Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

14.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52520

⸱

4 Mart 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

Bu makalede

Özet

Burada, biz yaşam içine ultrason mikrokabarcık kontrast maddeler, izole geç gebelik sahne kemirgen embriyolar enjekte etmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem perfüzyon parametrelerinin ve kontrastlı yüksek frekanslı ultrason görüntüleme kullanılarak embriyo içinde vasküler moleküler belirteçlerin çalışma sağlar.

Özet

Ultrason kontrastlı görüntüleme, doku vaskülaritesi ve perfüzyonu ile ilgili temel kantitatif bilgileri iletebilir ve hedefe yönelik uygulamalarda vasküler biyobelirteçlerin moleküler düzeyde saptanmasını ve ölçülmesini kolaylaştırabilir. Fare embriyosu içinde, bu invaziv olmayan teknik, erken fare dolaşım sisteminde ve kardiyovasküler hastalığın genetik modellerinde vasküler gelişimin altında yatan temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Fare embriyosu ayrıca mikro kabarcıkların anjiyojenik hedeflere (vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 (VEGFR2) veya αvβ3 dahil) yapışmasını incelemek ve moleküler ultrasonun kantitatif doğasını değerlendirmek için mükemmel bir model olarak sunar. Bu nedenle, ultrason kontrast maddelerini canlı, izole embriyoların damar sistemine sokmak için bir yöntem geliştirdik. Bu, enjeksiyon kontrolü ve konumlandırma, görüntüleme düzleminin tıkanıklık ve hareket olmadan tekrarlanabilirliği ve basitleştirilmiş görüntü analizi ve nicelemesi açısından özgürlük sağlar. Geç gebelik döneminde (embriyonik gün (E)16.6 ve E17.5) murin embriyoları uterustan izole edildi, yolk kesesinden nazikçe dışlandı ve plasental diskin koryonik yüzeyinde ulaşılabilen venlere mikrokabarcık kontrast maddeler enjekte edildi. Doğrusal olmayan kontrast ultrason görüntüleme daha sonra bir dizi temel perfüzyon parametresini (tepe artışı, yıkama hızı ve zirveye ulaşma süresi) toplamak ve bir endoglin fare modelinde hedeflenen mikro kabarcık bağlanmasını ölçmek için kullanıldı. Mikro kabarcıkların canlı embriyolar içinde başarılı bir şekilde dolaşımını ve bu yaklaşımın embriyonik vaskülatür ve mikro kabarcık davranışını karakterize etmedeki faydasını gösteriyoruz.

Giriş

Kontrastlı ultrason görüntüleme görselleştirmek ve damar ortamı karakterize etmek kabarcık kontrast maddelerin kullanımını kolaylaştırır. Bu ajanlar mikrosirkülasyon, damarlanma ve kardiyovasküler fonksiyonu noninvaziv değerlendirmesini sağlar. Buna ek olarak, baloncuk yüzeyinin modifikasyonu mümkün vasküler olay moleküler ultrason görüntüleme yapmak anjiyojenez, ateroskleroz ve inflamasyon 1,2 klinik öncesi uygulamalarda gösterildiği gibi, endotelyal biyolojik bağlanma hedeflenen mikro-sonuçlanabilir. Kontrastlı ultrason nedenle de sağlıklı ve hastalıklı damar durumları 3-5 etkileyen karmaşık ve çeşitli ortamlar belirlemek için kullanılabilir.

Yıl geçmiş sayıda, kabarcık görüntüleme programı ilgi yönlü fare embriyo modeli genişletmiştir. Memeli bir gelişme modeli olarak, embriyonik damar içine kabarcıkların giriş fizyolojik artırırGelişmekte olan dolaşım sistemi (örneğin, kan akımı, kardiyak output) ve transgenik durumlarda ve kalp hastalığı 6,7 hedeflenen mutant fare modellerinde, çalışma kardiyovasküler fonksiyonu nasıl değiştirdiğini genetik faktörler anlayışlar verebilir. Aslında, nicel ve nitel 2D embriyonik beyin damar analizleri zaten 8 elde edilmiştir. Bundan başka, fare embriyosu canlı dokuda vasküler belirteçlerle hedeflenen mikro-kabarcıklar bağlanmasının incelenmesi için mükemmel bir model olarak sunulur. Bartelle ve diğ. 9, örneğin, Biotag-BirA transgenik embriyo bağlanma ve damar anatomisinin incelemek hedeflenen değerlendirir embriyo kalp ventriküllere, avidin mikro-kabarcıkları getirmiştir. kliniğe Bu teknik çeviri önemli bir kriter - heterozigot ve homozigot fare modelleri üretimi de moleküler ultrason kantitatif tabiatının belirlemek amacıyla yapılan tümör modeli araştırmaları için bir vekil olarak kullanılabilir edilebilir.

mikro-en sık laparotomi 8-10 aracılığıyla maruz tek embriyo içi kardiyak enjeksiyonlar aracılığıyla embriyonik dolaşıma tanıtıldı. utero enjeksiyonları Ancak, bir takım zorluklarla karşı karşıya. Bu enjeksiyon rehberlik, anne ve batın embriyo hareketi karşı ihtiyacını, anne hemodinamik canlılığının bakım ve 11 kanama nedeniyle anestezi ve komplikasyon uzun vadeli etkileri ele batın embriyolar içerir. Bu nedenle, soruşturmanın amacı izole yaşayan geç evre embriyoların 12 içine mikrokabarcıkları enjekte için bir teknik geliştirmek oldu. Bu seçenek, enjeksiyon kontrol ve konumlandırma, tıkanma olmadan görüntüleme uçağın tekrarlanabilirlik ve basitleştirilmiş görüntü analizi ve ölçümü açısından daha fazla özgürlük sunuyor.

Bu çalışmada, biz fo yaşayan kemirgen embriyolara kabarcıkların enjeksiyon için yeni bir prosedür anahatr kabarcık kinetik davranışları okuyan ve amaçları endojen endotel yüzey belirteçleri bağlayıcı Kabarcığa hedeflenen Derslerinizi. Lineer olmayan bir kontrast özel ultrason görüntüleme tepe geliştirilmesinde uygulanmıştır (PE), yıkama-oranı ve süresi izole E17.5 embriyolar (TTP) tepe dahil olmak üzere temel perfüzyon bir dizi parametre ölçülmesi için kullanılır. Bu, aynı zamanda, aktif bir anjiyojenez 13 bölgelerinde damar endotel hücrelerinde yüksek ifade için endoglin klinik olarak anlamlı bir hedef işlev transjenik fare modeli, bir embriyonik endoglin kaybına moleküler ultrason kantitatif tabiatının değerlendirmek için embriyo modelinin geçerliliğini göstermek . endoglin hedefli (MB E) fare izotip IgG2 kontrol (MB C) ve hedefsiz (MB U) mikro-kabarcıkların yapışma heterozigot endoglin (İngilizce +/-) ve homozigoz endoglin (İngilizce + / +) sentezleyen embriyolar değerlendirilir. Hedeflenen bindinin analizing moleküler ultrason endoglin genotipleri arasında ayırt ve ölçülebilir moleküler ultrason seviyelerine reseptör yoğunlukları ilgili yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu çalışmada gerçekleştirilen deneysel prosedürler Hayvan Bakım Sunnybrook Araştırma Enstitüsü Komitesi (Toronto, Ontario, Kanada) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların insancıl için prosedürler her zaman dikkat edilmelidir. Bu araştırmacı bir ultrason görüntüleme sisteminin temel operasyonda eğitimli olduğu varsayılır. Bu protokol, iki kişi ile iyi çalışır.

1. Hayvan Modelleri

  1. Mate CD-1 erkek ve dişi Mus musculus perfüzyon çalışmaları için vahşi tip embriyolar elde etmek.
  2. Bourdeau ve ark. 14 tarafından tarif edildiği gibi moleküler görüntüleme çalışmaları için, 129 / Ola kökenli embriyonik kök hücreleri kullanılarak, homolog birleştirme yoluyla, Eng +/- fareleri üretmek.
    1. Geri çaprazlama B6- Eng +/- fareler, nazik, CD-1 arka Dr. Michelle Letarte elde. Kullanım Eng +/- CD-1 çaprazlanmış embriyoları, aynı zamanda bunların İng + / + yavru kontrols. Sahnelenen embriyolar üretmek için fareler Mate.

2. Deneysel hazırlanması

  1. Farelerin çiftleşme başlatın ve günlük fişlerini kontrol edin. Embriyonik gün 0.5 vajinal fiş görülmektedir günün öğleden olarak tanımlanır.
  2. 500 fetal sığır serumu, 50 ml, 5, 1 M HEPES ml Penisilin-Streptomisin ve 5 ml (10.000 birim penisilin, 10,000 ug streptomisin) eklenerek embriyo ortamı hazırlamak mi Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı, yüksek glikoz (DMEM) (4,500 mg / L). Folyo şişe sarın ve 4 ° C'de soğutulmuş tutmak.
  3. 20 dakika için 140 xg'de 50 ml konik tüpler santrifüj net ultrason jeli. 30 ml'lik şırınga içine jel çizin. Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve bir kenara ek (işaretli) 30 mi şırınga doldurun. Embriyoların biri çöp genellikle ultrason jeli 2-3 şırınga ve PBS 4 şırınga arasında gerektirecektir.
  4. Yaklaşık 30 cam iğneler çekin ve hamuru bir şerit bağlamak hafifçe100 x 20 mm hücre kültür kaplarına. Bu iğneler ayrıldı ve kullanım sırasında güvenli olmasını sağlar. Isıtıcı 77, Alt mıknatıs 55, Ana mıknatıs 70: cam çektirmenin kullanarak, filamanın 1 x 90 mm cam kılcal aşağıdaki ayarları kullanın.
  5. Baz için sertleştirici 8 hacim oranı: 1 kullanılarak, (kendi çanak alacak bir çöp içinde her embriyo sağlamak için yeterli) 10-12 diseksiyon tabak hazırlayın. 50 ml'lik bir konik tüp içine baz 40 ml dökün. 5-6 ml kür ajanı ekleyin ve tahta sopa ile karıştırın.
    1. Yaklaşık yarısına her bir doldurma, 60 x 15 mm kültür çanakları içine dökün. Stand O / N ayarlamak için izin ver.
  6. (: 0.79 mm iç çap) polivinil klorür (PVC) boru 400 mm uzunluğunda parçalara kadın dişlerde takın. boru rahatça ultrason aşamasına şırınga pompası ulaşmak gerekir.

3. Deney Seti-up

  1. 3B motor ve doğrusal dizi 21 MH cerrahi mikroskop altında görüntü platformu düzenlemekz dönüştürücü.
    1. Orient platformu ray monte böylece mikroskop altında doğrudan konumlandırılmış Evre, sol açık.
    2. Platformun uzanan kolunun topu eklem 3D motoru takın. Ileriye dönük, motorun monte hızlı sürümde dönüştürücü kelepçe hızlı bırakma sonrası Vida ve mandalı tespit, kelepçe dönüştürücü kafa yerleştirin.
    3. Arabanın ön panelindeki etkin limanda dönüştürücü konektörü sabitleyin. Makineyi açın.
  2. Moleküler görüntüleme çalışmaları için 'kardiyoloji' ayarı seçerek, 21 MHz ultrason dönüştürücüyü başlatın ve perfüzyon çalışmaları için 'genel'. Tam orta pozisyona her zaman kazanç-tazminat sürgü Shift. Sıklığı: 'Kontrast Modu' için, aşağıdaki parametreler ayarlanmalıdır 18 MHz, güç iletimi: 30 dB, Foci:% 4, (0.39 Mpa), Kazanç Kontrast Doğrusal Olmayan, Burst zamanı: 6 & 10 mm, Mod Kontrast 100% 0,1sn, Işın genişliği: Geniş.
  3. Kısım 40 mi embriyo ortam dört adet 50 ml konik tüp içine, her. Buz üzerine yerleştirin.
  4. Sıcak bir plaka üzerinde, bir 2 L'lik bir kap içinde su 1 L ısıtın. 45 ° C'de muhafaza edin. Ön ısıtmak için bir deney şişesine ultrason jel ve PBS, bir şırınga ekleyin. Her zaman bir termometre ile takip ederek bu sıcaklığı korur.
  5. Oniki 1 ml şırınga ve kabarcıkların enjeksiyonu için on 21 oniki G iğne kenara on ayarlayın.

4. Cerrahi Prosedür

NOT: Cerrah cerrahi prosedür başlar iken bir asistan kabarcıklar (evre 5) hazırlamak var. Burada açıklanan protokol Whiteley ve ark adapte edilmiştir. 15

  1. Servikal dislokasyon aşağıdaki hamile bir dişi fareden E16.5 veya E17.5 embriyolar toplayın.
    NOT: embriyoların anestezi etkileri henüz detaylı 16 incelenmemiştir. Dekapitasyon içeren ek yöntemler, uygun op olabilirHamile farelerin kurban ları.
    1. Rahim ve embriyoların ortaya çıkarmak için karın açmak kesin. Dikkatle ve hızlı bir şekilde (yumurtalık ve rahim damarlarının koparılması) uterus boynuzları ucunda kesme ve vajina ve mesane de kesilmesinin rahim kaldırmak.
    2. Kıymık forseps kullanarak, embriyo zarar vermeden mümkün olduğunca çabuk buz soğuk embriyo medya 40 ml tüp rahim aktarın. Fare karkas atın.
  2. Mikroskop ve sahneye taşınmaya. 100 x 20 mm hücre kültürü çanak içine rahim yatırın. 50 mi taze embriyo ortamı ile doldurulmuş yeni bir çanak içine rahim aktarın.
  3. Yavaşça gözyaşı ve bir ucunda başlayan rahim dış membranlar uzak çekin, sterilize (% 70 etanol sprey) ince forseps kullanarak. Plasental desidua, parietal sarısı kesesi ve ayırmak ve altta yatan visseral yolk kesesi kaldırmak için Reichert membran Açığa.
  4. Visseral y tutarak, tek tek embriyolar parçalara ayırolk keseler sağlam ve yavaşça mümkün olduğu plasenta 17 taşıma. Embriyolar hemen dışarı pop gibi yumurta sarısının rüptürü önlemek için dikkat edin.
    1. Taze embriyo medya ile buz üzerinde muhafaza başka yemeğe embriyolar taşımak için delikli kaşık kullanın. Ihtiyaç kadar soğutulmuş embriyolar tutun. Embriyo çanak her 1-1.5 saat ortamı değiştirin. Bu koşullar ile embriyolar diseksiyon sonra 4 saat boyunca yaşayabilir.

5. kabarcık Hazırlık

NOT: Her iki hedefli ve hedefsiz mikrokabarcıkları kullanarak ultrason ile moleküler görüntüleme gerçekleştirin. I) antikor hedeflenen mikro-kabarcıklar, ii) Kontrol izotip antikor hedeflenen microbubbles ve iii) hedefsiz microbubbles: Tek deney gibi birçok 3 olarak mikro kabarcık ayrı şişeleri gerektirebilir. Kontrast madde, bir kuru-dondurma bir toz halinde gelen ve enjeksiyondan önce serum fizyolojik ile yeniden gerekir. Her hedefsiz microb içinde ~ 2 x 10 9 mikro kabarcıklar vardırubble şişe ve • hedef hazır şişelerde 8.8 x 10 8 mikrokabarcıklar. mikro-kabarcıklar yeniden sonra 3 saat boyunca stabildir.

  1. Hedef Hazır Şişelerinin Sulandırma
    NOT: Hedef hazır preparatların örnekleri: endoglin hedeflenen mikro kabarcıklar (fare endoglin için biyotinile sıçan MJ 7/18 antikoru ile MB E; ev hibridoma tesis); vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 (VEGFR2) hedeflenen mikro-kabarcıklar (MB V, biyotin, anti-fare CD309 ile birlikte); Sıçan izotip IgG 2 kontrol antikoru hedeflenen mikro kabarcıklar (MB C, biyotin sıçan isotip IgG 2 kontrol fare IgG2a hedefleme).
    1. Tuz 1 ml antikor çözeltisi (20 ug) (nihai hacim) seyreltin. Buz üzerinde tutun.
    2. Tüm hava kabarcıkları kaldırarak, 1 ml serum fizyolojik ile şırınga doldurun. 21 G iğne takma, kabarcık şişenin içine yavaş yavaş çözüm enjekte.
    3. Yavaşça hava 1 ml kaldırarak, piston çekilme ve iğneyi çıkartın. Nazikçeçalkalayın. Buz üzerinde 5 dakika bekletin.
      NOT: Ultrason mikro kabarcıklar yüksek basınçlı ortamlarda altında tahrip olabilir.
    4. Zamanın geçmesinden sonra, antikor seyreltme ile yeni bir şırınga doldurun ve uygun bir şişeye ekleyin. Yavaşça çalkalayın. Karışım (şimdi 2 mi), 10 dakika boyunca bekletilir. Buz üzerinde tutun. Tam yüzey konjugasyon varsayarsak, mikro kabarcık için bağlı ligand ortalama sayısı yaklaşık 18 7,600 ligandlar / um 2.
  2. Hedefsiz Şişelerinin Sulandırma
    1. Tüm hava kabarcıkları kaldırarak, 1 ml serum fizyolojik ile şırınga doldurun. 21 G iğne takma, kabarcık şişenin içine yavaş yavaş çözüm enjekte.
    2. Yavaşça hava 1 ml kaldırarak, piston çekilme ve iğneyi çıkartın. Yavaşça çalkalayın. 5 dakika bekletin. Yukarıda tarif edildiği gibi, ilave bir 1 mL tuzlu su ekleyin. Yavaşça ajitasyon ve buz üzerinde 10 dakika bekletin.
  3. Coulter Sayma
    1. Yavaşça ~ istenen kabarcık flakon ajitasyon ve beraberlik21 G iğne kullanılarak bir 1 ml şırınga içinde çözelti 50 ul. Boş 2 ml mikrosantrifüj tüp içine mikrokabarcıkları enjekte edilir.
    2. Seyreltici 10 ml mikro-kabarcık stok çözeltisi, 10 ul örnek Pipet.
    3. Hafifçe karıştırdıktan sonra, ekim sayım (Malzeme listesi bakınız) kullanarak kabarcık nüfus yoğunluğu ve boyutu dağılımları değerlendirmek. 30 mikron diyafram kullanarak (flakon örnek başına) üç 50 ul ölçümleri en az Kont.
  4. Enjeksiyon için hazırlanıyor mikro-
    NOT: '' Embriyolar içine Mikrokabarcıkların Enjeksiyon 'zaman asistanı bu adımı gerçekleştirir (adım 6) başlatılır. Her embriyo her enjeksiyon için seçilen mikro-tipi rastgele mikro-her türlü eşit işlem boyunca dağıtılan ancak rastgele bir sırayla verilmiştir şekilde asistan tarafından seçilecek olan, bir kez enjekte edilir. Kabarcık türü enjekte ediliyor cerrah kör olduğundan emin olun.
    1. Th belirleyin400 ul bir hacim içinde, 1 x 10 8 MB ​​/ ml'lik bir son konsantrasyon üretmek (5.3.3 ölçülen stok konsantrasyonları kullanılarak hacmi hesaplamak) için gerekli olan hazır kabarcık çözeltisi E hacmi. Boş mikrosantrifüj tüpü içine tuz karşılık gelen hacmi alikosu.
    2. Yavaşça seçilen kabarcık flakon ajitasyon ve 21 G iğne kullanılarak 1 ml şırınganın içine çözeltinin (yukarıda hesaplanan daha 50 ul büyük ~) aşırı hacmi çizin. Boş bir mikrosantrifüj tüpe mikrokabarcıkları enjekte edilir.
    3. Kabarcık stok solüsyonu gerekli hacmi Pipet ve tuzlu kana ekleyin. Pipet ucu ile hafifçe karıştırılmıştır karıştırın.
    4. 21 G iğne kullanarak temiz bir şırınga içine seyreltilmiş kabarcık çözüm çizin. İğneyi Çıkarma, şırınga hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak ve dişin ve tüp takın. Yavaş yavaş hava kabarcıklarını oluşturmak için emin boru yapma sonuna kadar çözüm itin.
    5. Enjektörler i takın20 ul bir toplam hacim için 20 ul / dakikalık bir oranda mikro-kabarcıkları dağıtmak için bir şırınga infüzyon pompası, GE. Hortumun ucuna bir çekti cam iğne takın. Enjeksiyon aşamasına yakın pompa taşıyın.

Embriyolar içine Mikrokabarcıkların 6. Enjeksiyon

  1. Rasgele seçmek ve soğutulmuş medya çanak (delikli kaşık ile) bir embriyo çıkarın. Stereoskop altında ultrason sahnede bulunan diseksiyon çanak yerleştirin ve en az vaskülarize görünen tarafı (antimesometrial tarafı) yırtılma / kesme, ince forseps ile yumurta sarısı kesesi ve amniyotik membranlar çıkarın. Bu en kolay baş bölgesine bitişik bir alana delinmesi ile elde edilir.
    1. Içinde embriyo kaldırmak için yeterli, ama artık kesin. Hamuru küçük parçalar kullanılarak diseksiyon yemekleri stabilize.
  2. Yavaşça embriyo yerinden kese manevra. Plasenta ile, yan embriyo yerleştirin veönünde göbek gemiler. Yumurta sarısı kesesi aşağı pin, böcek işaretçilerine Kullanma (4 pim önerilir) ve gerekli plasenta kenarları yerine sabitlemek için. Büyük damarları kaçının.
  3. Embriyo canlandırıyor kadar önceden ısıtılmış 45 ° C PBS ile embriyo yıkayın. Göbek ven ve ilişkili vasküler ağı belirleyin. Enjeksiyon rahatça yapılabilir, böylece çanak yerleştirin.
    NOT: ısındı sonra, embriyo kan gözle umbilikal arterde pompalama, akmaya başlayacak. Akış ilk başladığında, damarlar hem gemiler hızla aynı görünen kanla, parlak kırmızı olacaktır. Göbek ven kaynaklanan dalları genellikle plasenta yüzey üzerinde göbek arter gelenler kaplaması.
  4. Embriyo canlandırdı sonra, ince embriyo etrafında (ince forseps kullanarak) herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olmak, önceden ısıtılmış ABD jeli ile (ancak plasenta) kapsamaktadır. Önceden ısıtılmış PBS ile çanak doldurun.
    NOT: soluti düzeyinde bir göz atıngerektiği gibi ve PBS ve jel şırıngalar ısıtma beher yedekleme şırınga ekleyin.
  5. Diseksiyon çanak kenarında hamuru büyük bir topa cam iğne takın ve PBS içine iğne ucunu. Kadar ana dal, makul plasental diskin koryonik yüzeyinde damar seçimi, makas kullanılarak boyutuna ucu kırpın. Ucu hafif bir açıyla kesilmiş ise Enjeksiyon kolay olduğunu. Yaylı makas kenarını kullanarak cam herhangi tırtıklı kenarları çıkarın.
  6. Tüm hava iğne ucundan dışarı atılır ve mikro-kabarcıklar PBS içine serbestçe akmasına görülebilir kadar şırınga pompası kullanılarak, yavaş yavaş cam iğne içine 20 ul / dk'da mikro-kabarcık solüsyonu enjekte edilir. Pompayı durdurun ve 20 ul bir enjeksiyon hacmi için sıfırlayın. Hava enjeksiyonu sırasında embriyonun damar sistemine girmesine izin vermeyin.
  7. Plasenta yavaşça damarların birine cam iğne ucu yerleştirin ve hareketsiz olduğundan emin olun. Stere savurOscope baş ve pozisyon embriyo üzerinde dönüştürücü. Görüntüleme başlatın.

7. Ultrason Moleküler Görüntüleme

NOT: Daha önce ayarlanmış kontrast doğrusal olmayan görüntüleme koşulları kullanarak, embriyo 6 ve 10 mm odaklar arasında eşit bulunmaktadır böylece dönüştürücüyü yerleştirin. Bir kez yerleştirilmiş, kabarcıkların bolus enjeksiyonu başlar. Enjeksiyon tamamlandığında, zaman ölçeri başlat.

  1. Perfüzyon Görüntüleme
    1. Doğrusal olmayan kontrast modu için kare sayısı 'çalışma yönetimi' düğmesine basarak ve çalışma Tarayıcınızın üst kısmındaki 'Prefs' sekmesini tıklayarak seçili olduğundan emin olun. 'Tercihler' penceresinde uygun kutuyu işaretleyin.
    2. Doğrusal olmayan görüntüleme başlatarak görüntüleme ayarlarını yapın. Kontrol panelinde 'kontrast modunu' düğmesine basın. 'Kazanç & # ayarlayarak 2B kazanç daraltın8217; 30 dB dial 'güç' dial kullanarak% 4 güç azaltmak, 'frekans' çevirmek ve geniş rulo top / fare kullanarak ışın genişliği (sol alt köşe) set kullanarak 1 Hz frekans azaltmak.
      NOT: Tüm kontroller ultrason sisteminin kontrol panelinde yer almaktadır.
    3. 1 Hz kare hızında bir 20 dakika sine döngü kaydederek kabarcık bolus tüm yıkama-in ve dağılımı yakalayın. Basın tarama / donma veri toplama başlatmak için.
    4. Görüntülerin tam sırası yakalanan edildikten sonra, sistem tampon görüntülerin sırasını kaydetmek için kontrol panelinde bulunan 'sine mağazası' düğmesine basın. Sistem edinilen doğrusal olmayan kontrast modeli veri tarih damgalı sine döngü oluşturur.
  2. Hedeflenen kabarcık Görüntüleme
    1. 'Prefs' altında, 0.1 sn patlama saati ayarlayın. Denetimleri des kullanarak uygun görüntüleme parametrelerini ayarlayınyukarıda açıklanan şekilde (7.1.2.).
    2. Kontrol panelinde 'kontrast modunu' düğmesine basarak doğrusal olmayan kontrast görüntüleme başlatın. Embriyo düzgün transdüser altında ve embriyo ile kabarcık kontrast madde akışı doğrusal olmayan kontrast modunu görüntüde görünür olduğunu almaktadır olun.
    3. Embriyonik moleküler görüntüleme sırasında bağlayıcı hedefe Kabarcığa değerlendirmek için, mikro-kabarcıkların 3 dakika enjeksiyonundan sonraki 40 saniye boyunca rahatsız edilmeden dolaşmasına izin verir. Bu kez dolaşımdaki mikro-kabarcık tutma sağlamaktır. Basın 'tarama / dondurma' Bu süre içinde görüntüleme durdurmak için.
    4. 3 dakika ve 40 saniyede, özgeçmiş görüntüleme embriyo yeterince PBS ile kaplıdır, hala görünür olduğunu doğrulamak için, ve mikro kabarcıklar dolaşmaya devam ettiğini. Basın 'tarama / dondurma' görüntüleme başlatmak için.
    5. Bir 'ön-destruc kaydederek 3 dk 50 sn sonrası enjeksiyon de bozulma / ikmal dizisi Edinme29 Hz yon 'akustik tepki dizisi. Basın 'tarama / dondurma' veri toplama başlatmak için. 4 dakika sonrası enjeksiyon 18,19 itibariyle, 0.1 sn yüksek frekanslı akustik patlaması başlatmak. Bir patlama uygulamak için 'patlama' düğmesine basın.
    6. (Tampon hattı dolana kadar) dizisinin geri kalanı için çerçeveler kayıt ve 'sine mağaza' tuşuna basarak sine döngü kurtarmak için devam edin.
    7. Mikrokabarcıkları dolaşan bir ek cine döngü toplayın. Bu, sonraki post-yıkım 'görüntüleme dizisi ışınını doldurulan yalnızca dolaşan kabarcık sinyallerini içeren varsayılır. Basın 'tarama / dondurma' görüntüleri toplamak için görüntüleme ve 'sine mağaza' başlatmak için.
    8. Her embriyo görüntüleme sonra cine döngüler etiketleyin. Basın 'Çalışma yönetimi', rulo topu kullanarak dosyayı vurgulayın ve uygun düğmesine basın 'görüntü etiketi' ve adını '' seçin.

Enjeksiyon sonrası Embriyolar 8. Taşıma

  1. Mesaj görüntüleme, istediğiniz gibi (başları kesilerek, servikal dislokasyon, karbon dioksit boğulma, ya da hızlı dondurma veya tespit takiben anestezi ile), dönüştürücüyü hareket embriyo sabitlemesini kaldırın ve euthanize.
  2. Sonraki her embriyo enjeksiyon için yeni bir diseksiyon çanak, iğne, şırınga ve tüp segmenti diseksiyonu ve canlanma sırasında kabarcık enjeksiyon çözümü alma yeri sonraki toplu hazırlanması, kullanılması gerekir.
  3. Ek analizler için doku örnekleri (örneğin, kuyruk, beyin) Kaydet (örneğin, izole kuyruk DNA, lacZ boyama, ya da batı blot 21 kullanılarak biyomarker ifade yarı-kantitatif tedbirler PCR analizi ile belirlenir genotiplemesi).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Eski in utero fare embriyoları ultrason kontrast ajanlarının enjekte enjeksiyonu ve ilgili ultrason görüntüleme boyunca rahim ve canlılığının korunması ile ilgili oturma, geç gebelik aşamasında embriyoların başarılı bir şekilde izole bağlıdır. Embriyo batın ve Şekil 1 'de gösterildiği gibi, konumlandıktan sonra, embriyonik damar içine kontrast maddenin dikkatli bir enjeksiyon mümkündür. Bir E17.5 fare embriyo tipik bir B-kipi ultrason görüntüsü Şekil 2A'da gösterilmişti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ultrason kontrast ajanlar geç evre gebelik fare embriyoları ve doğrusal olmayan kontrast görüntüleri enjekte edildi perfüzyon parametreleri ölçmek için edinilen ve bağlayıcı Kabarcığa hedef alındı. Embriyonik damar sistemi içerisinde mikro-kabarcıkların başarılı görüntüleme bir dizi faktöre, ilk olarak embriyo canlılığı bağımlıydı. Tüm ekipman ve cihaz enjeksiyonun başlangıcında rahim embriyoların izolasyonu için gerekli olan zamanı en aza indirmek için önceden hazırlanmıştır. Embriyonik fareler üzerinde anestezi tek ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

FS Foster, VisualSonics Inc.'in danışmanı olarak rolünü kabul ediyor.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kanada Ulusal Kanser Enstitüsü'nün Terry Fox Programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagents
Antibodies (biyotinillenmiş, eBioscience) — Antikor seçimi deneye bağlıdır
    < li > sıçan izotipi IgG < sub > 2 < / sub> kontrol < / li>< / ul >
eBioscience13-4321-85Bu antikor / mikro kabarcık kombinasyonu genellikle deneysel kontrol olarak gereklidir  
  • biotin anti-fare CD309
eBioscience13-5821-85
Biyotinile sıçan MJ 7/18 fare endoglinine karşı antikorEv hibridomaDış antikorlar da uygun olabilir: geçmişte eBioscience (13-1051-85) kullandık
Damıtılmış su
Embriyo ortamı
  • 500 ml Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Yüksek glikozlu orta
SigmaD5796
  • 50 ml Fetal Sığır Serumu
ATCC30-2020lot # 7592456
  • Hepes
Gibco156305 ml, 1 M
    < li> Penisilin-Streptomisin< / li>< / ul>
Gibco15140-1225 ml, 10.000 birim Kalem., 10.000 &# 956; g Strep
Etanol, %
Buz
ParaformaldehitSigma76240%4
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su [1x] SigmaD85371x, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan
Hamile fare, CD-1Charles River Laboratories Inc. 
% 0.9 sodyum klorür (salin)Hospira0409-7984-11
Ultrason kontrast maddesi, hedefe hazır ve hedeflenmemişMicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrason jeli (Aquasonic 100, renksiz)CSP Medical133-1009
Equipment
Hücre kültürü plakaları (4) :  100  x  20&nbşk; mmFisher Scientific08-772-22
Hücre kültürü plakaları (12): 60  x  15  mmSigmaD8054
SantrifüjSorvall Legend RT santrifüjü 
Konik tüpler, 50 ml BD FalconVWR21008-938
SeyrelticiBeckman CoulterIsoton II Seyreltici, 8448011
Diseksiyon makası (Wagner)Güzel Bilim AraçlarıWagner 14068-12
Forseps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)Güzel Bilim Araçları11200-33
Forseps, kıymıkVWR25601-134
Cam beher, 2 L (Griffin Beher)VWR89000-216
Cam kılcal damarlar, 1 x 90  mm GD-1 filamentliNarishigeGD-1
Cam iğne çektirmesiNarishigePN-30
EldivenAnsell4002
Brüt anatomi probuGüzel Bilim Araçları10088-15
Sıcak plakaVWR89090-994
Buz kovasıCole ParmerRK 06274-01
Görüntüleme Platform: VisualSonics Inc.Entegre Raylı Sistem
Işık kaynağı, fiber optikFisher Scientific12-562-36İdeal olarak ayarlanabilir kollara sahiptir
Luers (12), polipropilen dikenli dişi ¼-28 UNF dişliCole Parmer45500-30
Mikro ultrason sistemi, yüksek frekanslıVisualSonics Inc.Vevo2100
İğneler, 21 gauge (1 inç)VWR305165
Partikül boyutu analiz cihazıBeckman CoulterMultisizer 3 Coulter Sayacı Delikli
kaşık (Moria)Fine Science ToolsMC 17 10373-17
Pimler (6), siyah eloksallı minutien 0,15 mmGüzel Bilim Aletleri26002-15
Pipetleyiciler [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1.000 μ l]EppendorfResearch Plus  ayarlanabilir 3120000038;             3120000054;            
Pipet uçları [2-200  μ l, 50-1.000  μ l]EppendorfepT.I.P.S.                                    22491334;                        
Makas
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning
Boru, Tygon laboratuvarı 1/32 "x 3/32"VWR63010-007
Ahşap aplikatör çubuğu (çubuk, pamuklu kafa)VWRCA89031-270
Cerrahi mikroskop 5-8X büyütmeFisher ScientificSteromaster
Şırıngalar, 1 ml NormjectFisher14-817-25
Şırıngalar (10), 30 mlVWRCA64000-041
Şırınga infüzyon pompası Biyo-vaşak NE-1000
Termometre, -20-110  ° CVWR89095-598
ZamanlayıcıVWR33501-418
Tüpler, EppendorfVWR20170-577
Tüp rafları (3)VWR82024-462
Ultrason dönüştürücü, 20 MHzVisualSonics Inc.MS250
Vannas-Tübingen, açılıGüzel Bilim Aletleri15005-08
703120000062022491351

Kaynaklar

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65(2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581(2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162(2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097(2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ultrasonda Kontrast G r nt lemeFare Embriyosu Vask laritesiMikrobalon EnjeksiyonuPerf zyon ParametreleriHedeflenmi Mikrobalon Ba lanmasEndoglin Fare ModeliPlasental Vask ler ADo rusal Olmayan Kontrast UltrasonEmbriyo Manip lasyon Tekni i
Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.