Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Özet

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Özet

Hedeflenen transgen ilavesi, viral vektör aracılı rastgele entegrasyonun neden olduğu gen susturma ve insersiyonel mutajenezi atlatırken kalıcı gen ekspresyonu sağlayabilir. Bu protokol, transgenleri güvenli bir liman lokusuna iletmek için doğrulanmış açık kaynaklı TALEN'lerin ve gen tuzağı benzeri bir donörün kullanımına dayalı olarak insan iPSC'lerinde evrensel ve verimli bir transgen hedefli ekleme platformunu tanımlar. Daha da önemlisi, etkili gen düzenleme, gen düzenleme vektörlerinin dağıtım verimliliği ile sınırlıdır. Bu nedenle, bu protokol ilk olarak yüksek nükleer dağıtım verimliliği elde etmek için transfeksiyon için iPSC'lerin hazırlanmasına odaklanmaktadır. iPSC'ler, yumuşak hücreli bir ayrışma reaktifi kullanılarak tek hücrelere ayrıştırıldığında ve optimize edilmiş bir program kullanılarak transfekte edildiğinde, büyük gen düzenleme vektörlerini almak için %>50 hücre indüklenebilir. AAVS1 lokusu aktif bir genin (PPP1R12C) intronunda yer aldığından, yalnızca rastgele entegrasyon ve transfekte edilmemiş hücreleri hariç tutarken hedeflenen iPSC'leri seçmek için bir splicing alıcı (SA) bağlantılı puromisin dirençli gen (PAC) kullanıldı. Bu strateji, hedeflenen klonları elde etme şansını büyük ölçüde artırır ve diğer aktif gen hedefleme deneylerinde de kullanılabilir. Spesifik iPSC hattı için ayarlanan dozda puromisin seçiminden iki hafta sonra, klonlar, daha fazla genişleme ve genetik ve fonksiyonel tarama için daha küçük bir kuyucukta taze ortama aktarılan büyük, izole kolonilerin daha küçük parçalara manuel diseksiyonu ile toplanmaya hazırdır. İn vivo ve in vitro görüntüleme ve hücre izolasyonu için yararlı olan çoklu GFP raportör iPSC hatlarını kolayca elde etmek için bu protokol takip edilebilir.

Giriş

embriyonik kök hücre benzeri uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine (iPSCs), insan somatik hücreleri yeniden programlamak için yeteneği ilk olarak Takahashi ve arkadaşları tarafından keşfedildi. 2007'de ^1. retrovirüsler dört transkripsiyon faktörlerini ifade ile transdük İnsan dermal fibroblastlar (so-dublaj Yamanaka Oct3 faktörleri / 4, Sox2, c-Myc ve Klf4) morfoloji, çoğalması, gen ekspresyonu ve epigenetik durumuna göre, insan embriyonik kök hücreler (HESC) büyük ölçüde benzer olduğu gösterilmiştir; önemlisi, iPSCs da, tüm üç germ ¹ hücrelerine ayrım yapabilmektedir. iPSCs çoğalma potansiyeli ve farklılaşma kapasitesi onlara çok cazip araçlar yapar; Belirli hastalıklara yakalanmış hastalardan alınan hücrelerin yeniden programlanması, iPSCs, in vitro bir hastalık modeli olarak ve potansiyel terapötik maddeler olarak hem de kullanılabilir.

İkinci amaçla, çeşitli konularda iPSCs tam potansiyeline önce ele alınmalıdırKlinik bir ortamda gerçekleştirilebilir; In vitro kültürlenmiş HESC ve iPSCs, yeniden programlama ve hücre bakım sırasında ksenojenik türevlerinin kullanımına tümörojenik potansiyeli ve in vivo olarak nakledilen hücrelerin izlemek için olan ihtiyaç en Hentze et tarafından yapılmıştır pluripotent kök hücrelerin klinik uygulama (tüm önemli engeller vardır. ^2). Farklılaşmış hücreler transplantasyon sonrası izleme ihtiyacı için ideal bir çözüm ne olursa olsun uygulama susturulması ve renklilik direnen bir görsel tespit işaretleyici içerecektir. Eksojen DNA güvenli liman loci içine sokulduğunda entegre transgenlerin sağlam ve kalıcı sentezleme en kolayca elde edilebilir; yani, bir entegre vektör yeterli transkripsiyonunu sağlayacak genomik siteleri komşu genlerin ³ ifade düzensizlikler hafifletici aynı zamanda da. Çok iyi keşfedildiğinden beri karakterize edilmiştir Böyle bir site adeno-ilişkili virüs, Integr olanprotein fosfataz 1 düzenleyici alt birimi 12C (PPP1R12C) geninin ilk intronu içinde tirme Alanı 1 (AAVS1). Bu odağı sürekli ve genişletilmiş zaman içinde entegre transgenlerin sağlam ifade kültürü ve in vitro farklılaşma ^3, aynı zamanda transkripsiyonel pertürbasyon ⁴ genlerin çevreleyen korumak için izin veren değil, sadece gösterilmiştir; Her iki özellik nedeniyle AAVS1 sitesini ⁵ yan endojen kromatin izolatör elemanlarının varlığı olduğu düşünülmektedir.

Sadece son on yılda genom mühendislik araçları gelişmeler büyük ölçüde herhangi bir hücre tipinde genetik manipülasyonlar elde edilebildiği kolaylığı ve verimliliği kolaylaştırmıştır. Erken başarılı deneyler EKH ^6,7 hedefleme geni elde etmek için bir tanıttı donörü ile endojen homolog rekombinasyon (HR) olarak son derece düşük seviyelerde dayanıyordu ederken, çinko parmak nükleazlardır (ZFNs), signi ki gibi site-spesifik nükleazlara, kullanımıficantly, bu gibi deneylerin ^8,9 verimliliğini arttırdı büyük bir çift-iplikçikli DNA kırılmasının nesil ile homolog rekombinasyonu teşvik eder. Her iki transkripsiyon aktivatörü gibi etkileyicilerin bitki patojeni xanthomanas cinslerin (Tales) ve prokaryotik kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) verimli site-spesifik tasarımcı nükleazlara içine / Cas9 sistemi yeniden amaç pluripotent kök hücreleri hedef geni yaptı erişilebilir ve Uygulanabilir metodoloji ^10-13.

Yeni bir kağıt TACE'nin nükleazlar (TALENS) ¹⁴ kullanılarak insan iPSCs olarak AAVS1 güvenli liman lokusuna yeşil flüoresan raportör kaseti kararlı entegrasyonu için etkili bir yöntem açıklamıştır. Bunlar hedeflenen iPSCs böyle bir programı için güçlü kanıtlar sunan, hatta miyokard infarktüsü (MI) bir fare modeli kardiyomiyositlerinin ve transplantasyon yönelik farklılaşma sonra floresan devamstabil floresan pluripotent kök hücreler ^14. Hedeflenen koloniler elde etmek için, bir gen trap yöntemi bir ekleme-alıcı (SA), 2A kendi kapanan peptid dizisi, endojen PPP1R12C promoterinin kontrolü altında puromisin, N-asetil-transferaz (PAC) geni yerleştirir, burada kullanıldı; Böylece, AAVS1 lokustaki DNA donör dahil yalnızca iPSCs puromycin direnci dayalı seçilebilir onları render, PAC ifade; (Şekil 1, ^15). Bu protokole göre iPSCs, AAVS1 GFP iPSCs TALENS ile iPSCs transfekte süreci ve AAVS1 güvenli liman lokusunun bir 4.2kb DNA fragmanı entegre etmek için bir 9.8 kb verici de dahil olmak üzere, son kağıt ¹⁴ bildirilmiştir üreten seçilmesi işlemlerini detayları puromisin-dirençli ve klonal genişleme için çekme kolonileri. Burada tarif edilen teknikler bir çok genom mühendisliği deneylere uygulanabilir.

Protokol

1. Bodrum Membran Matrix hazırlanması ve Plasticware Kaplama

1. Buz üzerine -20 ° dondurulmuş bazal membran matris stok yerleştirin ve 4 ° C'de bir gece eritin.
2. Çözündükten sonra, önceden soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine taban membran matrisi pipet 2 mg'lik parçalara. Gerekli olana kadar -20 ° C'de bu saklayın.
3. , Bazal membran matris kaplı plakaları hazırlamak Eppendorf tüp kaybolana buz son parçası (genellikle 2 ~ içinde saat) kadar buz üzerinde bir kısım Çözülme için.
4. Çözündükten sonra, bazal membran matris kaplama çözeltisi yapmak için soğuk (4 ° C), DMEM / F12 içinde 12 ml kadar bazal membran matrisi ekleyin.
5. Uygun bir kültür teknesine bazal membran matris solüsyonu ekleyin. 6-çukurlu plaka için, oyuk başına 1 ml akıtın. Bazal membran matris çözümü tamamen her iyi kapsar emin olmak için plakayı girdap.
6. Parafilm bazal membran matris kaplı plaka / çanak mühür ve roo inkübekullanımdan önce 1 saat m sıcaklığı. Seçenek olarak ise, mağaza bazal membran matris kaplı plakalar / 4 ° C'de yemekleri ve kaplamanın 2 hafta içinde kullanın.
   NOT: kurumasını önlemek için bazal membran matris kaplı plaka / çanak ekstra DMEM / F12 ekleyin. 4 ° C 'de depolanmıştır bazal membran matris kaplı plaka / çanak kullanmadan önce, bir biyolojik güvenlik kabini içine koyun ve en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin.
7. Tam ortam ve hücreler ilave edilmeden önce aspire taban membran matrisi.

E8 ortamının 2. Hazırlık

1. 4 ° C'de gece boyunca E8 takviyesi çözülme E8 kültür ortamı hazırlayın.
2. 500 ml stoktan E8 bazal ortam 10 ml çıkarın ve atın.
3. Doğrudan E8 bazal ortam 490 ml E8 takviyesi tüm 10 ml flakon Pipet. Tekrarlanan sıcaklık dalgalanmaları comple içinde bFGF düşürebilir gibi, bir 37 ° C su banyosunda değil sıcak komple E8 orta yapınte E8 ortamı.
4. Eki ek 2 hafta içinde tam E8 ortamı kullanın.

IPSCs 3. Çözülme

1. Kuru buz üzerinde, sıvı azotun ve yerden dondurulmuş iPSCs bir şişe çıkarın.
2. Hızla bir 37 ° C su banyosunda şişeyi çözülme; buz kalıntıları sadece küçük bir parçası kadar su banyosunda şişeyi girdap.
3. Biyolojik güvenlik kabini% 70 etanol ve transferi ile şişeyi püskürtün.
4. Doğrudan flakon oda sıcaklığı E8 orta damla damla 1 ml ekleyin.
5. 2 ml'lik bir pipet kullanılarak, 15 ml konik bir tüp içinde E8 ortamın 9 ml hücre süspansiyonu, damla damla aktarın. Hücreler ve orta hızlı iyice karıştırın sağlamak için sık sık tüp girdap.
6. 5 dakika süreyle 200 x g'de hücreleri santrifüjleyin.
7. Süpernatanı havalandırın, ve 10 uM Y-27632 ile takviye E8 uygun hacimde bir hücre pelletini.
8. Bodrum uygun sayıda hücrelerin ekleyin membrangecede 37 ° C,% 5 CO ₂ inkübatör e matris kaplı kuyuları ve yer. Bu çözmeden sonra hızlı bir iyileşme sağlamak için, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğu başına en azından 0.2 x 10 ⁶ IPSC plaka tavsiye edilir.

4. Bakım ve iPSCs rutin Pasajlanması

1. Günlük E8 orta yenileyin.
2. Bir inverted mikroskop ile morfolojisi ve hücre konfluent izleyin. yüksek kaliteli iPSCs farklı sınırları düz koloniler halinde büyür; Bireysel koloniler "Arnavut kaldırımı gibi" bir görünüm sahip.
3. Passage iPSCs hücreler ~ 70% confluency ulaştığınızda.
4. 0.9 g NaCI ve 500 ml DPBS 500 ul 0.5 M EDTA ilave ederek bir EDTA pasajı çözelti hazırlayın. Sterilize etmek NaCl ve vakum filtresi çözmek için iyice karıştırın. Pasajlayarak önce 37 ° C'lik bir su banyosu içerisinde pasajı çözeltisi bir kısım ısıtın.
5. Geçit için, aspirat kültür ortamı geçirdi ve sıcak pas eşit hacimde ile bir kez hücreleri yıkayınçözelti saging. Kaplamak için aspire ve pipet yeterli EDTA pasajı çözeltisi hücreleri (6-çukurlu plaka içinde çukur başına 1 mi).
6. Ters döndürülmüş bir mikroskop altında hücre yerleştirin ve iPSC kolonilerin. koloniler ve yükseltilmiş sınırları içinde delik görünümü 2 ila 5 dakika içinde belirgin hale gelmelidir.
7. Dikkatle EDTA Pasajlanması çözüm aspire.
8. Şirketinden de geçişli her içine yüksek basınç altında (6 çukurlu bir plaka kullanılarak varsa) 10 ml'lik bir pipet kullanılarak, E8 ortamının 4 ml dağıtmak.
9. IPSC kümeleri toplamak, ve 1 ila bölme oranına bağlı olarak, deliklerin bir uygun sayıda bölünmüş: 01:12 ila 8. Aşırı pipet, hücre kümeleri parçalanma zayıf canlılığı neden olur vermeyin.
10. Bir inkübatör plaka koyun, ve hücreleri dağıtmak için geri ve ileri-ve yan-yan birkaç kez plaka sallayın.

Tansfection için MEF'ler ve iPSCs 5. N-

1. Transfectio 48 saat önceN, geçit iPSCs ~ 1 için: bir bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plaka dört veya daha fazla kuyu içine 6 iki gün dolayısıyla% 70 konfluent olacak şekilde.
2. Bir sonraki gün,% 10 FBS ve 1 x MEM-NEAA ile takviye edilmiş DMEM (yüksek glukoz) 'den oluşan MEF ortam içine DR4 MEFS eritin.
3. • 2 x 10 ⁴ hücre / ^cm2 de iki adet 10 cm'lik kaplar içine levhalar DR4 MEFS ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir.
4. Transfeksiyondan bir gün, 30 dakika iPSCs üzerinde transfeksiyon gerçekleştirilmeden önce 10 uM Y-27632 ile takviye edilmiş E8 MEF aracını değiştirme.
5. İsteğe bağlı: iPSCs transfeksiyondan akış sitometrik analizi, arzu edildiği takdirde, oda sıcaklığında, bir bazal membran matris ile kaplanmış 4 ° C plaka ve yer çıkarın.
6. İsteğe bağlı 4 saat, transfeksiyondan önce, 10 uM nihai konsantrasyon-Y-27632 ile ön transfeksiyon iPSC kültür tamamlar.

6. Nazik-hücreli Ayrılma Reaktif Tedavind transfeksiyonu iPSCs bir Elektroporasyon Sistemi kullanılarak

1. 4 ° C ve P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonu çıkarın ve ~ boyunca oda sıcaklığına 30 dk gelmesini sağlar. Kullanımdan önce transfeksiyon çözeltisine, tüm 100 ul ek ekleyin.
2. 37 ° C'lik bir su banyosu içinde sıcak nazik-hücre ayrıştırma reaktifi.
3. AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 ve PZT-AAVS1-R1), -20 ° C ve AAVS1-CAG-EGFP donör elde edilir.
4. Inkübatörden iPSCs çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkanır.
5. Oyuk başına nazik-hücre ayrıştırma reaktifi 1 ml ilave edilir, ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe iPSCs veya hücrelerin% 50'den daha fazla kültür teknesine ayrışmış kadar.
6. Yukarı ve kültür kabından kalan hücreleri ayırmak için, ve iPSC öbekler kırmak için bir P1000 pipet kullanarak birkaç kez aşağı hücreleri pipetle.
7. Fürth için 10 ml'lik pipet kullanarak her bir kuyunun E8 orta 2 ml ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kezer tek hücre içine hücre kümeleri parçalara ayırma
   NOT: hücre kümeleri yeterince ayrıştırılmış değilse Transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde azalır.
8. 3 dakika boyunca 100 x g'de 15 ml konik bir tüp içinde iPSCs ve santrifüj toplayın.
9. E8 ortamının en az bir miktarda aspire yüzer madde ve tekrar süspansiyon hücreleri.
10. Bir canlı bir boya gibi% 0.4 tripan mavisi uygulanmasından sonra bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. ("Küme" başına 1-3 hücre) sayım sırasında hücreler yeterince ayrışmış emin olun.
11. İki 15 ml konik tüplerin her birine 3 x 10 ⁶ hücre koyun ve 3 dakika boyunca 100 xg'de tekrar aşağı doğru döndürün.
    NOT: Düşük hız santrifüj hücre stresi azaltır ve elektroporasyon önce iPSCs kolay yeniden asılmasını sağlıyor.
12. İnsan embriyonik kök hücre hattı H9 (Program CB-150) hücre tipi özel program elektroporasyon sistemi ayarlayın.
13. Santrifüj işleminden sonra, cel süpernatant aspirel peletler. Bir pelet için, kontrol örneği olarak, sıcak verici 10 ug ekleyin. Diğer pelet 5 mikrogram ile birlikte İK donörün 10 ug, eklediğiniz her deney numune olarak TALEN (PZT-AAVS1-L1 ve PZT-AAVS1-R1).
14. P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonundan 100 ul her bir hücre pelletini, bir küvete aktarılır.
15. Transfeksiyon gerçekleştirin ve hemen her küvete oda sıcaklığı E8 orta 500 ul ekleyin.
16. Adım 5.4 hazırlanan DR4 MEFS içeren bir 10 cm'lik çanak transfekte iPSCs damla damla aktarın.
17. İsteğe bağlı: Transfeksiyon verimi analizlerinin nasıl sitometri akışı istendiği takdirde, bir bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plaka içinde bir kuyuya her bir deney birkaç damla ekleyin.
18. Tekrar her iki örnekleri bitirmek için 6,15-6,17 adımları. Ertesi gün, DPBS hücreleri iki kez yıkayın ve E8 daha besleyici daha iyi iPSC kültürünü desteklemek için görünür NutriStem, kültür ortamı geçmek.
19. Tr48 saat sonrası transfeksiyon 72 en ansient EGFP ifade zirveleri; arzu edilen transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek.

Hedefli iPSCs 7. puromisin seçimine

1. IPSCs% 70 confluency ulaştığında puromisin Seçimi transfeksiyondan sonra 72 saat başlayın.
2. NCRM5 iPSCs için NutriStem kültür ortamında seyreltilmiş 0.5 ug / ml puromisin (1/2 tam doz) ile puromisin seçimi başlar. Optimal puromisin konsantrasyonu 0.25 bazı iPSC hatları için 1 ug / MLL bağlı olarak değişebilir.
3. Günlük olarak orta ferahlatıcı 3 gün NutriStem ± 0.5 ug / ml puromisin Kültür iPSCs.
4. 3 gün sonra, 1 ug / ml puromisin konsantrasyonunun arttırılması için.
5. / Ml puromısin seçimi 1 ug altında Kültür iPSCs başka bir 7 ila 8 gün için, ya kadar farklı koloniler koloni toplama için yeterince büyük görünür.

8. Koloni Toplama ve Hedeflenen iPSCs Yaygınlaştırılması

1. Kullanım bazal membrankaplamak için matris, her oyuğa (12 mi DMEM / F12 içinde seyreltilmiş, 2 mg bazal membran matris) bazal membran matris kaplama solüsyonu 50 ul dağıtma ile 96 oyuklu plaka. 4 ° C'de bir gece boyunca, kullanımdan önce plaka saklayın.
2. Bazal membran matris kaplı plaka, oda sıcaklığına gelmeye bırakıldıktan sonra, bazal membran matrisi aspire ve 10 uM Y-27632, her bir oyuğa ile takviye edilmiş 100 ul E8 dağıtın.
3. Bir biyolojik güvenlik kabini içine ters bir mikroskop yerleştirin ve sterilize etmek için% 70 EtOH ile hafifçe sprey.
4. Ucunda küçük bir "kanca" olan ideal bir koloni toplama aracı edinmek için Bunsen beki üzerinde cam Pasteur pipet çekin. % 70 EtOH ile sterilize ve kurumaya kaputun yerleştirmek.
5. Inkübatör hedeflenen iPSC kolonileri içeren çanak çıkarın ve mikroskop altında kaputun içine yerleştirin.
6. Koloni toplama aracı ile koloni sınır etrafında bir daire izleme tarafından iPSCs seçin.
7. Hafifçe kazıyın ve plaka yüzeyinden iPSC kolonisi kaldırmak için koloni-toplama aracı "kanca" kullanın. Daha büyük koloniler için, koloni tekrar kaplamadan sonra hücre büyümesini kolaylaştıracak çeyrek koloni toplama aracı ile bir X çizim.
8. Hücre kümeleri müstakil ve serbestçe yüzen sonra, iPSCs toplamak için ~ 30 ul set P200 pipet kullanın. Doğrudan 96 oyuklu bir plakaya Levha hücreleri.
9. İsteğe bağlı: daha sonra 37 ° C'de 5 dakika boyunca sindirimi 50 ul nazik-hücre ayrışma reaktifmi, bir Eppendorf tüpüne iPSCs toplamak için ~ 5 ul ayarlanmış bir p20 pipet kullanın. Sindirimden sonra, yumuşak-hücre ayrıştırma reaktifi seyreltilmesi ve 5 dakika için standart bir masa üstü mikrosantrifüj 200 xg'de hücreleri yavaşlamalarını Eppendorf tüpüne, 500 ul E8 orta ekleyin. Daha sonra sıvı ortamı en iyi aspire ve • tekrar süspansiyon ve 96 oyuklu bir plakaya hücreleri aktarmak için 30 ul bırakın.
   NOT: Buyaklaşım hücre küme ve aldı koloninin hızlı genişleme ayrışma kolaylaştıracaktır.
10. IPSC koloniler yeterli sayıda toplanmıştır kadar koloni toplama devam (kabaca deney başına 20-30 kolonileri tavsiye edilir).
11. Koloni toplama sonra, gece boyunca bir kuluçka makinesi içinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir. Tam E8 orta Ertesi gün, ve kültür 70 ~ kadar% konfluent ile yenileyin.
12. Içine 96 oyuklu geçişin hücreleri, 24-çukurlu, daha sonra bir 6-çukurlu, adım 4,5-4,10 hazırlanır.
    NOT: 6-çukurlu plaka daha küçük kuyu kullanıldığında EDTA çözeltisi ve E8 ortamının hacmi orantısal olarak azaltılmalıdır.
13. Rastgele eklenen vektörlerin ¹⁶ hedeflenmiş kaset entegrasyonu ve yokluğunu onaylamak için kavşak PCR ve Southern blot analizi ile hedefleme başarısını değerlendirmek.

Sonuçlar

Protokolün bir görselleştirme iPSCs NutriStem için ya E8, yeşil veya mavi tarafından vurgulanan farklı bir ortam içinde kültürlenir dönemlerin, Şekil 2'de verilmiştir. Sadece yüksek kaliteli iPSCs transfekte etmek önemlidir; Rutin bakım boyunca kültür yemekleri incelemek ve iPSC kültürleri bir Arnavut kaldırımı gibi morfoloji taşıyan başta farklı koloniler (Şekil 3A) içerdiğini doğrulayın; farklılaşmış hücre kültürünün% 10'dan fazla işgal edilmelidir. IPSCs bölgesinin Transfecta...

Tartışma

(1) verimli transfeksiyonla iPSCs içine TALEN ve donör plazmitlerini teslim;: AAVS1 güvenli liman başarılı nesil için en kritik adımlar insan iPSCs vardır hedefli (2) transfeksiyondan sonra transfeksiyon ve kaplama yoğunluğu önce tek hücre içine iPSCs ayrılmasını optimize; (3) doz ve iPSC hattının büyüme dayalı ilaç seçimi süresi optimize; (4) dikkatli diseksiyon ve hedeflenen koloniler toplama ve / kuyu yeni plaka transfer. Hockemeyer en kağıt ¹⁰ kullanılan benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protoko...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, *LDEV İçermeyen, 10 ml	Corning	354230	-20 ° C'de saklayın.
DMEM / F-12	Yaşam Teknolojileri	11320-033	4 ° C'de saklayın.
Costar 6 Kuyu Temizle TC ile İşlem Görmüş Çoklu Kuyu Plakaları	Corning	3506
Temel 8 Orta Ömür	Teknolojileri	A1517001	Bazal ortamı 4 ° C'de saklayın Takviyeyi -20 ° C'de saklayın.
Y-27632 dihidroklorür	Tocris	1254	Oda sıcaklığında saklayın. H2O'da çözündükten sonra -20 ° C'de saklayın.
Sodyum Klorür	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Yaşam Teknolojileri	15575-020
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Yaşam Teknolojileri	14190-250
100 mm TC ile İşlem Görmüş Kültür Kabı	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Akademik	GlobalStem	GSC-6204G	Sıvı Azot içinde saklayın.
DMEM, yüksek glikoz, piruvat	Yaşam Teknolojileri	11995-040	4 ° C'de saklayın.
Tanımlanmış Fetal Sığır Serumu, ABD Menşeli	HyClone	SH30070.03	-20 ° C'de saklayın & 4 ° C'de çözün; C gece ve aliquot. Alikotları -20 ° C'de saklayın; İhtiyaç duyulana kadar C.
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)	Life Technologies	11140-050	4 ° C'de saklayın.
4D-Nükleofektör Çekirdek ünitesi	Lonza	AAF-1001B	elektroporasyon sisteminin bir parçası
4D-Nükleofektör X ünitesi	Lonza	AAF-1001X	elektroporasyon sisteminin bir parçası
P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Varışta, Birincil Hücre Çözeltisini çıkarın ve 4 ° C'de tamamlayın ve saklayın.
StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi	Yaşam Teknolojileri	A1110501	-20 ° C'de saklayın Gece boyunca 4 ° C'de çözün; C ve 37 °C'de bir alikotu ısıtın; Kullanmadan önce C su banyosu.
NutriStem XF/FF Kültür Ortamı	Stemgent	01-0005	-20 ° C'de saklayın. Gece boyunca 4 ° C'de çözdürün; C
AAVS1 TALEN'ler (pZT-AAVS1-L1 ve pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 ve 52638
[başlık]
AAVS1-CAG-EGFP Homolog Rekombinasyon donörü	Addgene	22212
Puromisin Dihidroklorür	Yaşam Teknolojileri	A11138-03	-20 ° C'de saklayın. ddH2O'da 1 mg / ml'lik çalışma alikotları hazırlayın.
Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör Pipetleri	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Soğutmalı), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 & kez; 750 ml Sallanan Kova Rotoru	Thermo Scientific	75003607
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4Yaşam Teknolojileri		15250-061