Cerrahi kolon tümöründen ve normal dokulardan birincil insan hücrelerini çıkarmak için bir protokol tanımlanmıştır. İzole edilen hücreler daha sonra hücre dışı bir matris proteini tarafından işlevselleştirilen yumuşak elastik substratlar (poliakrilamid hidrojeller) üzerinde kültürlenir ve floresan mikro boncuklarla gömülür. Hücresel kasılma streslerini değerlendirmek için traksiyon sitometrisi yapılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme
Bu makalede
Özet
Özet
Kanser hücreleri, bir adezyon reseptörlerinin oluşan koordine, hiyerarşik bir mekano-kimyasal sistem ve ilişkili sinyal transdüksiyon zar proteinleri, hücre iskeleti mimarisini, ve moleküler motorlar, 1, 2 ile karmaşık bir şekilde, mekanik sertliği matris yanıt. Mechanosensitivity farklı kanser hücrelerinin in vitro olarak olmayan primer insan kanser hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya murin türetilmiş birincil hücreler, öncelikle incelenmiştir. Bu nedenle, çok az, in vitro olarak, birincil insan kolon kanseri hücrelerinin mechanosensitivity şey bilinmektedir. Burada, optimize edilmiş bir protokol, sağlıklı ve kanserli cerrahi insan doku örnekleri primer insan kolon hücrelerinin izolasyonu açıklayan geliştirilmiştir. İzole kolon hücreleri daha sonra fibronektin (hücre dışı matris tarafından fonksiyonlandırılmış yüzeylerde poliakrilamid hidrojeller ve sert polistiren (~ 3.6 GPa sertlik) (10 kPa sertliği) (2 kPa sertliği), yumuşak ve sert başarıyla kültürebu durumda). Floresan mikro-hücre kültürü yüzeye yakın yumuşak jeller gömülür, ve çekiş tahlil özgür açık erişim yazılımı kullanarak hücresel kasılma stresleri değerlendirmek için yapılır. Buna ek olarak, farklı sertlik yüzeylerde immunofloresan mikroskopi substrat sertlik bir fonksiyonu olarak odak yapışıklıkların içeren birincil hücre morfolojisi, sitoskeleton organizasyon ve vinkülin hakkında yararlı bilgiler sağlar.
Giriş
Mekanik mikro-ortamında, biyo-kimyasal faktörlerin yanı sıra, hücre fonksiyonlarını düzenlemede önemli bir rol oynadığını Son yıllarda giderek daha belirgin hale gelmiştir. Hücreler duyu ve 3-7 (2D kültüründe olduğu gibi) uyulması ya da (3D kültür gibi) çevrili olan substrat sertlik yanıt verebilir. Böyle yaparak, hücreler farklılaşma 3, morfolojisi 4, göç / motilite 5, biyo-fiziksel özelliklerini 6, büyümeyi 7 ve diğer işlemler modüle.
Kanser hücreleri aynı zamanda bir yapışma reseptörlerinin koordine, hiyerarşik mekano kimyasal bileşimini ve ilgili sinyal iletim membran p....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda açıklanan protokol UIUC insan araştırma etik komitesinin kuralları izler.
1. Toplama ve Cerrahi Doku Örneği sindirimi
- Sağ kolon rezeksiyonu (Şekil 1A ve 1B) sonra tümör dokusu örneği toplayın. Hem de bitişik sağlıklı sitesinden doku toplayın.
- 12 mi HBSS çözeltisi ihtiva eden 15 ml'lik bir şişeye, hemen doku aktarın. Yalıtılmış bir köpük kutu içinde buz üzerinde şişe tutun.
- 45 dakika içinde daha fazla işlem için bir doku kültürü başlık doku ihtiva eden şişe taşıma. Kaput içinde bir buz bloğu üzerinde şişe tutun.
- Bir pipet kullanılarak HBSS çözeltisi 6-7 ml ihtiva eden bir 6 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıda açıklanan protokol başarıyla kurumsal inceleme kurulu kuralları uyarınca dört farklı hastalarda birden fazla doku örnekleri (n = 12) için kullanılır. Şekil 1A sağ hücre kültürleri için doku kesitleri elde edildiği ameliyat sonrası temsili kolorektal tümör göstermektedir. Daha sonraki işlemler için laminer başlık transfer edildikten sonra HBSS çözeltisi içinde tipik bir doku kesiti Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Sindirim ve tek bir hücre süspansiyonu içine cerrahi doku numunes.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücresel çekiş stres geçenlerde metastatik devletinin 13 potansiyel biyofiziksel göstergesi olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, primer tümör hücreleri ile deneysel çekiş verileri güncel literatürde bulunmaktadır. Ayrıca, farklı sertlik poliakrilamid jeller doğrudan kültüre izole primer kolon hücreleri henüz bildirilmemiştir. Dolayısıyla, jeller ve polistiren (Şekil 2) bir optimize edilmiş primer kolon hücre kültürü şartlarını da belirlemektedir. Yumuşak jel hazırlanması sırasında hücre.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu proje, Ulusal Bilim Vakfı ECCS hibesi 10-02165 ve Disiplinlerarası İnovasyon Girişimi Programı, Illinois Üniversitesi hibesi 12035 tarafından finanse edilmiştir. M.Y.A., UIUC'de NIH Ulusal Kanser Enstitüsü Kanserde Nanoteknoloji İttifakı 'Midwest Kanser Nanoteknoloji Eğitim Merkezi' Hibe R25 CA154015A'den finanse edildi. İmmünnoboyama ve konfokal mikroskopi görüntüleme, UIUC Genomik Biyoloji Enstitüsü'nde (IGB) gerçekleştirildi. M.Y.A., UIUC'DEN B. J. Williams ile izolasyon deneyleri ile ilgili görüşmeleri kabul eder. M.Y.A., UIUC'DEN C. Nemeh ve Abdul Bhuiya'ya şematik ve malzeme listesi hazırlama konusunda yardım için teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| HBSS | Yaşam teknolojileri | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tripsin | Worthington | LS003736 | |
| Kollajen | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropiltrimetoksisilan (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehit | Polibilimleri, Inc. | 01201-5 | |
| Akrilamid | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-metilenbisakrilamid (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES tampon çözeltisi | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Amonyum persülfat | Bio-Rad | 161-0700 | |
| İnsan fibronektini | BD biyolojik bilimler | 354008 | |
| Hidrazin hidrat | Sigma-Aldrich | 18412 | Tehlikeli |
| Asetik asit | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Bilimleri | RT15710 | |
| Sinyal arttırıcı | Yaşam teknolojileri | I36933 | |
| Monoklonal anti vinkülin antikoru | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG | Yaşam teknolojileri | A11001 | |
| TRITC phalloidin konjugatları | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 ve mikro; m fluroscent boncuklar | Yaşam teknolojileri | F8801 | |
| %0,25 Tripsin-EDTA | Yaşam teknolojileri | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 cam kapak fişleri | Corning | 2865-12 |
Kaynaklar
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
