Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu ⁺ CD45RB ^Yüksek Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

İnflamatuar barsak hastalıkları (IBD) Crohn hastalığı ve ülseratif kolit, konak immün yanıtları, genetik yatkınlık, çevresel faktörler ve enterik luminal içerikler arasındaki tam olarak tanımlanmamış ve karmaşık bir etkileşimden kaynaklanır¹. Son genom çapında ilişkilendirme çalışmaları, bağışıklık hücresi düzenleyici genler ile IBD duyarlılığı arasındaki ilişkileri bildirmektedir^2,3. Bu çalışmalarda hem doğuştan gelen hem de adaptif immün hücre intrinsik genleri temsil edilmektedir, bu da bu hücre popülasyonlarının IBD patogenezinde merkezi bir rol oynadığını göstermektedir.

Şu anda insan IBD'nin 50'den fazla hayvan modeli var. Hiç kimse insan IBD'sini mükemmel bir şekilde fenoskopileştirmese de, birçoğu hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi ve yara iyileşme tepkisi dahil olmak üzere insan hastalığının çeşitli yönlerini incelemek için yararlıdır. Burada anlatılan yöntemde, sinjenik dalak CD4⁺CD45RB^yüksek T hücresi adoptif transferi ile T ve B hücre eksikliği olan alıcı farelere⁴ bağırsak iltihabı başlatılır. CD4 ⁺ CD45RB^yüksek T hücresi popülasyonu, kronik ince bağırsak ve kolon iltihabını indükleyebilen, aktivasyon için hazırlanmış esas olarak naif T hücreleri içerir. Bu yöntem, araştırmacının, hastalık patogenezi ile ilgili biyolojik olarak ilgili soruları yanıtlamak için hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık hücresi popülasyonları dahil olmak üzere temel deneysel değişkenleri değiştirmesine izin verir. Ek olarak, bu yöntem, hastalık başlangıcının kesin olarak başlatılmasını ve iyi karakterize edilmiş bir deneysel zaman seyri sağlar. Bu, farelerde hastalık ilerlemesinin klinik özelliklerinin kinetik çalışmasına izin verir. Bu yöntemle indüklenen bağırsak iltihabı, kronik kalın ve ince bağırsak transmural iltihabı, TNF ve IL-12 gibi sitokinler tarafından yönlendirilen patogenez ve israf gibi sistemik semptomlar dahil olmak üzere insan IBD'si ile birçok özelliği paylaşır⁵. Bu nedenle, insan IBD'sinin patogenezini incelemek için ideal bir model sistemdir.

Buradaki yöntem, CD4^{+CD45RB yüksek} T hücrelerinin Rag1^-/- farelere evlat edinerek aktarılmasıyla deneysel koliti indükleme protokolünü ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Önemli teknik adımları, beklenen sonuçları, optimizasyonu ve sorun gidermeyi tartışıyoruz. Araştırma amaçlı bu murin bağırsak iltihabı modelinin başarılı bir şekilde geliştirilmesi için gerekli unsurları ele alıyoruz.

NOT: Tüm hayvan protokolleri ile ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönetmelik ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin Kılavuz uygun onaylanmış emin olun. Verici fareler erkek veya kadın olabilir, ancak alıcı fareler erkek olmalıdır. Dişi alıcı kullanılacak ise, verici fareler ⁵ kadın olmalıdır. Böylece, farelerin ^5,6 kolit fenotip, bu intestinal mikrobiyota etki edilebilir, düzenli olmayan steril yatak ve asitli-olmayan su kullanılarak koloni bakımı ve.

1. Deneysel hazırlanması

1. Buz soğukluğunda ortamı ve tamponlar kullanın. Deney boyunca buz üzerinde hücreleri tutun.
2. Steril tekniği kullanarak steril biyolojik tehlike kaput deney yapın.

Dalak T hücrelerinin 2. izolasyonu

1. Donör fare / CO fareler servikal dislocatio ₂ odacık ardından euthanizen. % 70 etanol ile karın püskürtün.
2. Karın yatay bir kesi yapmak ve periton maruz cilt soymaya. Uzak forseps ile iç organlardan periton tutun ve ortaya çıkarmak ve dalağı tüketim sol karın periton bir kesi yapmak.
3. Petri kabındaki tam ortam, 10 ml dalak yerleştirin. Çıkarın ve dalak aşırı doku atın.
4. Ezmek ve tek hücre süspansiyonu içine dalak ayrı kızdırmak için 2 steril cam slaytlar kullanın. Filtre hücresi 50 ml konik tüp içine 70 mikron süzgeç vasıtasıyla süspansiyon ve tam Medya 5 ml süzgeç durulayın. Bir 50 ml konik tüp içinde 5 dalak kadar yerleştirin.
5. 7 dakika için 450 xg'de Santrifüj hücreleri. Kapalı dökerek ya da atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
6. Yavaşça, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, kırmızı kan hücrelerinin lize etmek için Lizis Tamponu dalak başına 5 ml süspansiyon hücrelerin. Tüpe tam ortam içinde eşit hacimde (dalak başına 5 mi) eklenir.
8. Yavaşça Etiketleme Tampon, 10 ml hücreler tekrar süspansiyon.
9. Tripan mavi dışlama hücreleri saymak.
   1. Hücre süspansiyonu 20 ul çıkarın ve bir mikrofüj tüpüne 180 ul, tripan mavisi ekleyin ve iyice karıştırın. 5 dakika sonra, hemositometrede ve mikroskop altında olmayan mavi hücreleri saymak için hücreleri etiketli 10 ul ekleyin. Canlı hücrelerin toplam sayısını belirleyin. Hücre / tripan mavi karışımı atın.
10. 7 dakika boyunca 450 xg'de Etiketleme Tampon, 10 ml santrifüj hücreleri. Kapalı dökerek ya da atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.

CD4 ⁺ T hücreleri 3. zenginleştirilmesi

NOT: Bu bölümde kullanılan belirli ürünler için üreticinin talimatlarına uyun.

1. Yavaşça soğuk etiket 20 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir tek hücre süspansiyonuna hücreleri tekrar süspansiyoning Tampon.
2. Biyotinlenmiş CD4 T hücresi zenginleştirme antikor 1 x 10 ⁶ hücre başına 5 ul ekleyin. 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakılır.
3. Etiketleme Tampon 10x hacim ekleyin. 7 dakika 450 × g Santrifüj hücreleri. Dikkatle atık kabına vakum emme kullanarak tüm süpernatant aspire.
4. İyice streptavidin-konjuge manyetik parçacıklar girdap. 1 x 10 ⁶ hücre başına parçacıkların 5 ul ekle.
5. İyice fakat nazikçe karıştırın. 30 dakika boyunca, 6-12 ° C'de bir karışım tutun.
6. 20-80 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar Etiketleme Tamponu ekleyin. 12 x 75 mm yuvarlak alt test tüpüne başına hücreleri etiketli 1.0 ml kadar aktarın ("pozitif kesir tüp" olarak anılacaktır).
7. 6-8 dakika mıknatıs her olumlu-fraksiyon tüpü yerleştirin.
8. Mıknatıs hala pozitif kesir tüpleri ile dikkatlice (yeni steril 50 ml konik tüp cam Pasteur pipet ile pozitif fraksiyon tüpten referre süpernatant aktarmak"zenginleştirilmiş fraksiyon") olarak d. Bu zenginleştirilmiş fraksiyon, CD4 ⁺ T hücrelerini içerir. Mıknatıs çekti etiketli hücreleri bozmak için değil dikkatli olun.
9. Süspanse edin hücreleri aşağı yukarı şiddetle pipetleme ve adım 3.6 gibi Etiketleme Tampon aynı hacimde pozitif kesir tüplerde bıraktı. 6-8 dakika geri mıknatıs üzerinde pozitif kesir tüpü yerleştirin.
10. Mıknatıs hala pozitif kesir tüpleri ile dikkatlice mıknatıs bağlı hücrelerin aksatmadan 50 ml Aşama 3,8 konik tüp, steril cam Pasteur pipet ile pozitif fraksiyon tüp süpernatant (zenginleştirilmiş fraksiyonu, CD4 ⁺⁾ aktarın.
11. Tekrar Elde edilen CD4 ⁺ T hücrelerinin verimini artırmak için 3,9-3,10 adımları tekrarlayın. Zenginleştirilmiş fraksiyon (CD4 ⁺ hücreleri) kullanılarak protokolü devam edin.

4. Etiketleme ve sıralama Hücreler ⁷

1. Santrifüj 7 dakika için 450 xg'de hücreleri zenginleştirilmiş. Veya vakum emilmesini kapalı dökerek süpernatant atınatık kabına iyon.
2. Etiketleme, 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri. Saymak ve aşama 2.9 olarak tripan mavisi eksklüzyonu ile hücre canlılığı değerlendirmek için hücreler kısım çıkarın.
3. 10 x 10 ⁶ hücre / ml Etiketleme getirme tamponunun bir hacminin ilave et; hücrelerin önceden ise <10 x 10 ^6, 7 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj, atık kabı içine dökülen ya da vakum emiş ile süpernatan atılır ve 10 x 10 ⁶ hücre / ml Etiketleme Tamponu hacmi ekleyin.
   1. Mikrofüj tüplerinde izotip lekeli, boyanmadan ve tek boyanmış kontrol hücreleri için yaklaşık 5-10 x 10 ⁵ hücre, her biri ayrı ayrı alikotları ayarlayın.
4. Hücrelere 5 ug / ml CD4-FITC ve 1 ug / ml CD45RB-PE ekleyin. Mikrofüj tüplerinde alikotları mülk aynı konsantrasyonda izotip kontrol lekeleri ve tek lekeler ekleyin. Iyi bir şekilde fakat nazikçe karıştırın ve 30 dakika için ışıktan korunması buz üzerinde inkübe edilir.
5. Hücre ve kontrolü Etiketleme Tampon 10x hacmi ekles. 7 dakika Santrifüj 450 xg. Atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
6. Adım 4.5 hacme Etiketleme Tampon süspanse. 7 dakika Santrifüj 450 xg. Atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
7. 10 x 10 ⁶ hücre / ml Etiketleme Tamponu içinde yeniden süspanse edin. FACS tüpüne 70 mikron süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. FACS için hazır olana kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
8. Set up ve boyanmamış hücreler ve tek lekeli kontrolleri ile hücre sıralayıcı uygun tazminat belirler.
9. Ileriye ve yan dağılım yolluk (Şekil 1A) ile cansız hücreleri hariç. Izotip-lekeli kontrolleri ile CD4 ⁺ ve CD45RB ⁺ hücreleri için yolluk ayarlayın. CD4 ⁺ nüfus Kapı hücreleri.
10. Tam ortam, 2 ml tüplere PE-boyanmış hücreler için basit bir histogram kullanarak ^yüksek CD45RB ve ^CD45RB alt popülasyon kriteri CD4 ⁺ hücreleri. ^Yüksek CD45RB + CD45RB ⁺ hücreleri ^(yüksek CD45RB) en yüksek% 40 temsil eder ve ^CD45RB alt popülasyonu, CD4 ⁺ CD45RB ⁺ hücrelerinin en% 20 ^(alt CD45RB, Şekil 1B).

Şekil 1: FACS analizi sırasında, CD4 ⁺ CD45RB, T hücre popülasyonlarının sitometrisi lekeleri Örnek akımı (A - C), FITC CD4 ve PE içine FACS ile sınıflandırılmıştır verici, C57BL / 6 farelerinden alınan splenositler CD45RB lekeli CD4 ⁺ CD45RB ^yüksek ve CD4 ^{+. CD45RB} alt T hücresi popülasyonu. (A) Doublet olayları ileri dağılım arsa üzerinde dışı bırakıldı. (B) lenfositler ileri ve yan dağılım arsa kapılı edildi. (C), CD4 ⁺ (D) CD4 ⁺ CD45RB ⁺ T hücreleri, PE karşı etkinlikler histogram çizilmiştir. CD4 ^{+ CD45RB} alt hücreler, CD45RB ⁺ hücrelerinin en% 20 olarak kabul edildi. CD4 ^{+ CD45RB, yüksek} hücre CD45RB ⁺ hücrelerinin en yüksek% 40 olarak tayin edilmiştir.

11. Popülasyonlarının saflığı analiz etmek üzere FACS makinede her bir hücre popülasyonunun bir kısım çalıştırın.
12. Santrifüj 7 dakika için 450 xg'de hücreleri sıralanır. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse. Saymak ve aşama 2.9 olarak tripan mavisi eksklüzyonu ile hücre canlılığı değerlendirmek için hücreler kısım çıkarın.

Alıcılar içine Hücreleri 5. Enjeksiyon

1. Süspanse 4 x 10 ⁶ hücre / ml (CD45RB ^yüksek) veya PBS 2 x 10 ⁶ hücre / ml ^(düşük CD45RB) hücreleri sıralanır.
2. Yeni steril tüpe alıcı başına CD45RB ^yüksek hücrelerin 100 ul aktarın. PBS Başı 100 ul ekleyinbu tüp alıcısı. Bu nedenle, hayvan başına toplam enjeksiyon hacmi 200 ul ve alıcı için hücrelerin toplam miktarı, 4 x 10 ^5, CD4 ⁺ CD45RB ^yüksek naiv T hücreleri.
3. Regülatör T hücreleri alan deney grubu arzu edildiği takdirde, yeni bir steril tüpe alıcı için ^{CD45RB, yüksek} hücre 100 ul aktarın. Aynı tüp alıcı başına CD45RB ^düşük hücrelerin 100 ul ekleyin. Hayvan başına toplam enjeksiyon hacmi 200 ul; CD45RB ^yüksek oranı: ^CD45RB alt hücreler 2: 1 dir.
4. ^Yüksek / ^düşük CD45RB CD4 ⁺ hücreleri intraperitoneal her alıcının karın (200 ul toplam) sağ ve sol tarafına CD45RB ^yüksek veya CD45RB 100 ul enjekte edilir.

Alıcı Hayvanlarda Hastalık ilerleme 6. İzleme

1. Alıcı hayvanların klinik durumunu değerlendirmek aşağıdaki Paramete için toplam klinik skorları atamak içinEnjeksiyon gününde rs ⁸ haftalık sonra, ve kurban sırasında:
   1. Kilo kaybı ölçerek israf belirleyin: 0 - hayır kilo kaybı; 1 - İlk vücut ağırlığının% 0.1-10 kaybı; 2 - Başlangıç ​​vücut ağırlığı (Şekil 2A), ve% 10'dan daha fazla zarar.

Şekil 2: inflamasyonun klinik ve toptan patolojik işaretler Rag1 içine yabani tip CD4 ⁺ CD45RB ^yüksek T hücrelerinin transferinden sonra meydana ^{- / - 11} (A) 'NRDKO alıcıları 5 ile başlangıç ​​vücut ağırlıkları 10 ortalama% kayıp NRDKO alıcı fareler. haftalar sonrası transfer, Rag1 ise- / - Alıcıları, şu anda, hastalığın klinik belirtilerini göstermemiştir. Her nokta ± SEM kohort için başlangıç ​​vücut ağırlığının ortalama yüzdesini temsil eder. ** P <0.005. Rektal prolapsus varlığı ile gösterildiği gibi (B) Bazı fareler, şiddetli bağırsak iltihabı geliştirdi. Bu NRDKO alıcı fare rektal prolapsus temsili resim. (C) Büyük oranda, gelen iki nokta üst üste, hem Rag1 ^{- / -} ve NRDKO alıcı fareler Rag1 gelen iki nokta üst üste ile karşılaştırıldığında kalınlaşmış ve kısaltılmış ^{- / -} ve T hücre evlatlık transferi olmadan NRDKO fareler. NRDKO alıcı farelerin kolonlar şiddetli inflamasyon ve artan kolon ağırlıkları (veriler gösterilmemiştir) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. 2. O geçene kadar temiz bir kaba hayvan yerleştirerek dışkı kalitesini belirleyinDışkı: 0 - yok; 1 - yumuşak dışkı; 2 - sulu ve / veya kanlı dışkı.
   3. Hastalığın belirtileri aşağıdaki varlığı ile hayvanın genel sağlık belirleyin: 0 - hayır kambur duruş, kürk, ya da cilt lezyonları kıllı; 1 - Aşağıdaki mevcut herhangi bir: kambur duruş, kürk, deri lezyonları veya kıllı.
   4. Rektal prolapsus varlığı belirleyin: 0 - devamsızlık; 1 - Mevcut (Şekil 2B).
2. Bu, başlangıç ​​vücut ağırlığına göre% 20 kayıp ya da hangisi daha önce arzu edilen bir zaman noktasında, var olduğunda CO, sonra servikal dislokasyon ₂ inhalasyon hayvanlar kurban. Klinik hastalık haftada 5 sonrası dolgunluk başlayan tipik açıktır.
3. Daha önce açıklandığı gibi ^5,7 hastalık şiddeti değerlendirmek.
   1. Adım 6.1 ⁸ gibi klinik skorları atayın.
   2. Kolon uzunluğu ve ağırlığı (Şekil 2C) ölçün.
   3. Inflamasyon histolojik analiz gerçekleştirin5.
   4. Bağırsak doku eksplant kültürlerinde ⁹ spontan sitokin ifadesini belirleyin, mezenterik lenf düğümleri ^10, ve / veya serum ^11.
      1. Kısaca, eksplant kültürler ^9, uzunlamasına açık, kurban sonrası iki nokta üst üste kaldırmak ve PBS ile temiz. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tam ortam içinde 250 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde iki nokta üst üste inkübe edin.
      2. Küçük parçalar halinde doku doğranır ve 24 saat süre ile tam ortam içinde, 37 ° C'de inkübe edildi. Süpernatan toplamak ve ELISA ile 100 mg doku başına düşen sitokinlerin miktarının belirlenmesi için kullanılır.
   5. T hücre fenotipleri ve / veya fonksiyon ¹⁰ ex vivo karakterizasyonu gerçekleştirin.

Yaklaşık yetişkin, C57BL / 6 verici fareden 10 dalaklarından 10 x 10 6, CD4 + T hücreleri, CD45RB yüksek güvenilir izole edilir. Bu sayı yaşla ve gerginlik verici fare ve araştırmacı yeterliliğine bağlı olarak değişecektir. Ne zaman 4 x 6 CD4 + T hücreleri CD45RB yüksek C57BL / 6 Rag1 aktarılır / 10 5 C57BL - / - alıcı fareler, hastalığın klinik belirtileri hafta 5 sonrası dolgunluk etrafında ortaya veya fareler (daha ağır hastalığa genetik olarak duyarlı olan er ise Şekil 2, 3) 11,12. - / - CD3 + T hücreleri Rag1 kolonları biriken görülür alıcıları gibi erken 3 hafta (Şekil 3A) 12 gibi.

Şekil 3: vahşi tip CD4 Transferi + Rag1 içine CD45RB yüksek T hücreleri - / - ve RKO / δ KD alıcıları kronik intestinal inflamasyonu 12 uyarmaktadır (A) (Orijinal büyütme 10X, H & E ve CD3 immünhistokimya).. / - - Alıcıları H & E boyama (üst paneller) epitel hiperplazi, iltihabi hücre infiltrasyon ve RKO / δ KD alıcılarında mevcut kript apseleri (ok) değil Rag1 göstermektedir. - / - Alıcıya RKO / δ KD alıcı fareler Kolonlar Rag1 gelen iki nokta üst üste göre CD3 IHC (alt paneller) ile CD3 + T hücrelerinin belirgin birikimi görüldü. Kolonlar fr kıyasla (B) Kolonlar RKO dan / δ KD alıcı fareler daha şiddetli inflamasyon gösterdiom Rag1 - / - histoloji puanlaması tarafından belirlenen alıcı fareler. (C, D) kolon eksplant kültürleri yaptım daha az IL-10 (C) salgılanan RKO / δ KD alıcı fareler ve daha fazla IL-12p40 (D) Kolon eksplant kültürler Rag1 - / -. Alıcı fareler bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.

/ - - / Rag1 - / - çift nakavt alıcıları (NRDKO) Rag1 göre daha şiddetli kolit geliştirmek - Biz daha önce Nfil3 içine evlatlık T hücre transferi yayınlanmıştır / - alıcı fareler (Şekil 2) 11. NFIL3 olumsuz bağımsız olarak, IL-10-inducing etkileri 13 murin kolon makrofajlar IL-12p40 düzenler. IL-12p40 ve IL-10 düzensizliği yolu karıştığıinsan ogenesis İBH 1. Bu nedenle, kilo kaybı (Şekil 2A) ile gösterildiği gibi, daha hızlı bir hastalığın ilerlemesinde adoptif transfer NDRKO alıcı farelerde, kontrolsüz IL-12p40 üretimi. Bazı NRDKO alıcı fareler rektal prolapsus (Şekil 2B) sonuçlanan şiddetli hastalık gelişti. - / - Alıcı farelere (Şekil 2C) fena halde Rag1 göre, NRDKO alıcı fareler iki nokta incelmiş ve kolon, inflamatuar hücrelerin büyük bir akın eden, kısaltılmış.

Nispeten, Rag1 içinde - / - olmayan lenfosit toplumlarda bir işlevsiz PI3K katalitik alt birim p110δ (RKO / δ KD), CD4 + T hücre CD45RB yüksek doyurma NRDKO fareler ile karşılaştırıldığında hastalığın benzer hızlı ve ağır klinik seyir uyarır fareler (Şekil 3) 12. 3 hafta histolojik analiz kolon doku hipertrofisi, inflamasyonu gösterirtory hücre infiltrasyon ve kript apseleri Rag1 kıyasla RKO / δ KD alıcılarında (ok) - / - alıcıları (Şekil 3A). Bu deneyde alıcı farenin dolayı başlangıç ​​vücut ağırlığına göre% 20 kaybetmiş bir önemli sayıda 3. haftada kurban edilmiştir. Deney gruplarına kör ve bizim laboratuvarda 12 geliştirilen belirli ölçütlere dayalı bir patolog tarafından belirlenen histolojik puanları, Rag1 kıyasla RKO / δ KD alıcı farelerde yüksek olduğu - / - alıcı fareler (Şekil 3B). Buna ek olarak, kolon eksplant kültürlerinde kendiliğinden sitokin üretimi göstermiştir Rag1 göre RKO / δ KD alıcı farelere IL-10 ve geliştirilmiş IL-12p40 üretimi azalır - / - alıcı fareler (Şekil 3C, D), 12. Yine IL-12p40 artış ve IL-10 üretiminin insan patogenezinde İBH 1 karıştığı azalmıştır.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.