Yöntem makalesi

Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

DOI:

10.3791/52495

⸱

21 Şubat 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, birçok nörolojik bozuklukta hastalık patogenezine katkıda bulunan gelişimsel yolları tanımlamak için kullanılabilecek sağlam ve replikatif bir nöral hücre popülasyonu elde etmek için nöral progenitör hücrelerin insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden nasıl ayırt edilebileceğini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörolojik hastalıkların ölüm sonrası çalışmaları, hastalığın başlamasının altında yatan nedenleri belirlemek için ideal değildir, çünkü birçok hastalık, semptomların başlamasından önce uzun bir hastalık ilerlemesi dönemini içerir. Hastalardan ve sağlıklı kontrollerden alınan fibroblastlar, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) verimli bir şekilde yeniden programlanabildiğinden ve daha sonra bu hastalıkların incelenmesi için nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) ve nöronlara farklılaştırılabildiğinden, hastalarda semptom başlangıcından önce meydana gelen gelişimsel olayları özetlemek artık mümkündür. hiPSC'leri NPC'lere verimli bir şekilde ayırt etmek için bir yöntem sunuyoruz, bu da fonksiyonel nöronlara daha fazla farklılaşabilmenin yanı sıra, aynı zamanda sağlam bir şekilde geçilebilir, dondurularak çözülebilir veya nörosferler olarak büyümek üzere geçiş yapılabilir, bu da replikasyon, göç, oksidatif stres ve / veya apoptoz dahil olmak üzere hücresel fenotipleri etkileyen moleküler faktörleri tanımlamak için hızlı genetik taramayı mümkün kılar. Hastadan türetilen hiPSC NPC'ler, gen ekspresyonunun manipüle edilmesinin hücresel veya moleküler sonuçlarının ampirik olarak test edilmesi için ideal olan benzersiz bir platformdur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim 1 insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) in vitro farklılaşmış nöronların ve diğerleri 2,3 Gen ifadesi çalışmaları hiPSC nöronlar fetal ziyade yetişkin beyin dokusu benzer olduğunu göstermektedir. Şu anda, hiPSC-tabanlı modeller yerine geç özellikleri, nörolojik hastalığı dışında, yatkınlık çalışmaları için daha uygun olabilir. Daha önce NPC şizofreni 1 katkıda moleküler yolları araştırılmasında faydalı bir hücre tipi olabileceğini göstermektedir, şizofreni hiPSC türetilen nöron gen imza önemli bir kısmının şizofreni hiPSC türetilmiş sinir progenitör hücrelerinin (NPC) muhafaza edilir bildirmişlerdir . Biz ve diğerleri anormal göç, artmış oksidatif stres ve reaktif oksijen türleri, alt eşik çevresel streslere ve şizofrenide bozulmuş mitokondriyal fonksiyonu hiPSC NPC 1,4-6 hassasiyeti yanı sıra azalmış nöronal c bildirmiştironnectivity ve şizofreni hiPSC nöronlar 5,7-10 sinaptik fonksiyon. Şizofreni hiPSC NPC anormal göç ve / veya oksidatif strese katkıda moleküler faktörler de şizofreni hiPSC kaynaklı nöronlar azalmış nöronal bağlantı temelini ise, NPC hastalıktan sorumlu mekanizmaları incelemek için sağlam ve yüksek replikatif nöral nüfus olabilir. Bir hızla hücrelerin çok sayıda oluşturabilir ve nöronal olgunlaşması için hafta veya ay beklemek gerekmez, çünkü Ayrıca, NPC-tabanlı deneyler daha büyük hasta gruplarını çalışma için uygundur ve yüksek verimli tarama daha yatkındır. Biz zaten şizofreni 1 ve Huntington hastalığı 11 gibi farklı hastalıkların ortaya konmuştur olarak hiPSC NPC, potansiyel hastalık patogenezinde katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet verebilir inanıyoruz.

HiPSCs, ilk nöral gelen NPC ayırt etmektim çift SMAD inhibisyon (0.1 mM LDN193189 ve 10 mM SB431542) 12 tarafından gerçekleştirilir. Bu küçük moleküller ile sinyalizasyon BMP ve TGF antagonize ederek, endoderm ve mezoderm özellikleri nöronal farklılaşma hızlandırılması ve kaplama bir hafta içinde görünür nöral rozet oluşumuna yol açan, bloke edilir. Sinir desenlendirme muhtemelen hemen sonra nöral rozet oluşumu ve döneminde, erken bu süreçte oluşur. Diğer ipuçları yokluğunda, bu ilkel nöral hücreler anterior ön beyin-benzeri kaderi 13 varsayıyorum. Hemen nöral rozet oluşumu takip ve NPC genişleme boyunca devam eden, ön beyin NPC FGF2'nin 8,14 ile kültür. Onlar çift soy potansiyeline sahip ve% 70-80 III-tubulin-pozitif nöronlar ve% 20-30 glial fibriler asidik protein (GFAP) pozitif astrositler (Şekil 1) nöral nüfusa ayırt edilebilir. ön-beyin hiPSC nöronlarının çoğunluğu VGLUT1-pozitifNöronların yaklaşık% 30 GAD67 pozitif (GABA) rağmen ve böylece, muhtemelen glutamaterjik 8.

NPC rutin tutarlı farklılaşma profilleri muhafaza ve karyotip anomalileri biriken olmadan iken, in vitro fazla on kez geçişli. Gruplar Pasajlanması NPC'lerin 15, ancak, biz on pasajlar ötesinde, NPC astrosit farklılaşma eğilimini göstermektedir artmış olduğunu bulmak 40'tan fazla kez bildirilmiştir. NPC birden donma-çözülür iyi tolere ve sadece yapışmayan plakalarda kültürleme yoluyla neurospheres olarak büyümeye geçiş yapılabilir. NPC etkili bir biyokimyasal çalışmalar için yeterli malzeme elde etmek için hızlı bir genetik müdahalelerin moleküler ve hücresel sonucu değerlendirmeyi ve kolayca genişletilebilir sağlayan, viral vektörler tarafından iletilir. Ayrıca, çünkü viral vektörler izin sağlam aşırı ekspresyonu kontrolü veya hasta türetilmiş neur birinde ve / veya hastalık-ilgili genlerin demonte,El hücreleri, kimse bu manipülasyonlar genetik kökenli etkisini test etmek için bu platformu kullanabilirsiniz. Sinaptik veya olgun nöronlar gerektiren faaliyet tabanlı deneyleri için uygun olmasa da, NPC hasta kaynaklı sinir hücrelerinin çoğu basit moleküler veya biyokimyasal analizler için pratik bir alternatif olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC Farklılaşma Sinir Progenitör Hücreler için

  1. Büyümek ve insan embriyonik kök hücre hiPSCs genişletin (HES) medya (Tablo 1) eş-kültüre bir fare embriyonik fibroblast (MEF), büyük (ama SUBCONFLUENT) koloniler bir embriyoid vücudun (EB) ara aracılığıyla nöral farklılaşma için hazır olana kadar besleyici tabaka üzerinde (Şekil 2). Rutin hiPSC kültür koşulları iyi yerde 16,17 tarif edilmiştir; 3 Her 7 gün: kısaca, birbirine karışana kadar bir MEF besleyici tabaka üzerinde HES medyada hiPSCs büyümek, daha sonra enzimatik kollajenaz (DMEM 1mg / ml) ile geçit ve yaklaşık 1 genişletin.
  2. Poli-L-Ornitin (cam yüzeyler için 50 ug / ml), plastik yüzeyler için steril su içinde ml / g, 10 ile Poli-L-Ornitin / laminin kaplanmış plakalar, kaplama plakaları hazırlamak ve 3-24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek. 3-24 saat boyunca oda sıcaklığında steril PBS içerisinde 5 g / mi Laminin steril su ve daha sonra kaplama ile en az bir kez yıkayın.
    NOT: plastik sarılı ise, plakalar olabiliraltı aya kadar -20 ° C 'de saklanır.
  3. 1. Günde enzimatik DMEM / F12 içinde 1 mg / ml kollajenaz IV kullanılarak plaka gibi büyük koloniler (örneğin, Matrigel TeSR 18 olarak tanımlanmış ortamlarda yetiştirilen, genellikle MEF'ler yetiştiler ya da ancak hiPSCs) kaynaşma hiPSCs kaldırın.
    NOT: 37 ºC inkübasyon 1-2 saat sonra koloniler çanak yüzen olacak.
  4. Yavaşça DMEM / F12, 2 ml / yuva N2 / B27 ortamı (Tablo 1) ve yapışkan olmayan 6 oyuklu tabaklara transfer tekrar süspansiyon ile 1-2X (değil santrifüj, çökeltilerek) hiPSC koloniler yıkama (1 içine 3-kuyu kombine eh) 19.
    NOT: Gecelik, koloniler yüzen küresel kümeler oluşturacak "embriyoid organları" (EBS) olarak adlandırılan. Önemli hücresel ölüm bekliyoruz.
  5. Ve Gün 2, eğim plakaları üzerinde EBS yerleşmek için izin verir. Dikkatle ortamı çıkarın ve enkaz kaldırmak için DMEM / F12 ile bir kez yıkayın. N2 ile besleyin / çift SMAD inhibitörleri (0.1M LDN193189 ve 10M SB431542) 12 ile desteklenmiş B27 medya sup.
  6. Gün 3-7, neuralization çift SMAD inhibe bağlamında oluşacak; EBS yuvarlak ama kistik olmadığını kontrol edin. EBS 0.1M LDN193189 ve 10M SB431542 ile desteklenmiş N2 / B27 medya ile her ikinci gün besleyin.
  7. Nöral rozet (apico-bazal kutupları nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakterize bir kaç gün içinde görünmeye başlar ki Günleri 7-14, kaplanmış plakalar Poli-L-Ornithine / Laminin için EBS kaplama izleyen, bir aydınlık mikroskop kullanılarak kontrol edin; Şekil 1). Yapışkan EBS 0.1 M LDN193189, 10M SB431542 ve 1 ug / ml, laminin ile takviye N2 / B27 ortamı ile her iki günde bir beslemeye devam edin.

Sinir rozet 2. Hasat

NOT: Biz nöral rozet enzimatik Sinir Rozet Seçim Reaktif 20 veya benzeri seçim reaktif kullanılarak hasat öneririz. Nöral rozet elle 6-kuyu Poli-L-Ornithine / laminin kaplı levha, thi içine alınabilir rağmenmetodolojisi ayrıca NPC zenginleştirmek ve nöral olmayan hücre tiplerini tüketmek için günde 20 toplama bir ikinci tur gerektirebilir, kullanıcı beceri bağımlı, usta kapsamlı eğitim alır, ve.

  1. 14. günde nöral rozet enzimatik seçimi için, uyulması EBS aspire maddeleri ve 6-delikli plaka için oyuk başına sinir rozet seçimi reaktif 1 ml. 1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. P1000 Pipetman ile, yavaşça her kuyudan enzimi çıkarın. Yıkamak için oyuk başına DMEM / F12 içinde 1 ml ilave edilir.
  3. Bir P1000 ile DMEM / F12 1 ml toplamak ve hızlı bir şekilde, böylece plaka rozet ayrılmakta, iyi geri DMEM / F12 sınırdışı. Bir şahin tüp içine rozetler toplayın.
  4. Pipet başka 1 DMEM / F12 ml ve hızlı kalan rozet ayırmak için aynı kuyunun içine sınırdışı. (Çiğnemek etmeyin. Rozet agrega kırmak için çalışın). Aynı şahin tüp içine sinir rozetler toplayın.
  5. Adımı tekrarlayın gerekli 2.4. Rozetler kolayca ayırmak istemiyorsanız, mo ekleyinenzimi yeniden ve işlemi tekrarlayın (2,1-2,4 adımları)
  6. 3 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Spin. Aspire yıkama ve NPC medya (Tablo 1) 2 ml rozet yeniden askıya. Aktarım hücreleri (1: 1) ile Poli-L-Ornitin / laminin içine 6 plaka kaplama.
  7. Gün 15-21 itibaren, nöral rozet genişletmek; yem rozet NPC medya ile her ikinci gün.
  8. Nöral rozet kalitesini değerlendirmek ve düz fibroblast benzeri hücreler kültür içinde genişleyen değil emin olun.
    NOT: sigara rozet devam ederse, NPC kültürü bazen Accutase içine aldı rozet sadece en iyi seçerek, manuel toplama ile kurtarılabilir. 37 ºC 15 dakika ayırmak. Pelet, yıkama ve NPC ortam levha 24 oyuklu poli-L-ornitin / laminin kaplanmış plaka üzerine.

Sinir Progenitör Hücreler 3. Genişleme

Not: hiPSC NPC Matrigel- veya Poli-L-Ornitin / laminin kaplanmış plakalar ya da üzerinde yetiştirilir. Biz genellikle Matrige kullanınl-plakalar daha çabuk hazırlanan ve düşük maliyetle edilebilir.

  1. Hızlı Matrigel kaplı plakalar hazırlamak çözülmesi ve 24 ml Matrigel, 1 mg donmuş bir kısım tekrar süspansiyon soğuk DMEM / F12 ve hemen iki altı oyuklu plakaların her bir oyuğuna 2 ml dağıtmak için. 37 ° C'de en az 1 saat süreyle inkübe edin.
    NOT: Matrigel sadece kullanımdan hemen önce, yıkanmış değil, aspire edilmesi gerekiyor.
  2. Ikinci günde NPC Yem ve çok yüksek yoğunlukta korumak veya kendiliğinden nöronlara ayırt edecektir.
    NOT: rağmen daha kurulmuş NPC genellikle 1 split: 2 seyrek olarak bir kez her iki haftada: Her hafta 4, çok düşük geçiş NPC 1 bölünebilir.
  3. , Bölme birinci aspirasyon ortam ve 6-çukurlu plaka içinde çukur başına 1 ml sıcak Accutase (1X) ekleyin. 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Yavaşça mümkün olduğu kadar az mekanik stres ile DMEM / F12 ihtiva eden bir 15 ml tüp içine müstakil hücreleri aktarın. Enzim ise hücreleri titre etmeyin. Spinni Pelet hücreleri5 dakika boyunca 1000 x g'de ng.
  5. Yıkama aspire ve özgün kuyu başına ~ 1 ml NPC medyada NPC yeniden askıya 6-iyi.
    NOT: 6-iyi bir çanak bir birleşik kuyu 5-10.000.000 hücreleri vardır ki bekleyin; Bu hematositometre önce yeniden kaplama kullanılarak bir hücre 10l kesir hesabıyla doğrulanabilir.
  6. NPC, nöronlar veya neurospheres olarak yeniden süspansiyon, yeniden plakalı NPC'ler ardından. 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu başına yaklaşık 1-2000000 hücreleri plaka, NPC korumak için. neurosphere oluşumu verimliliği deneyleri ve hücre hatları arasında değişir, ancak 200.000 ila 1.000.000 hücre yapışkan olmayan bir 6-yuvalı plaka içinde çukur başına tohumlanır halinde genellikle en iyi ortaya olabilir; neurospheres topaklanma meydana gelirse, tohumlanmış hücrelerinin sayısını azaltabilir. Nöron ortamı ile NPC ortamı yerine 6-çukurlu plaka içinde çukur başına nöronlara ayırt etmek için, plaka yaklaşık olarak 200,000 hücre.
  7. İmmünohistokimyasal her kurulan NPC hattını doğrulamak. Yeterli miktarda hücre malzemesi olmuştur expanNestin ve Sox2 antikorların Değerlendirme aracı, etiket NPC. Onaylı NPC hatları da 4-6 hafta boyunca nöronların içine farklılaştırılmış ve III-tübülinin ve MAP2AB için antikorlar ile etiketlenmiş olmalıdır.
    1. 10 dakika boyunca 4 ° C'de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde hücreleri saptamak. PBS içinde% 1.0 Triton, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında NPC geçirgenliği ve daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu içinde engeller.
    2. Gece boyunca 4 ° C'de,% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu, birincil antikor ile inkübe edin.
      Not: Aşağıdaki antikorlar tavsiye: keçi anti-Sox2, 1: 200; Fare anti-insan Nestin, 1: 200; tavşan anti-βIII-tübülin, 1: 500; fare anti-βIII-tübülin, 1: 500; fare anti-MAP2AB, 1: 200. (Şekil 2).
    3. Oda sıcaklığında 1-2 saat süre ile,% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu, 300: PBS ile yıkandıktan sonra, 1 ile keçi, fare ya da tavşan uygun konjuge sekonder antikor ile ikincil antikorlar hücreleri inkübe edin. 0.5 ug / ml DAPI (4 'ile çekirdek, leke hücreleri görselleştirmek için6-diamidino-2-fenilindol sonra) ve Vectashield ile monte edin.

4. NPC İletimi

  1. Transfekte edilmiş hücrelerin 21 yüzdesini arttırmak için (1 saat süre ile 1000 x g de virüsün mevcudiyetinde hücre kültür plakalarının santrifüj) spinfection kullanın. NPC medyada seyreltilmiş enfeksiyon istenen çokluğu (genellikle 1-10) (İB), titre aspire medya ve ilgili aşırı ifadesinin (veya kontrol) lentivirüsler (veya retrovirüsler) ile değiştirin. 1.5 mi, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına hacmi (ya da doku kültürü plakaları diğer türleri için, uygun bir şekilde ölçekli hacmi) kullanın. 1000 xg'de Spin ve bir plaka santrifüj içinde 1 saat süre ile 37 ° C.
    NOT: İdeal, bölme 1-2 gün içinde lentiviral veya retroviral vektörlerle NPC transduce. Ticari veya laboratuvar hazırlanan virüsleri kullanarak olsun, uygun seri seyreltme ile önceden virüsün toplu titre etmek yararlı olabilir. (Şekil 3).
  2. Cel azaltmak içinlular ölüm, spinfection 8 saat içinde ortam değiştirin.
    Not: Viral birleştirme ve transgen sentezleme raportör gen floresan ile 24 saat içerisinde tespit edilebilir. (Virüs bir floresan muhabiri eksiği varsa, bu değerlendirmek daha zordur; başarılı transfeksiyon iyi ekspresyonu ürünleri için immünoblot, immünohistokimyada veya qPCR tarafından onaylanmış olabilir.) Tam anlatım 3-7 gün sürebilir; Ek virüs tekrar spinfections transfekte hücrelerin yüzdesini arttırmak için gerekli olabilir. Tekrarlayan spinfections günlük oluşabilir ama çok sık olması gerekmez. İdeal olarak, bir flüoresan raportör kullanılıyorsa,> hücrelerin% 80 etiketlenmelidir.

5. Neurosphere değiştirme tahlili

Not: NPC enzimatik ayrışma ardından kendiliğinden Neurospheres bir şekilde, - hücre NPC ortam içinde süspansiyon halinde kültürlenen ise, (NPC genişleme 'de kullanılana benzer bir şekilde tarafından 3,3-3,6 adım).

  1. Kısaca, ayırmak büyümekneurospheres oluşturmak için yapışkan olmayan plakalar içinde 48 saat için NPC ortam d NPC. (Şekil 4).
  2. Neurosphere geçişi için, bir 96-yuvalı plaka içinde, oldukça DMEM daha çekme Neurosphere önce 1-2 saat soğuk NPC ortamı kullanılarak taze Matrigel plakaları hazırlamak. Kuyulardan Matrigel aspire etmeyin.
  3. Ilk olarak, embriyonik kök hücre-türevli neurospheres 22 için yayınlanan gibi, el, selüler artığın ayrılması için NPC medya içinde bir defa yıkandıktan sonra, mikroskop altında NPC türetilmiş neurospheres al. Bir Matrigel kaplı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, bir neurosphere aktarın.
  4. Her bir 96-çukurlu plaka içindeki neurospheres soğuk NPC bir ortamda seyreltilir, ek olarak 0.5 mg Matrigel ekleyin.
  5. Elle iyi bir pipet ucu kullanarak ortasında her neurosphere merkezi.
    NOT: Bu sonuçlar değişkenliği azaltmak amacıyla, benzer büyüklükte neurospheres almak önemlidir.
  6. Göç 48 saat için ortaya ve daha sonra w hücreleri düzeltmek için izinistenen immünohistokimyasal işaretleri ile i% 4 paraformaldehid ve leke.
  7. Radyal geçiş bunların tamamen 4x objektif mikroskop kullanarak, fotoğraf neurospheres tespit edilmesi gerekebilir. Kuyunun kenarına veya analiz ikinci bir neurosphere temas herhangi neurospheres hariç.
    NOT: göç daha uzun 48 saat oluşursa, ortaya çıkan radyal göç olasılıkla bir 4x objektif kullanarak görüntü çok büyük olacaktır.
  8. NIH ImageJ yazılımı (Şekil 5) kullanılarak her bir neurosphere ortalama geçiş ölçün. Bu aşağıda tarif edilen analiz yöntemleri kullanılarak yapılabilir:
    1. Radyal göç:
      1. El ile daha sonra oluşan şeklin alanını hesaplamak için ölçün (Ctrl + M) işlevini kullanabilirsiniz serbest seçim aracını kullanarak uzak göç hücrelerin kenarına iz. Ölçme önce alan Alanı Analiz sekmesi altında bulunan Set Ölçümleri penceresinde işaretli olduğundan emin olun. KullanAlan ölçümü ve bir çevreye (A = πr 2) alanı için denklem değeri çapındaki (dış) belirlemek gerekmektedir.
      2. Orijinal neurosphere kenarına Trace alanını ölçmek ve aynı şekilde yarıçapı (iç) hesaplayın. Dış ve iç yarıçapı arasındaki fark olarak toplam radyal göç hesaplayın.
    2. Büyük hücresel göç:
      1. Tedbir (Ctrl + M) işlevi, ardından düz çizgi seçim aracını kullanarak iç neurosphere kenarından beş uzak hücrelerinin hareket mesafeyi ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir rozet apico-bazal kutupları (Şekil 1) ile nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakteristik görünüşü, bir aydınlık mikroskop kullanarak, morfolojik tespit edilebilir. NPC çok yüksek hücre yoğunluğu tipik olarak kültürlenir rağmen, hemen gerçekleşen pasajlanmasını da sonra biraz piramit şeklinde soma ve bipolar nörit yapısı görülebilir (Şekil 1D) 'dir. III-tubulin boyama NPC bazı oranı sürekli kültür (Şekil 1F) içinde nöronal farklılaşma başlatan beli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, NPC içine hiPSCs, bir sinir hücre tipi olan hiPSC türetilmiş nöronların gen imzası önemli bir kısmı korunur ve bu potansiyel hastalık patogenezinde 8 katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet edebilir ayırt etmek ile yöntemler tarif etmişlerdir 11. Biz detaylı gibi Ayrıca, NPC biz hastalık yatkınlık moleküler ve biyokimyasal çalışmalar için uygun olabilir inanıyoruz sağlam Replikatif ve kolayca transdük nöral nüfus vardır.

Biz ayırt etmek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kristen Brennand, New York Kök Hücre Vakfı - Robertson Araştırmacısıdır. Brennand Laboratuvarı, Beyin ve Davranış Genç Araştırmacı Hibesi, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) hibesi R01 MH101454 ve New York Kök Hücre Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HES ortamı içinDMEM/F12Yaşam Teknolojileri#11330
DMEM/F12Yaşam Teknolojileri#10565nöral medya için
KO-Serum ReplasmanÖmrü Teknolojileri#10828Çok test edilmesi gerekiyor
GlutamaxYaşam Teknolojileri#35050
NEAAYaşam Teknolojileri #11140
N2Life Technologies #17502-048Lot testine tabi tutulması gerekiyor
B27-RALife Technologies #12587-010Lot testine tabi tutulması gerekiyor
FGF2Life Technologies#13256-029PBS'de Yeniden Askıya Alma + %1 BSA
LDN193189Stemgent#04-0074
SB431542Stemgent#04-0010
BDNFPeprotech# 450-02PBS'de Yeniden Askıya Alma +% 0.1 BSA
GDNF Peprotech #450-10PBS'de yeniden süspansiyon +% 0.1 BSA
Dibutiril döngüsel-AMPSigma #D0627PBS'de yeniden süspansiyon +% 0.1 BSA
L-askorbik asitSigma#A0278H2< / sub>0
STEMdiff Nöral Rozet Seçimi ReaktifiKök Hücre Teknolojileri #05832
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT-104
Kollajenaz IVYaşam Teknolojileri# 17104019
CF1 mEFsMillipore#PMEF-CF
Poli-L-OrnitinSigmaP3655
Laminin, Doğal Fare 1 mgYaşam Teknolojileri# 23017-015
BD MatrigelBD# 35423010 mg / ml'de soğuk DMEM'de buz üzerinde yeniden süspansiyon yapın, iki 6 oyuklu plaka eşdeğeri başına 1 mg kullanın
Doku kültürü ile tedavi edilmiş 6 oyuklu plakalarCorning3506
Ultra düşük ataşman 6 oyuklu plakalarCorning3471
keçi anti-Sox2 Santa Cruzsc­ 173201:200
fare anti-insan NestinMilliporeMAB53261:200 tavşan anti-&beta'da kullanın
; III-tubulinCovancePRB & utangaç; 1:500 fare anti-&beta'da 435P kullanımı
; III-tubulinCovanceMMS ve utangaç; 1:500'de
fare anti-MAP2ABSigmaM14061:200'de kullanım
, Plaka santrifüjü,Beckman Coulter, Beckman CoulterAllegra X-14 (SX4750 plaka taşıyıcı ile)
, 435P kullanımı, , , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630(2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

hiPSC Derived NPCsNeural Progenitor CellsDual SMAD InhibitionNeural RosettesLentiviral TransductionNeurosphere FormationCell Migration AssayOxidative Stress AnalysisApoptosis MeasurementNestin SOX2 Expression

İlgili makaleler