CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Gen hedefleme modern biyomedikal araştırmalarda gen fonksiyonlarını karakterize için kritik bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, insan hücrelerinde gen hedeflemesi etkinliği arzu edilen bir oranda insan hücre hatlarının üretilmesini engelleyen, düşük olmuştur. Geçtiğimiz iki yıl gibi CRISPR (interspaced Kısa palindromic Tekrarlar Düzenli Kümelenmiş) / Cas (CRISPR ilişkili) sistem olarak genom düzenleme araçları ile genetik manipülasyon verimliliğini artırmak üzerine hızlı bir ilerleme tanık olduk. Bu el yazması homolog rekombinasyon destekli CRISPR / Cas sistemini kullanarak soyu belirli insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) gazetecilere üretmek için bir protokol tanımlamaktadır. CRISPR / Cas sistemi kullanılarak nöral nesilli raportör çizgileri yapmak için gerekli bileşenleri elde hedefleme vektörleri ve tek bir kılavuz RNA'lar yapımı odaklanan prosedürleri tarif edilmiştir. Bu protokol hiPSCs platform kurulması ve mutasyon düzeltme uzatılabilir.
Giriş
CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi, diğer genom düzenleme araçlarıyla birlikte, son yıllarda insan genomu manipülasyonunda devrim yaratmıştır1-7. CRISPR/Cas9 sistemindeki ana bileşenler, tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cas9'dur. Cas9, RNA güdümlü bir tip II DNA endonükleazdır. Bir protospacer bitişik motifin (PAM) yanındaki belirli bir genomik bölgede DNA çift sarmallı kırılmalar (DSB'ler) yapmaktan sorumlu olan HNH ve RuvC olmak üzere iki nükleaz alanına sahiptir7-10. Bir sgRNA, eksojen kaynakların DNA istilasına karşı savaşmak için bakterilerde (Streptococcus pyogenes gibi) ve arkelerde tanımlanan iki adaptif bağışıklık RNA molekülü olan crRNA ve tracrRNA'nın birleşik bir işlevine sahiptir9-11. Uygun şekilde tasarlandığında ve memeli hücrelerine birlikte eklendiğinde, sgRNA, PAM dizisini tanır, hedef DNA'nın tamamlayıcı ipliği ile baz çiftleri yapar ve Cas9'u PAM7'nin hemen yukarısındaki her iki DNA zincirinde parçalanması için yönlendirir ve transaktive eder. Daha sonra, DSB'leri onarmak için homolog yönlendirilmiş rekombinasyon (HDR, bir hedefleme vektörünün varlığında) veya homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) meydana gelecektir. cDNA'lar, raportör kasetler veya antibiyotiğe dirençli fragmanlar gibi transgenler entegre edilebilir ve transgenik veya knockin hatları yapılabilir.
CRISPR/Cas9 sistemi oldukça verimli ve nispeten spesifik olmasına rağmen, istenmeyen hedef dışı aktiviteler bildirilmiştir12-15. Hedef dışı olayları en aza indirmek için, Cas9 nickazları (Cas9n) da9,10,14,16,17 olarak tasarlanmıştır. Cas9n (Cas9 D10A veya Cas9 H840A), iki nükleaz alanından birinde mutasyonlara sahip Cas9 enzimidir ve bu enzim sadece bir DNA zincirinde bir çentik ortaya çıkarır. Her iki iplikçikte de bölünme elde etmek için, iki sgRNA, iki farklı DNA zincirinin yakın lokuslarında ayrı ayrı kesen bir çift nikkaseye rehberlik etmek üzere tasarlanmıştır. "Çift çentikleme" stratejisi, geleneksel Cas9 platformundan daha katı bir tasarım gerektirir ve gen düzenleme deneyleri için hem yüksek verimlilik hem de yüksek özgüllük sunar.
Bu el yazması, CRISPR/Cas sistem destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklar. CRISPR/Cas sistemi aracılı genom düzenlemeyi kullanarak nöral soy raportör hatları yapmak için gerekli bileşenleri elde etme adımları, hedefleme vektörlerinin ve sgRNA'ların inşasına odaklanılarak açıklanmaktadır. Bu protokol, sağlıklı bireylerden ve CNS hastalığı olan hastalardan türetilenler de dahil olmak üzere birden fazla hiPSC hattında başarıyla tekrarlanmıştır. Laboratuvarımızda hedeflenen genler arasında OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 ve SOD1 bulunmaktadır. HiPSC'lerde CRISPR/Cas sistemi aracılı homolog rekombinasyondan hedefleme verimliliği %20-40 arasında değişmektedir ve bu da önceki raporlarlatutarlıdır 1,18,19. Konvansiyonel gen hedefleme deneylerinde %1-2'lik tipik bir verimlilikle karşılaştırıldığında, hedefleme verimliliği önemli ölçüde iyileştirilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hedefleme Vektörleri için Tasarım ve Vektör Oluşturma
- Soy spesifik işaretleyici belirlendikten sonra, genin genomik dizisini bulun ve homoloji kollarını buna göre tasarlayın. 5' homoloji kolunun uzunluğu ~1 kb ve 3' homoloji kolunun uzunluğu ~1.5 kb'dir (Şekil 1).
- Endojen ifadenin değişmemesi veya bozulmaması için muhabir kasetini, durdurma kodonundan hemen önce genomik dizinin aşağı akışında, alt klonlama ile sırayla etiketleyin. Raportörü veya çift raportör kasetini/kasetlerini kendi kendine parçalanan 2A peptit dizileri (F2A, E2A veya T2A) 20,21 veya dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) ile bağlayın.
Not: Raportörler, GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, lusiferaz gibi floresan proteinleri veya floresan proteini ve antibiyotik direnç kasetinin bir kombinasyonu olan antibiyotik direnç kasetini içerebilir. EGFP ve neomisin direnç kaseti ile etiketlenen insan ALDH1L1 geni için hedefleme vektörü oluşturmak için Şekil 1'de bir örnek gösterilmiştir. - Raporlayıcının aşağı akışında bir pozitif seçim kaseti ekleyin. Pozitif seçim, pozitif klonlar seçildikten ve izole edildikten sonra hedeflenen iPSC'lerden eksize edilecek olan floklu bir antibiyotiğe dirençli kasettir.
- 3' homoloji kolunun dışına bir negatif seçim kaseti ekleyin. Yaygın negatif seçim kasetleri timidin kinaz, TK ve difteri toksini A'dır (DTA) 22.
- Köken işaretleyicisinin dizisini içeren bir insan BAC klonu elde edin ve klonu PCR amplifikasyonu ile doğrulayın. Hedefleme vektörünü, hedefleme bölgesini 46 aşağı çekmek için yeniden birleştirme kullanarak pKD5α içeren 23α'da oluşturun. Gerektiğinde çok siteli ağ geçidi, Golden gate stratejileri23,24 uygulayın.
2. CRISPR/Cas9 Sistemi için sgRNA'ların Tasarımı ve Vektör Yapımı.
- Raportör yapmak için hedeflenecek kökene özgü işaretçiyi belirleyin. cDNA dizisini NCBI veritabanından kopyalayın. Genomik DNA hizalamasını elde etmek için insan BLAT aramasına gidin.
- Genin montajını görüntülemek için "tarayıcı" sekmesine tıklayın. "Görünüm" sekmesi altında, tam genomik DNA dizisini FASTA formatında elde etmek için "DNA"ya tıklayın.
- 2A dizisinin ve raportör kasetinin etiketleneceği DNA dizisi içindeki durdurma kodonunu bulun.
- Durdurma kodonunun vinicity'si (~100 bp yan alanı) içinde protospacer bitişik motifini (PAM, yani NGG) arayın. Uygun NGG dizisini bulmak için her iki teli de tarayın. Olası hedef dışı olaylardan kaçınmak için yukarı akış dizilerinin özgüllüğünü göz önünde bulundurun. BLAST ve CasOT gibi açık kaynaklı araçları kullanın (ayrıntılar için Adım 5'e bakın).
- NGG'nin hemen yukarısındaki 20 baz dizisini kopyalayın ve insan-gRNA ekspresyon vektörü (U6 promotörü ile) MLM3636 uyumlu çıkıntılara sahip oligolar tasarlamak için web tasarım aracı ZiFit'e yapıştırın.
- Hem ileri hem de geri oligoları sentezleyin 7.
- Çift sarmallı sgRNA yapmak için, her iki oligosu da 70 °C'de 15 dakika denatüre edin ve yavaş yavaş RT'ye soğutun. 50 μl'lik bir reaksiyon için, sırasıyla 22.5 μl ileri ve geri oligo (stok konsantrasyonu 0.1 mM'dir) ve 5 μl tavlama tamponu (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1.5 M NaCl, pH 8.0) ekleyin.
- Adım 2.7'den elde edilen oligoları BsmBI ile sindirilmiş insan-gRNA ekspresyon vektörü (U6 promotörü ile) MLM3636 karıştırın ve bağlayın. 20 μl'lik bir reaksiyon için, Adım 2.7'den 1 μl oligo, 100 ng MLM3636 ve 1 μl (400 U) T4 ligaz ekleyin. RT O/N'de kuluçkaya yatırın.
- DH5α yetkin hücreleri ligasyon ürünü ile 30 saniye boyunca 42 ° C'de ısı şoku ile dönüştürün. Bakterileri LB agar Ampisilin (100 μg / ml) plakasında 37 ° C O / N'de büyütün. Üreticinin protokolüne göre plazmid miniprep için 3 ~ 5 koloni seçin. Ticari satıcıları kullanarak onaylamak için plazmit DNA'sını sıralayın. Maxiprep: üreticinin protokolüne göre doğru plazmid.
- sgRNA'yı T7 endonükleaz 1 (T7E1) testi ile değerlendirin (ayrıntılar için Adım 4'e bakın). Plazmid ve sgRNA ile transfect hiPSC, MLM3636 omurgasındaki yerleşik U6 promotörü altında eksprese edilecektir (Ayrıntılar için bkz. adım 6).
3. Cas9n Double Nickase sgRNA'nın Tasarımı ve Yapımı
- Çift nickase Cas9n D10A vektörü pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) elde edin.
- Her hedefleme lokusu için bir çift ileri ve geri oligo tasarlayın. Adım 2'de açıklandığı gibi NGG'nin hemen yukarısındaki 20 baz dizisini kopyalayın ve web tasarım aracı ZiFit'e yapıştırın
- pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) ile uyumlu çıkıntılara sahip oligolar elde etmek için, ZiFit tasarım aracı tarafından gösterilen hem ileri hem de geri oligoların ilk ve son tabanını çıkarın.
- İleri ve geri oligoları sentezleyin7. Bu oligoları, hedef sitenin bir tarafındaki PAM'ler için f(n)-F, f(n)-R, hedef sitenin diğer tarafındaki PAM'ler için r(n)-F, r(n)-R olarak adlandırın. Bunlardan n, farklı PAM'leri belirtmek için kullanılan sayıdır, küçük f ve r, PAM'lerin anlam (f) veya karşıt (r) iplikçikteki konumunu temsil eder, F ve R ileri ve geri oligoları temsil eder.
- Cas5n için kullanılacak optimize edilmiş sgRNA çiftini belirlemek için T2E7 testini (Adım 4'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır) kullanarak birden fazla çifti (örneğin, r4 ve f9) test edin.
- Çift sarmallı sgRNA yapmak için, her iki oligosu da 70 °C'de 15 dakika denatüre edin ve yavaş yavaş RT'ye soğutun. 50 μl'lik bir reaksiyon için, sırasıyla 22.5 μl ileri ve geri oligo (stok konsantrasyonu 0.1 mM'dir) ve 5 μl tavlama tamponu (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1.5 M NaCl, pH 8.0) ekleyin.
- Adım 3.5'ten elde edilen oligoları BbsI ile sindirilmiş pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) ile karıştırın ve bağlayın. 20 μl'lik bir reaksiyon için, Adım 3.5'ten 1 μl sgRNA, 100 ng Cas9n (D10A), 1 μl (400 U) T4 ligaz ekleyin. RT O/N'de kuluçkaya yatırın.
- DH5α yetkin hücreleri ligasyon ürünü ile 30 saniye boyunca 42 ° C'de ısı şoku ile dönüştürün. Bakterileri LB agar Ampisilin (100 μg / ml) plakasında 37 °C O / N'de büyütün. Üreticinin protokolüne göre plazmid miniprep için 3 ~ 5 koloni seçin. Ticari satıcıları kullanarak onaylamak için plazmit DNA'sını sıralayın. Maxiprep: üreticinin protokolüne göre doğru plazmid.
- sgRNA'yı T7E1 testi ile değerlendirin (ayrıntılar için Adım 4'e bakın). Plazmid ve sgRNA ile transfect hiPSC, Cas9n (D10A) omurgasındaki yerleşik U6 promotörü altında eksprese edilecektir (Ayrıntılar için 6. adıma bakın).
4. sgRNA'ların T7 Endonükleaz1 (T7E1) Testi ile Değerlendirilmesi
- Bir 24 oyuklu plaka için, bir gün önce (-1. gün) kuyu başına 2 x 105 293FT hücre plakası .
- Transfeksiyon gününde (0. gün), 293FT hücrelerini sgRNA plazmidi ve Cas9 ekspresyon vektörü ile birlikte transfekte edin. 0.5 μg sgRNA vektörü, 0.5 μg Cas9 ekspresyon vektörü JDS246 (Cas9-003) ve 1.5 μl Lipofectamine 2000 ekleyin.
- Negatif kontrol için, sgRNA vektörleri yerine 0,5 μg GFP ekspresyon vektörü (örneğin, bir pcDNA3 omurgasında CMV promotörü tarafından yönlendirilen GFP) ekleyin.
- 72 saat sonra (3. gün), 100 μl DNA hızlı ekstraksiyon tamponu ekleyerek ve kuvvetlice ezerek hücreleri hasat edin.
- Karışımı 68 °C'de 15 dakika, ardından 95 °C'de 8 dakika inkübe edin. Bu, sonraki PCR deneyleri için şablondur.
- PAM'ı çevreleyen diziyi yükseltmek için hem ileri hem de geri PCR primerleri tasarlayın. Genellikle hedeflenen PCR ürününün uzunluğu yaklaşık 400-500 bp'dir. Oligoları sentezleyin7.
- 50 μl'lik bir PCR reaksiyonu için, Adım 4.5'ten 1 μl şablon, 0.5 μl Herkülaz II, 0.5 μl DMSO, 10 μl 5x tampon, 0.5 μl dNTP karışımı ve 1 μl ileri ve geri astar karışımı ekleyin.
- Aşağıdaki PCR parametrelerini kullanın: 2 dakika boyunca 98 °C, 20 saniye boyunca 35 döngü 98 °C, 20 saniye boyunca 59 °C, 1 dakika boyunca 72 °C, 72 dakika boyunca son uzatma ile 5 dakika boyunca
Not: Burada açıklanan PCR parametreleri, test edilen birkaç gen için spesifik ürünler verir. Bununla birlikte, bu koşullar, kullanıcı tarafından seçilen ilgilenilen genlere bağlıdır. Genomik DNA'yı şablon olarak kullanan PCR'ler, fazladan bantların görünmemesini sağlamak için genellikle optimizasyon gerektirir. Bu ekstra bantlar, T7E1 testinden sonra bölünme ürünleri ile karıştırılabilir. - A260'ta bir spektrometre kullanarak PCR ürünlerinin DNA konsantrasyonunu ölçün.
- 2 μl Sindirim tamponuna 400 ng PCR ürünü ekleyin 2. 19 μl'lik bir son reaksiyon hacmine ddH2O ekleyin. Kaynar suda 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonun tezgahta oturmasına izin verin ve doğal olarak RT'ye (45-60 dakika) soğumaya bırakın.
- 1 μl (10 birim / μl) T7E1 ekleyin, 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. 6x DNA Yükleme Boyası ile karıştırılmış 2 μl 0.25 M EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- 2.5 g agaroz tozunu 100 ml 1xTAE'ye çözün. Karışımı mikrodalgada ısıtın ve jeli bir jel kutusuna dökün. Jel oluştuğunda, 20 μl'lik reaksiyonun tamamını% 2.5 agaroz jeline yükleyin. Jeli 30 dakika boyunca 100-150 V'ta çalıştırın.
- Jeli UV ışığı altında inceleyin (Şekil 3). T7E1 eşleşmeyen yerleri keser. Homolog olmayan uç birleştirmeye neden olan sgRNA'lar için, PCR ürünleri, negatif kontrole kıyasla (adım 4.3'te açıklanmıştır) ek hızlı göç bantları (boyut olarak daha küçük) gösterecektir.
- Image J yazılımını kullanarak bant yoğunluğunu karşılaştırarak sgRNA kesme verimliliğini ve ekleme ve silme yüzdesini (indel%) tahmin edin ve sıralayın.
- Jel üzerinde çalışan her numune için, jel bantlarını kesilmemiş bant, kesim bandı 1 ve kesilmiş bant 2 olarak belirleyin.
- Yazılım el kitabına göre ImageJ kullanarak her bandın yoğunluğunu ölçün.
- Aşağıdaki formülü kullanarak fkesimini hesaplayın: fcut = (kesim bandı 1 + kesim bandı 2) / (kesilmemiş bant + kesim bandı 1 + kesim bandı 2)
- Aşağıdaki formülü kullanarak Indel%'yi hesaplayın: Indel=1- √(1-fkesim).
5. Potansiyel Hedef Dışı Sitelerin In Silico Tahmini
Not: Potansiyel hedef dışı siteler, Perl tabanlı bir program olan CasOT17 adlı çevrimiçi bir açık kaynak aracı kullanılarak tahmin edilebilir.
- Bir Windows sistemi için, CasOT programını ve insan genomu veritabanı dosyalarını yerel sabit sürücüye indirin.
- Tasarlanan sgRNA'nın hedef dosyasını FASTA formatında hazırlayın.
- "Casot" adlı dosyayı açın. Bir komut penceresi açılır. Şimdilik olduğu gibi bırakın.
- Seçenek dizesi oluşturmak için "opt-generator" adlı dosyayı açın. Hedef dosyanın yolunu ve adını "-t" veya "-target" seçeneğinin iletişim kutusuna yapıştırın.
- Genom dizisi dosyasının yolunu "-g" veya "-genome" seçeneğinin iletişim kutusuna yapıştırın.
- –s veya –seed (varsayılan değer 2'dir) ve –n veya -nonseed (varsayılan değer 255'tir) değerlerini girin. Seçenek dizesi oluşturulur ve sayfanın üst kısmındaki kutuda görünür.
- Seçenek dizesini kopyalayın ve Adım 5.3.
'da açıklanan CasOT komut penceresine yapıştırın Not: CasOT programının çalıştırılması, seçeneklere ve kullanılan bilgisayara bağlı olarak 30-90 dakika sürebilir. Tamamlandığında, '--' adlı bir klasör oluşturulacaktır. Klasöre, istatistikleri açıklayan bir ".stat" dosyası ve ayrıntılı arama sonuçlarını içeren bir .csv (virgülle ayrılmış değerler) dosyası olmak üzere iki dosya eklenecektir. - .csv dosyasını bir elektronik tablo programıyla açın. Her hedef dışı site için dosyada aşağıdaki bilgiler sağlanır: kromozomal ve genomik konum, sitenin sırası, uyumsuzluk (Mm) tipi, eşleşmeyen bazların toplam sayısı ve hedef dışı siteyle ilgili ekzon bilgileri.
- Tohum veya tohum olmayan dizide <2 Mm olan bölgeler için PCR primerleri tasarlayın.
- Aşağıdaki koşulları kullanarak seçilen pozitif hiPSC klonu için PCR gerçekleştirin: 2 dakika boyunca 98 °C, 20 saniye boyunca 35 döngü 98 °C, 20 saniye boyunca 59 °C, 1 dakika boyunca 72 °C, 5 dakika boyunca 72 °C'de son uzatma ile.
Not: Burada açıklanan PCR parametreleri, laboratuvarımızda test edilen birkaç gen için spesifik ürünler verir. Bununla birlikte, bu koşullar, kullanıcı tarafından seçilen ilgilenilen genlere bağlıdır. Genomik DNA'yı şablon olarak kullanan PCR'ler, fazladan bantların görünmemesini sağlamak için genellikle optimizasyon gerektirir. - PCR ürünlerini sıralayın, dizileme sonuçlarını tahmin edilen dizilerle hizalayın ve mutasyonları arayın. Mutasyonlar varsa, hedef dışı olaylar tanımlanır.
6. Nöral Köken Raportörleri Yapmak için hiPSC'lerin Elektroporasyonu
- Geltrex kaplı tabaklarda TeSR-E8 ortamında kültür hiPSC'leri. Elektroporasyondan iki gün önce ortamı MEF-CM (Fare embriyonik fibroblastları şartlandırılmış ortam) ortamına değiştirin. 2 ml Accutase içinde 5 dakika inkübe edin ve hücreleri toplayın.
- Aşağıdaki koşulları kullanarak doğrusallaştırılmış hedefleme vektörü, Cas9-003 ekspresyon vektörü ve sgRNA vektörü ile hiPSC'leri elektroporite edin: 1 x 107 hiPSC, 2,5 μg sgRNA, 2,5 μg Cas9 ve 50 μg hedefleme vektörünün eş transfekti. Çift nickase stratejisi için, 50 μg hedefleme vektörü, her sgRNA'dan 2.5 μg ekleyin (Cas9n vektör tarafından birlikte ifade edilir).
- Klonları açıklandığı gibi pozitif ve negatif seçimlere göre seçin24,25.
- Southern blot analizi veya uzun menzilli genomik PCR24,25 ile pozitif klonları tanımlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Homoloji kolları, rapor kaseti, pozitif ve negatif seleksiyon kasetleri dahil tüm gerekli bileşenleri içeren hedefleme vektörleri oluşturulur (Şekil 1). Endojen genomik lokusa dayalı olarak, birden fazla (2 ila 3) sgRNA (Cas9 sistemi kullanılıyorsa) veya sgRNA çiftleri (Cas9n çift çentikleme stratejisi kullanılıyorsa) tasarlanır ve insan-gRNA-ekspresyon vektörü MLM3636 veya pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) omurgalarına yerleştirilir (Şekil 2). hiPSC'lere transfekte edilmeden önce...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Gen hedefleme, gen fonksiyonlarını karakterize etmede önemli bir araçtır. Bununla birlikte, nispeten düşük verimlilik, emek yoğun ve zaman alıcı bir çalışma gerektirir. Son zamanlarda, CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar)/Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçlarının geliştirilmesi, hedefleme verimliliğini büyük ölçüde artırmıştır. Bu makale, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) raportörü oluşturmak için bir protok...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Nöroşirürji Bölümü, Memorial Hermann Vakfı Staman Ogilvie Fonu, Houston'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Bentsen İnme Merkezi ve Mission Connect TIRR Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | Coli Genetik Stok Merkezi, CGSC | 7634 | |
| PGK-neo-bpA dizisi | Addgene | 13442 | |
| Hedef genlerin insan BAC klonları | |||
| JDS246 (Cas9-003), Memeli kodonu için optimize edilmiş streptococcus pyogenes Cas9-3X Bayrak | Addgene | 43861 | |
| MLM3636, U6 promotörü ile İnsan-gRNA-Ekspresyon Vektörü | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 | |
| sgRNA tasarımı, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| Off hedef tahmin aracı CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | ||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| sgRNA Primer sentezi | Sigma | ||
| Tek atış Top10 Electrocomp E. Coli Yetkili hücreler | Yaşam Teknolojileri | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Yaşam Teknolojileri | 12344-040 | |
| Restriksiyon enzimleri | NEB ve Yaşam Teknolojileri | ||
| Zymoclean Jel DNA Geri Kazanım Kiti | Zymo Researech | D4007 | |
| DNA hızlı ekstraksiyon tamponu | Epicentre | QE0905T | |
| Herculase II Füzyon DNA Polimerazlar | Agilent Technologies | 600675 | |
| Sindirim tamponu 2 | New England Biolab | ||
| 6X DNA Yükleme Boyası | Thermo Scientific | R0611 | |
| teSR-E8 Kiti hESC / hiPSC Bakım | Kök Hücre Teknolojileri | 05940 | |
| UltraPure Agaroz | Yaşam Teknolojileri | 16500-100 | |
| 50xTAE | Yaşam Teknolojileri | B49 | |
| Esansiyel 8 orta | Yaşam Teknolojileri | A1517001 | |
| Dulbecco' s Kalsiyum ve Magnezyum İçermeyen Fosfat Tamponlu Salin | Yaşam Teknolojileri | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 Glutamax ile | Yaşam Teknolojileri | 10565018 | |
| Glutamax ile D-MEM | Yaşam Teknolojileri | 10566040 | |
| Fetal Sığır Serumu-ES hücre nitelikli | Yaşam Teknolojileri | 10439 | |
| Nakavt serum replasmanı | Yaşam Teknolojileri | 10828010 | |
| 2-merkaptoetanol 1000X | Yaşam Teknolojileri | 21985023 | |
| Esansiyel Olmayan Amino Asit | Yaşam Teknolojileri | 11140050 | |
| Stempro Accutase | Yaşam Teknolojileri | A1110501 | |
| Dispase | Yaşam Teknolojileri | 17105-041 | |
| %0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi | Yaşam Teknolojileri | 25200-056 | |
| Geltrex | Yaşam Teknolojileri | 12760-013 | |
| KAYA inhibitörü Y-27632 | Millipore | SCM075 | |
| SMC4 reaktifi | BD | 354357 | |
| Neomisin dirençli MEF | Millipore | PMEF-NL | |
| Higromisin'e dayanıklı MEF | Millipore | PMEF-HL | |
| G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 | |
| Higromisin B | FIAU | 10687010 | |
| (Fialuridin, 1-2-Deoksi-2-floro-ß-D-arabinofuranosil-5-iyodurasil | Moravek Biyokimyasallar ve Radyokimyasallar | M251 | |
| Elektroporatör: Gen Pulser Xcell | Bio-Rad | ||
| 0,4 cm elektroporasyon küveti | Bio-Rad | 165-2088 | |
| DIG-Yüksek prime DNA etiketleme ve tespit başlangıç kiti II | Roche | 11585614910 | |
| Hibridizasyon denatürasyon çözeltisi | VWR | 82021-478 | |
| PCR DIG prob sentez kiti | Roche | 11636090910 | |
| DIG yıkama seti | Roche | 11585762001 | |
| Anti-Digoxigenin (DIG-AP) | Roche | 11093274910 | |
| CSPD kemilüminesans sistemi | Roche | 11755633001 | |
| DIG yıkama ve blok tampon seti | Roche | 11585762001 | |
| 50X TAE tamponu | Yaşam Teknolojileri | 24710030 | |
| Kurutma tamponu (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, %0.1 Tween20) | |||
| Hoefer Ultraviyole Çapraz Bağlayıcı | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| Spermidin & | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7.5) | VWR | 200064-506 | |
| Denville Scientific mavi biyo film 8x10 | Fisher | nc9550782 | |
| DNA moleküler ağırlık belirteci II (DIG etiketli) | Roche | 11218590910 | |
| Amersham Blotting membranı Hybond-N +& nbsp; | Roche | 95038-400 | |
| Pyrex cam kurutma tepsisi | Fisher | 15-242A | |
| Kimberly-Clark C-katlamalı kağıt havlu | Fisher | 06-666-32B | |
| Whatman 3MM kağıt (26X41) | Fisher | 05-713-336 | |
| Hibridizasyon çantası | Roche | 11666649001 | |
| Hibridizasyon tüpleri | Fisher | 13-247-300 | |
| Hibridizasyon fırını et lokantası Shake 'n' Stack | Balıkçı | HBMSOV14110 |
Kaynaklar
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
- Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
- Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
- Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
- Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
- Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
