Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol
Bu makalede
Özet
Özet
Organoidler olarak adlandırılan bağırsak kript-villus yapıları, uygun büyüme faktörleri ile desteklendiğinde üç boyutlu olarak sürekli kültürde tutulabilir. Organoidler, homeostatik kök hücre farklılaşması, hücre polaritesi ve erişkin bağırsak epiteli tarafından bilinen tüm terminal olarak farklılaşmış hücre tiplerinin varlığı açısından orijinal dokuya oldukça benzer olduklarından, epitel ile ilgili deneysel araştırmalarda önemli bir kaynak olarak hizmet ederler. Organoidlerde lentiviral veya retroviral vektörler kullanarak transgenleri veya enterferans yapan RNA'yı eksprese etme olasılığı, bağırsak epitelinin ve bağırsak kök hücrelerinin fonksiyonel analizi için fırsatları artırmış, hız ve maliyet açısından geleneksel fare transgeniklerini geride bırakmıştır. Mevcut video protokolünde, aşırı ekspresyon veya gen yıkımı için doksisilin ile indüklenebilir transgenler veya IPTG ile indüklenebilir kısa firkete RNA'sı kullanılarak gösterilen lentiviral vektörlerle ince bağırsak organoidlerinin transdüksiyonunun nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, organoid kültürünün, deneysel tedaviyle bile azaltılabilecek çok küçük hücre sayıları verdiği göz önüne alındığında, kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimyayı hedefleyen aşağı akış analizi için organoidlerin nasıl işleneceğini açıklıyoruz. Bağırsak organoidlerinde transgen ekspresyonunu ve gen yıkımını sağlayan teknikler, bu bağırsak epitel yapılarının sahip olduğu araştırma potansiyeline katkıda bulunur ve organoid kültürü hücre kültüründe yeni bir standart haline getirir.
Giriş
bağırsak epitel kanser ve kök hücreleri üzerinde araştırma geniş ilgi çekmek için neden olmuştur en hızlı çoğalan vücut dokuları biridir. 2009 yılında bir teknik 3 boyutlu bir yapı 1 korunması, matrigel küçük bağırsak kript uzun ömürlü kültürlerini oluşturmak için yayınlandı. Bu yapılar, bağırsak organoids orta BMP-sinyal yolu önleyicisi Noggin (Nog) de dahil olmak üzere tanımlanmış bir büyüme faktörü, bir dizi ile takviye çevreleyen, standart teknikler kullanılarak kültür edilebilir olarak adlandırılan 1 (Rspo1) rspondin Wnt-sinyal yolu güçlendirici ve epidermal büyüme faktörü (EGF) tüm bağırsak proliferasyonunu 2-4 arttırdığı bulunmuştur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Transfeksiyon Reaktif olarak polietilenimin (PEI) hazırlanması 1.
- H2O, 100 ml PEI'nın yaklaşık 150 mg çözülür
- Solüsyon berrak hale gelir ve tam olarak çözülene kadar karıştırın kadar HCI eklenerek pH 7.4 çözeltisi ayarlayın. Bu durum, 10 ila 60 dakika sürer ve 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar su ilave edilebilir.
- Ne zaman açık, 5 ml hacimde ° C derin dondurucuda bir -80 steril 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden PEI çözüm filtre.
Lentiviral Parçacıkların 2. Üretim
1. Gün:
- 162 cm2 şişeye ya da hücre hattı kültürü ortamında büyük ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Organoid lentiviral transdüksiyon
Lentiviral parçacıklar kullanılarak organoid iletimi tekniği öncesi ve transdüksiyon sırasında organoids doğru kullanımı bağlıdır. Organoids (Şekil 3A) kültürlenmiştir ve bir kript (Şekil 3B) içine dağıtıldı. Daha önce belirtildiği gibi, GSK3 inhibitörü Chir99021 mevcudiyetinde kültürlenmiş, bu tek kript kistik crypts 9 (Şekil 3C) olmuştur. Daha sonra organoids tek hücrelere virüs parçacı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mevcut video protokolü primer bağırsak epiteli ve kantitatif RNA teknikleri ve immünohistokimya kullanılarak, bu organoids aşağı doğru analizden organoids lentiviral iletimini tarif etmektedir.
Lentiviral transdüksiyon genellikle kültür plakaları içinde yapışık veya yüzen hücrelerin içinde gerçekleştirilir. Organoids bölgesinin üç boyutlu yapısı, viral parçacıklar tarafından nüfuz onları zor hale yana etkinliğini artırmak için bir dizi yöntem kullanılır. Chir99021 kullanılarak organoids ön i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
J. Heijmans, Hollanda Kanser Vakfı'ndan (KFW) bir burs ile desteklenmektedir. G.R. van den Brink, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013)/Avrupa Araştırma Konseyi hibe sözleşmesi numarası 241344 kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından sağlanan finansman ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (GvdB) bir VIDI hibesi ile desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Polietilen imine | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM ortamı | Lonza | BE12-614F | |
| Fetal buzağı serumu | Lonza | DE14-801F | |
| Penisilin-streptomisin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Gelişmiş DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Canlandırıcı | 17502-048 | |
| B27 | Canlandırıcı | 17504-044 | |
| N-asetil sistein | Sigma | A9165-1G | |
| fare Egf Canlandırıcı | PMG8045 | ||
| Hepes 1 M | Canlandırıcı | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Akson | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polibren | Sigma | 107689 | |
| nikotinamid | Sigma | N0636 | |
| Tripsin | Lonza | BE02-007E | |
| puromisin | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| & # 946; -merkaptoetanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA sistemi | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehit | Sigma | 252549-1L | |
| cam flakon konik 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosin Sarımsı | VWR | 1.159.350.025 |
Kaynaklar
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
