık dalgalanmaları gözlenen nötrofil işe kalıplarını değiştirecektir. Muamele edilmemiş kanallara taze MSCGM ekleyin.

3. Endotel-Mezenkimal Filtreler hücre Co-kültürler Kök kurulması

  1. Bölüm 1.4 de tarif edildiği gibi WJ veya BMMSC çıkarın. Pelletini1 mi MSCGM de. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak bir hücre sayımı hücreleri gerçekleştirin.
  2. Son konsantrasyon MSCGM 500 ul 5 x 10 5 MSC şekilde ses seviyesini ayarlayın.
  3. Kullanımı steril forseps steril bir kutuda 6-kuyu, 0.4 mikron PET Transwell filtreleri ve yer ters.
  4. Filtrelerin dış yüzeyi üzerine Tohum, 5 x 10 5 MSC. 1 saat boyunca CO2, 37 ° C'de filtre inkübe ve% 5.
  5. Filtrenin dış yüzeyinden ortamı toplayın. Medyada yapışmaz MSC sayısını. 3 ml MSCGM içeren eşleşen 6 plaka steril forseps ve yer kullanarak yeniden invert filtreler.
  6. Filtre (Şekil 1B) iç yüzeyi üzerine MSCGM 2 ml ilave edilir. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin ve% 5. (; Bölüm 1.4 Şekil 1Ai) AT bir birleşik 25 cm 2 şişesi Trypsinize.
  7. 8 ml MSCGM içinde AK süspanse (1 x 25cm 2 şişe will tohumu dört 6-kuyu filtreleri; ~ 5 x 10 5 EC / filtre). Gözenekli filtrelerin üst ve alt orta aspire. (Filtre altında) alt odasına 3 ml taze MSCGM ekleyin. Her filtrenin iç yüzeyine 2 mi AT süspansiyonu ekleyin. 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
  8. Aspire orta yapışmayan EC yıkayın ve taze MSCGM ile değiştirmek için. İlk tohumlama MSC olmadan iç yüzeyinde hücreleri tohumlama yoluyla paralel AK mono-kültür filtreleri ayarlayın. 37 ° C'de O / N inkübe ve% 5 CO2.
  9. AK tek tabakalı birleşen ve hiçbir boşluk içerdiğini kontrol edin. Alt-konfluen mono tabakalar yapışma tahlilleri (Şekil 1B) için kullanılamaz.
  10. 1, 10 veya 100 U / ml TNFa filtrelerin üst ve alt bölmeleri tedavi (eşdeğer ± 10 ng / ml) ile 4 saat boyunca 37 ° C 'de (Bölüm 2'de anlatıldığı gibi) deneyin öncesine.

Lökositlerde 4. İzolasyonu

  1. Venöz alSağlıklı gönüllüler ve alikosunadn hemen EDTA tüpleri içine kan. Haricindekileri tüpleri hafifçe karıştırın.
  2. 10 ml 2.5 mi Histopaque 1119 üzerine 1077 Histopaque tabaka 2.5 ml'lik yuvarlak dipli tüp. Katman 5 ml Histopaque degrade üzerine tam kan. Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
  3. (Eritrosit katman üzerinde) Histopaque 1077 ve 1119 arayüzünde Hasat periferik polimorfonükleer nötrofil (PMN). Yuvarlak tüp dipli bir 10 ml yerleştirin ve albümin ile 10 ml makyaj. Yavaşça oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpü ve ters.
  4. (; PBSA ile yıkandı w / v)% 0.15 nihai konsantrasyona (kalsiyum ve magnezyum klorür) ile, 100 ml PBS içerisinde% 7.5 BSA çözeltisi 1:50 seyreltin. 10 ml albümin aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  5. 1 ml albümin süspanse. Hücre süspansiyonu 20 ul bir kısım almak ve 380 ul PBSA (1:20 seyreltme) ekleyin. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak hücreleri saymak. Gerekli conce seyreltinntration albümin (Transwell filtre ve Ibidi mikroslayd 1 x 10 6 / ml). Deneye kadar oda sıcaklığında nötrofil süspansiyon muhafaza edin.

5. Akış Sistemi Montaj

  1. Şekil 1C gösterildiği gibi akış sistemi kurun. Isıtıcı açın ve 37 ° C'ye ayarlanır. 3-yollu bir musluğa bir 20 ml şırınga (piston kaldırmak) ve 5 ml şırınga takın. Micropore bandı kullanarak Perspex odasına musluğu takın.
  2. Tedbir ve yaklaşık vana ve 3-yollu musluk arasındaki mesafedir silisyum 2/4 mm (kalın) boru uzun bir parça kesti. 03/01 mm (ince) boru, 10 mm uzunluğunda bir parça ve kalın hortumun bir ucuna yerleştirin - 8 kesin. 3-yollu musluğa üzerine kalın boru tarafı takın.
  3. Elektronik 3-yollu Mikrovalf bir liman üzerine ince boru ucunu. Bu "yıkama rezervuar" dir. Kalın ve ince boru 8 mm uzunluğunda bir parça - 6 kesti.
  4. Kalın hortumun bir ucunu ince boru yerleştirin. Avkalın boru 2 ml şırınga üzerine sona ach (pistonu çıkartın).
  5. "Örnek rezervuar" yapmak için elektronik Mikrovalf bir liman üzerine 2 ml şırınga ince boru ucunu. Ölçülmesi ve Mikrovalf ve mikroskop kademesinin merkezi arasındaki mesafedir ince borunun uzun bir parça kesilerek filtre akış odacığına valfi bağlayın.
  6. İnce boru ucuna kalın boru, 10 mm bir parçası - mikroslayd modelinde, 8 ekleyin. Kalın boru sonuna konektörü şeklinde bir L yerleştirin. Bu mikroslayd bağlanacaktır. İnce boru sonuna boru bağlantı Portex Blue Line Manometre 10 mm parça - filtre modeli için, bir 8 ekleyin.
  7. Mikrovalf üzerine ince boru ucunu yerleştirin. Bu yıkama ve örnek rezervuarlar için ortak çıkış. Albümin ile rezervuarları doldurun. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için onları aracılığıyla PBSA akan Başbakan boru.
  8. 29 mm'lik (50 ml) bir cam s manometre boru takınyringe. 10 ml albümin ile doldurarak Başbakan şırınga. Boru bağlı uç yukarı bakacak şekilde şırınga ters çevirin ve tüm hava kabarcıklarını dışarı itmek. 5 ml albümin ile doldurun.
  9. Cam şırınga giden Manometre hortumunun ucuna kalın boru 12 mm'lik bir parçası - sadece mikroslayd modelinde, 10 ekleyin. Kalın boru ucuna konnektör şeklinde bir L yerleştirin. Enfüzyon / geri çekilmesi için, bir şırınga pompası içine cam şırınga yerleştirin.
  10. 0.1 Pa (Transwell filtreler) ya da 0.05 Pa (Ibidi lamlara) aşağıdaki formüller kullanılarak istenen duvar kesme stresini üretmek için gerekli yeniden doldurma akış hızı (Q), (τ Pascal w, PA) hesaplayın:
    γ W = (6.Q) / (WH 2)
    τ = n.γ
    W = iç genişlik ve akış kanalı h = iç derinliğe sahiptir. n = akan çözelti viskozitesi; PBSA ile yıkandı, n = 0.7 mPa.s. Paralel plaka filtre akış bölmesi için, genişlik (w), 4 mm ve derinliği (h) 0.133 mm'dir. dOdanın epth nedeniyle kullanılan Parafilm conta kalınlığı farklılıklar biraz değişebilir. Ibidi mikroslayd için, genişlik 3.8 mm ve derinlik 0.4 mm 'dir.
    NOT: akış kanalı boyutları ve yakalama dinamikleri farklılıklar biz filtre modeli 6 kıyasla mikroslayd modeli için farklı kesme gerilmeleri kullanmak nedeniyle.

6. Filtreler birleştirilerek Paralel Plate Akış Odası Kurma

  1. Metal şablonu kullanarak Parafilm bir parça (cam lamel aynı boyut) kesin. Bir metal şablonu kullanarak (akış kanalı oluşturmak için) Parafilm bir 20 x 4 mm yuvası kesin. Cam lamel akış kanalı işaretlemek için conta kullanın.
  2. Cam lamel 6-kuyu filtre kenarlarını hizalayın. Filtre akış kanalı işaretler kapsar emin olun. Dikkatlice tipi 10A neşter kullanılarak filtre kesip.
  3. Dikkatle sağlanması, bir Parafilm conta ile filtre kapsayan akış kanalıyuva filtresi (Şekil 1D) ortasında. Temiz bir doku parçası kullanın ve herhangi bir kabarcıkları dışarı itmek.
  4. Perspex akış odasının alt plaka girinti içinde lamel yerleştirin. Conta üstünden üst Perspex plakasını yerleştirin ve birlikte plakaları (Şekil 1D) vida.
  5. Yıkama tamponu (PBSA) vana akmasına izin vermek için 3-yollu musluğu çevirin. Üst Persex plakanın giriş portuna Manometre boru bağlayın. Baloncuklarının geçmesine izin vermek için akış kanalı yoluyla, albümin çalıştırın.
  6. Perspex plaka çıkış portuna şırınga pompası Manometre hortumunu bağlayın. Dolum ve basın çalıştırmak için şırınga pompası ayarlayın. Odanın üst plaka üzerine damladı herhangi bir PBSA temizleyin.
  7. Bir ters faz-kontrast mikroskop sahnede odasına yerleştirin. Üstü filtreler AK (Şekil 1B) görselleştirmek için odağı ayarlayın.

7. Akış

  1. Bir ters faz kontrast mikroskop sahneye mikroslayd yerleştirin. Bir kanalın giriş portuna L şeklinde konnektörünü bağlayın. Akış kanalı ile, albümin çalıştırın.
  2. Kanalın çıkış portuna şırınga pompası konnektörü şeklinde L yerleştirin. Dolum ve basın çalıştırmak için şırınga pompası ayarlayın. Mikroslayd üzerine damladı herhangi bir PBSA temizleyin. AK tek tabaka görselleştirmek için odağı ayarlayın.

Lökositler üzerinde Endotel Hücreleri 8. Perfüzyon

  1. Örnek haznesine saflaştırılmış nötrofillerin 2 ml koyun ve 2 dakika boyunca ısınmaya bırakın. 2 dakika boyunca, albümin ile endotel yıkayın.
  2. Endotele üzerinde nötrofillerin serpmek için AÇIK vanayı çevirin. 4 dakika nötrofil bolus sunun. Valf kapatın ve deney kalanı için yıkama haznesindeki PBSA serpmek.
  3. Bu AK monolay bozacak gibi kabarcıklar tahlil sırasında herhangi bir noktada akış kanalından geçemiyor hava oluner ve yapışık nötrofil nedeni müfrezesi.

9. Kayıt Nötrofil Yakalama ve Davranış

  1. Kayıt nötrofil işe ya nötrofil akışı veya post-perfüzyon sırasında.
  2. Akış kanalının merkezinde 10 alanları - en az 5, tüm dijital kayıt edin. Giriş limanında kanalın kenarına hedefi hareketli ve limanın orta belirleyerek kanalın merkezini belirleyin.
    1. Nötrofil akışı sırasında kayıt için, 1 dakika boyunca tek bir alanda her 10 sn görüntüleri çekmek. Kanal boyunca hareket ettirin ve 1 dakika boyunca başka alan kaydedin. Bolus süresince tekrarlayın.
    2. (Nötrofil bolus bittikten sonra genellikle 2 dk) lökosit davranışını değerlendirmek için akış kanalının merkezinde aşağı 10 alanlar - post-perfüzyon kayıt için, 5 10 sn kayıt olun. Görüntüleri 10 sn aralığında her saniye sürer. Bu akışından yakalama ve yapışık Neutro davranışı için yeterli zaman tanırPhil'ler analiz edilmesi.
    3. Görüntüleri her 30 saniyede bir alan, 5 dakika boyunca en az 10 transmigrant nötrofilleri içeren tek bir alan kaydedin. Bu (yukarıdaki veya endotel altına ya da) geçirilmiş hücrelerin hızını hesaplamak için kullanılabilir.
    4. 10 sn alanları (genellikle 9 dakika sonrası perfüzyon) başka dizi kaydedin. Bu nötrofiller zaman endotel tek tabaka ile göç sağlar.
    5. Şırınga pompası durdurun ve tüp çıkarın. Akış odasına sökün ve örnek rezervuar ve tüp durulayın. Sonraki filtreler / mikroslayd kanallar için tekrarlayın.

Lökosit İşe Alım ve Davranış 10. Analizi

  1. 2 dakika zaman noktasında 10 saniye kayıtları sırasında her alanda nötrofil sayısını. Tüm hücreler sayılır için birinci, ikinci alanda mevcut olmalıdır. Görüş alanı 2 taraftan (örneğin, üst / sağ sınır) ile alanında kısmen hücreler dahildirsayımları, sürece tam 10 saniye sahada kalır gibi.
  2. Alan başına yapışık nötrofil ortalama sayısını hesaplayın. Kaydedilen alanın uzunluğunu ve genişliğini ölçün. Alan alanını hesaplayın. 1 mm 2 kaç alanlar var hesaplayın. 1 mm 2 alanların sayısına göre ortalama nötrofil sayımı çarpın.
  3. Perfüze nötrofil miktarı çarpılarak perfüze nötrofillerin toplam sayısını hesaplayın (örneğin, 2 x 10 6 / ml * Q [örneğin, paralel plaka akış odası için 0,0999 ml / dak]) bolus süresine göre (örneğin, 4 dakika ).
  4. Yapışmış hücrelerinin toplam sayısını (hem yapışık hücre / mm perfüze 10/02 6) belirlenmesi için perfüze nötrofillerin sayısı ile nötrofil sayısı / mm 2 bölün.
  5. Yapışık nötrofiller sıkıca yapışık veya (Ek Video 1 ve 2) transmigrant, haddeleme olup olmadığını değerlendirin.
    1. Birnötrofil haddeleme faz parlak ve yavaş yavaş endotel tek tabaka boyunca hareket edecek (1 - 10 mm / sn; Ek Video 1).
    2. Sıkıca yapışık hücreler ya (yani, kayıt sırasında hareket etmiyor) veya şekil değişikliği geçirmiş ve AK yüzeyi (Şekil 1Ei) üzerinden göç etmekte sabit kalan, AK yüzeye faz aydınlık ve bağlı bulunmaktadır.
    3. Bir transmigrant nötrofil karanlık ve AK tabakası (Şekil 1Eii) altında aşamasıdır.
  6. Sabit ve transmigrant, haddeleme yapışık hücre yüzdesini hesaplayın. Seçenek olarak ise, nötrofil davranışı (- 10.7 adımda 10.6 tarif edildiği gibi) toplam yapışma hesaplamak için kullanılan aynı formül uygulanarak, farklı davranışlar sergileyen toplam hücre sayısı olarak ifade edilebilir.
    1. Mark haddeleme nötrofil öncü. 10 sn dizisinin sonunda aynı hücrenin ön kenarını işaretleyin. Bir çizgi çizin bahis2 puan ween ve hücre seyahat etti mesafeyi ölçün.
    2. Hücre haddeleme olduğu kayıt (yani, 10 sn) süresine göre bu değeri bölün. Deneyin ve tüm 10 sn aralığı için alanında bulunmaktadır nötrofiller seçin.
  7. Yüzeyi (şekilli değiştirilen faz parlak) veya endotel (faz karanlıkta) altında üzerinde göç nötrofil hızını hesaplamak için (Ek video 2) kayıt 5 dk kullanın.
    1. Dizisinin başında göç hücrelerin bir taslağını çizin ve dizi boyunca hareketlerini izleyebilirsiniz. Her hücrenin her 1 dk aralığında sentroid X ve Y pozisyonları not edin. İkinci görüntüde değerlerden dizisinin ilk görüntüden X ve Y pozisyon değerlerini çıkarın. Bu Pisagor teoremi dayanmaktadır.
    2. Üçüncü görüntüde ikinci resimdeki değerleri çıkarın. Dizideki tüm görüntüler için bunu yapın. Kare tO X ve Y değerleri ve bunları birbirine ekleyin.
    3. Karekök elde edilen değer. Her dakika aralıklarla hesaplanan hızları ortalaması alınarak her bir hücre için hız hesaplayın. Parça 10 nötrofil göç ve ortalama hızı hesaplar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başlangıçta, biz Ibidi mikroslayd modeli (- 9 Bölüm 7) kullanılarak akışından nötrofillerin istihdamı TNFa ile AK uyarıcı etkisi analiz. TNFa, herhangi bir nötrofiller endotel tek tabaka yapıştırılır eğer biraz (Şekil 2A) yokluğunda. Bu 25,26 bağlayıcı desteklemek için gerekli yapışma molekülleri (selektinler) veya kemokinleri ifade etmeyen AK dinlenme / işlenmemiş olarak, bekleniyordu. Bunun aksine, sitokin uyarım önemli bir doza bağlı bir şekilde (Şekil 2A)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada iltihaplı endoteli tarafından nötrofillerin dolaşımdaki işe okuyan iki in vitro "vasküler" modelleri açıklar. Bu modellerin önemli bir avantajı, in vivo olarak meydana gelen gibi, sırayla lökosit yapışma kademeli olarak her adımda analiz yeteneğidir. Daha önce TNFa ile uyarılan EC 9,29 ile doza bağlı, nötrofil adhezyonunun artış ve transmigrasyonun gözlemledik. Biz de hem modeller lökosit işe üzerindeki stromal hücrelerin etkilerini incelemek için adapte edilebilir açıklanmı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Göbek kordonları, Birmingham Kadın Sağlığı Hizmetleri NHS Vakfı'nın yardımıyla toplandı. HMM, Artrit Araştırma İngiltere Kariyer Geliştirme Bursu (19899) ve Birmingham Üniversitesi Sağlık için Sistem Bilimi (5212) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajenaz Tip Ia SigmaC267410 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 10 ml PBS'de seyreltin. -20 ° C'de saklayın; 1 ml alikotlarda C.
Dulbecco'nun PBSSigmaD8662'sikalsiyum ve magnezyum klorür ile. Steril tutun ve RT'de saklayın.
1X Orta M199Gibco31150-02237 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.
Gentamisin sülfatSigmaG13974 ° C'de saklayın M199 500 ml şişeye ekleyin.
İnsan epidermal büyüme faktörüSigmaE9644-20 °C'de saklayın; 10'da C ve mikro; l aliquots.
Fetal buzağı serumu (FCS)SigmaF9665FCS, izole edilmiş EC'nin büyümesini ve canlılığını sağlamak için toplu olarak test edilmelidir. 56 ° C'de ısı inaktive edilir. -20 ° C'de 10 ml'lik alikotlarda saklayın.
Amfoterisin BGibco15290-026Güçlüdür ve bir hafta içinde toksik hale gelir, bu nedenle her hafta taze tam HUVEC besiyeri hazırlanmalıdır. -20 ° C'de saklayın; 1 ml alikotlarda C.
HidrokortizonSigmaH0135Stok etanol içindedir. -20 ° C'de saklayın; 10'da C ve mikro; l aliquots.
Kollajenaz Tip IISigmaC6885PBS'deki stoğu 100 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. -20 ° C'de saklayın; 100'de C ve mikro; l aliquots.
HyaluronidazSigmaH3631PBS'deki stoğu 20.000 U / ml'lik nihai konsantrasyona seyreltin. -20 ° C'de saklayın; 100'de C ve mikro; l aliquots.
100 ve mikro; 50 ml santrifüj tüp için m hücreli süzgeçBilimsel Laboratuvar Malzemeleri (SLS)352360Piyasada bulunan diğer hücre süzgeçleri de (örneğin Greiner bio-one) kullanılabilir.
DMEM düşük glikozBioseraLM-D1102 / 50037 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.
Penisilin / Streptomisin karışımıSigmaP4333-20 ° C'de saklayın; 1 ml alikotlarda C.
25 cc doku kültürü şişesiSLS353109
75 cc doku kültürü şişesiSLS353136
Kemik iliği mezenkimal kök hücre şişesiLonzaPT-2501Varışta sıvı nitrojen içinde saklayın. Hücreler varışta 2. geçittedir, ancak 0 numaralı geçit olarak belirlenmiştir. Geçiş 3'e çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojen içinde saklayın.
Mezenkimal kök hücre büyüme ortamı (MSCGM)LonzaPT-300137 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu. Cell Tracker Green boyama için FCS'siz ortam kullanın.
EDTA (%0,02) çözümüSigmaE80084 ° C'de saklayın. 37 ° C'de ısıtın; Kullanmadan önce C su banyosu.
Tripsin çözeltisiSigmaT4424-20 ° C'de saklayın; 2 ml alikotlarda C. RT'de çözün ve hemen kullanın.
CryovialsGreiner bio-one2019-02Hücre süspansiyonu eklemeden önce eklemeden önce buz üzerinde tutun.
Bay Frosty Dondurma KabıNalgene5100-0001RT'de Mağaza. Hücreli kriyoviyaller eklerken -80 ° C'de saklayın; Hücreleri sıvı nitrojene aktarmadan önce 24 saat C.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C ile işlenmiş, sterilIbidiIB-80606Alternatif modeller arasında cam kılcal damarlar, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plakaları (www.fluxionbio.com/bioflux/) ve GlycoTech paralel plaka akış odaları (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html) bulunur.
Hücre izleyici yeşil boyaYaşam teknolojileriC29255 & mikro'da mağaza; l alikotlar -20 ° C'de 5 ml önceden ısıtılmış olarak seyreltin (37 ° C'de; C) MSCGM.
Hücre sayma odalarıNexcelomSD-100Alternatif olarak, bir hemositometre kullanılabilir.
Cellometer otomatik T4 hücre sayacıNexcelomAuto T4-203-0238
Tümör nekroz faktörü ve alfa; (TNF&alfa;)Ar-Ge D Systems210-TA-100PBS'deki stoğu 100.000 U/ml'lik nihai konsantrasyona seyreltin. -80 °C'de saklayın; 10'da C ve mikro; l aliquots.
6 kuyulu, 0.4 ve mikro; m PET Transwell filtreleriSLS353090
K2-EDTA 10 ml'lik tüplerdeRT'de SarstedtMağazası.
Histopaque 1119Sigma111914 ° C'de saklayın Kullanmadan önce RT'ye ısıtın.
Histopaque 1077Sigma107714 ° C'de saklayın Kullanmadan önce RT'ye ısıtın.
10 ml yuvarlak tabanlı tüpAppleton WoodsSC211 142 AS
%7,5 BSA Fraksiyon V çözeltisiYaşam teknolojileri15260-0374 ° C'de saklayın.
20 ml Plastipak şırıngalarBD falcon300613
5 ml Plastipak şırıngalarBD falcon302187
2 ml Plastipak şırıngalarBD falcon300185
3M hipoalerjenik cerrahi bant 9 m x 2,5 cmMicropore1530-1Şırınga musluğunu perspeks odasının duvarına sabitlemek için kullanın.
Silikon kauçuk boru, iç çap/dış çap (ID/OD) 1/3 mm (ince boru)Fisher ScientificFB68854Silikon boruyu uygun boyutta kesin. Doğrudan elektronik mikrovalfe giden tüm borular ince olmalıdır.
2/4 mm silikon kauçuk boru ID / OD (kalın boru)Fisher ScientificFB68855
Portex Blue Line Manometre borusuSmiths200/495/200Şırınga pompasına giden boru.
3 muslukBOC Ohmeda AB
Cam 50 ml pompa için şırıngaPopper Micromate550962Kullanmadan önce hava kabarcıkları giderilerek astarlanmalıdır.
Cam lamelRaymond A Lamb26 x 76 mm lameller sipariş üzerine yapılır. Lot numarası 2440980.
Parafilm contasıAmerican National Can CompanyAlüminyum bir şablon kullanarak 26 x 76 mm'lik bir parafilm parçası kesin ve bir neşter 10a kullanarak içine 20 x 4 mm'lik bir yuva kesin. Conta kalınlığı yaklaşık 133 &mikro;m'dir.
İki perspeks paralel plakaWolfson Uygulamalı Teknoloji Laboratuvarı8 vida ile bir arada tutulan paralel plakalardan oluşan özel olarak tasarlanmış hazne. Alt plaka, ortada kesilmiş bir görüntüleme yuvasına ve lamel için yer açmak üzere frezelenmiş sığ bir girintiye sahiptir. Üst perspeks plakası, akış kanalı üzerine yerleştirilmiş bir giriş ve çıkış deliğine sahiptir.
Min. ölü alana sahip elektronik 3 mikro valfLee Products Ltd.LFYA1226032HElektronik olarak 12 volt DC güç kaynağına bağlanır.
İnfüzyon / çekme için şırınga pompası (PHD2000)Harvard Apparatus70-2001Çapı 29 mm'ye ve yeniden doldurma (akış) hızına ayarlayın.
L şeklindeki konektörLabhutLE876Ibidi microslide kanalına giriş ve çıkış portlarına takmak için.
Video kameraQimaging01-QIC-F-M-12-CDijital tüm videoların kaydedilmesini sağlayan bir bilgisayara bağlı.
Image-Pro Plus 7.0Medya Sibernetik41N70000-61592Veri analizi için. Farklı davranışları görüntüleyen hücreleri manuel olarak etiketleyin. Yuvarlanma ve göç hızlarının analizi için hücreleri izleyin.
Burada açıklanan reaktifleri kullanmanın tehlikeleri hakkında ayrıntılar için ürün veri sayfalarına bakın.

Kaynaklar

  1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
  4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
  5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
  6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
  7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
  8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
  9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
  10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
  11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
  12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
  13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
  14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).
  15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
  16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
  17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
  18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
  19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
  20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
  21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
  22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
  23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
  24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
  25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
  26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
  27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
  28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
  29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
  30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

L kosit nd klemesiMezenkimal K k H crelerEndotelyal H crelerAk Adhezyon AnaliziN trofil AdhezyonuTNF Alfa Stim lasyonuMikro Slayt ModeliFiltre ModeliFaz Kontrast Mikroskobisi

İlgili makaleler