Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli
Bu makalede
Özet
Özet
Hedeflenen transgen ilavesi, viral vektör aracılı rastgele entegrasyonun neden olduğu gen susturma ve insersiyonel mutajenezi atlatırken kalıcı gen ekspresyonu sağlayabilir. Bu protokol, transgenleri güvenli bir liman lokusuna iletmek için doğrulanmış açık kaynaklı TALEN'lerin ve gen tuzağı benzeri bir donörün kullanımına dayalı olarak insan iPSC'lerinde evrensel ve verimli bir transgen hedefli ekleme platformunu tanımlar. Daha da önemlisi, etkili gen düzenleme, gen düzenleme vektörlerinin dağıtım verimliliği ile sınırlıdır. Bu nedenle, bu protokol ilk olarak yüksek nükleer dağıtım verimliliği elde etmek için transfeksiyon için iPSC'lerin hazırlanmasına odaklanmaktadır. iPSC'ler, yumuşak hücreli bir ayrışma reaktifi kullanılarak tek hücrelere ayrıştırıldığında ve optimize edilmiş bir program kullanılarak transfekte edildiğinde, büyük gen düzenleme vektörlerini almak için %>50 hücre indüklenebilir. AAVS1 lokusu aktif bir genin (PPP1R12C) intronunda yer aldığından, yalnızca rastgele entegrasyon ve transfekte edilmemiş hücreleri hariç tutarken hedeflenen iPSC'leri seçmek için bir splicing alıcı (SA) bağlantılı puromisin dirençli gen (PAC) kullanıldı. Bu strateji, hedeflenen klonları elde etme şansını büyük ölçüde artırır ve diğer aktif gen hedefleme deneylerinde de kullanılabilir. Spesifik iPSC hattı için ayarlanan dozda puromisin seçiminden iki hafta sonra, klonlar, daha fazla genişleme ve genetik ve fonksiyonel tarama için daha küçük bir kuyucukta taze ortama aktarılan büyük, izole kolonilerin daha küçük parçalara manuel diseksiyonu ile toplanmaya hazırdır. İn vivo ve in vitro görüntüleme ve hücre izolasyonu için yararlı olan çoklu GFP raportör iPSC hatlarını kolayca elde etmek için bu protokol takip edilebilir.
Giriş
embriyonik kök hücre benzeri uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine (iPSCs), insan somatik hücreleri yeniden programlamak için yeteneği ilk olarak Takahashi ve arkadaşları tarafından keşfedildi. 2007'de 1. retrovirüsler dört transkripsiyon faktörlerini ifade ile transdük İnsan dermal fibroblastlar (so-dublaj Yamanaka Oct3 faktörleri / 4, Sox2, c-Myc ve Klf4) morfoloji, çoğalması, gen ekspresyonu ve epigenetik durumuna göre, insan embriyonik kök hücreler (HESC) büyük ölçüde benzer olduğu gösterilmiştir; önemlisi, iPSCs da, tüm üç germ 1 hücrelerine ayrım yapabilmektedir. iPSCs çoğalma potansiyeli ve farklılaşma kapasites....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bodrum Membran Matrix hazırlanması ve Plasticware Kaplama
- Buz üzerine -20 ° dondurulmuş bazal membran matris stok yerleştirin ve 4 ° C'de bir gece eritin.
- Çözündükten sonra, önceden soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine taban membran matrisi pipet 2 mg'lik parçalara. Gerekli olana kadar -20 ° C'de bu saklayın.
- , Bazal membran matris kaplı plakaları hazırlamak Eppendorf tüp kaybolana buz son parçası (genellikle 2 ~ içinde saat) kadar buz üzerinde bir kısım Çözülme için.
- Çözündükten sonra, bazal membran matris kaplama çözeltisi yapmak için soğuk (4 ° C), DMEM / F12 içinde 12 ml kadar bazal membran matrisi ekleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokolün bir görselleştirme iPSCs NutriStem için ya E8, yeşil veya mavi tarafından vurgulanan farklı bir ortam içinde kültürlenir dönemlerin, Şekil 2'de verilmiştir. Sadece yüksek kaliteli iPSCs transfekte etmek önemlidir; Rutin bakım boyunca kültür yemekleri incelemek ve iPSC kültürleri bir Arnavut kaldırımı gibi morfoloji taşıyan başta farklı koloniler (Şekil 3A) içerdiğini doğrulayın; farklılaşmış hücre kültürünün% 10'dan fazla işgal edilmelidir. IPSCs bölgesinin Transfecta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
(1) verimli transfeksiyonla iPSCs içine TALEN ve donör plazmitlerini teslim;: AAVS1 güvenli liman başarılı nesil için en kritik adımlar insan iPSCs vardır hedefli (2) transfeksiyondan sonra transfeksiyon ve kaplama yoğunluğu önce tek hücre içine iPSCs ayrılmasını optimize; (3) doz ve iPSC hattının büyüme dayalı ilaç seçimi süresi optimize; (4) dikkatli diseksiyon ve hedeflenen koloniler toplama ve / kuyu yeni plaka transfer. Hockemeyer en kağıt 10 kullanılan benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protoko.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Bu araştırma, Ulusal Artrit, Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü NIH Ortak Fonu ve Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, *LDEV İçermeyen, 10 ml | Corning | 354230 | -20 ° C'de saklayın. |
| DMEM / F-12 | Yaşam Teknolojileri | 11320-033 | 4 ° C'de saklayın. |
| Costar 6 Kuyu Temizle TC ile İşlem Görmüş Çoklu Kuyu Plakaları | Corning | 3506 | |
| Temel 8 Orta Ömür | Teknolojileri | A1517001 | Bazal ortamı 4 ° C'de saklayın Takviyeyi -20 ° C'de saklayın. |
| Y-27632 dihidroklorür | Tocris | 1254 | Oda sıcaklığında saklayın. H2O'da çözündükten sonra -20 ° C'de saklayın. |
| Sodyum Klorür | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Yaşam Teknolojileri | 15575-020 | |
| DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok | Yaşam Teknolojileri | 14190-250 | |
| 100 mm TC ile İşlem Görmüş Kültür Kabı | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR - Akademik | GlobalStem | GSC-6204G | Sıvı Azot içinde saklayın. |
| DMEM, yüksek glikoz, piruvat | Yaşam Teknolojileri | 11995-040 | 4 ° C'de saklayın. |
| Tanımlanmış Fetal Sığır Serumu, ABD Menşeli | HyClone | SH30070.03 | -20 ° C'de saklayın & 4 ° C'de çözün; C gece ve aliquot. Alikotları -20 ° C'de saklayın; İhtiyaç duyulana kadar C. |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X) | Life Technologies | 11140-050 | 4 ° C'de saklayın. |
| 4D-Nükleofektör Çekirdek ünitesi | Lonza | AAF-1001B | elektroporasyon sisteminin bir parçası |
| 4D-Nükleofektör X ünitesi | Lonza | AAF-1001X | elektroporasyon sisteminin bir parçası |
| P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Varışta, Birincil Hücre Çözeltisini çıkarın ve 4 ° C'de tamamlayın ve saklayın. |
| StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi | Yaşam Teknolojileri | A1110501 | -20 ° C'de saklayın Gece boyunca 4 ° C'de çözün; C ve 37 °C'de bir alikotu ısıtın; Kullanmadan önce C su banyosu. |
| NutriStem XF/FF Kültür Ortamı | Stemgent | 01-0005 | -20 ° C'de saklayın. Gece boyunca 4 ° C'de çözdürün; C |
| AAVS1 TALEN'ler (pZT-AAVS1-L1 ve pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 ve 52638 | |
| [başlık] | |||
| AAVS1-CAG-EGFP Homolog Rekombinasyon donörü | Addgene | 22212 | |
| Puromisin Dihidroklorür | Yaşam Teknolojileri | A11138-03 | -20 ° C'de saklayın. ddH2O'da 1 mg / ml'lik çalışma alikotları hazırlayın. |
| Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör Pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Soğutmalı), 120 V 60 Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 & kez; 750 ml Sallanan Kova Rotoru | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4Yaşam Teknolojileri | 15250-061 |
Kaynaklar
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotec....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
