Bu makale, kültürlenmiş HL-1 atriyal hücre tek katmanlarında çift kanallı optik haritalama gerçekleştirmek için kullanılan tekniği açıklamaktadır. Bu benzersiz protokol, kültür tek katmanlarının elektrofizyolojik özelliklerinin ayrıntılı tespiti ve analizi için aynı alanda hem kalsiyum (Ca) hem de voltaj (Vm) aktivitesinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Optik haritalama kalpleri ex vivo hem sağlam ve kültürlü miyosit mono tabakaları kardiyak elektriksel aktiviteyi tespit etmek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. HL-1 hücreleri, yaygın olarak kalp fizyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için bir 2-boyutlu hücresel bir model olarak kullanılmıştır. Ancak, bir kültür HL-1 atriyal hücre tek tabaka içinde aynı görüş alanında aynı anda optik haritası kalsiyum (Ca) geçici ve aksiyon potansiyelleri büyük bir sorun olmuştur. Özel kullanım ve bakım elektriksel yakalanan ve optik eşlenebilir sağlıklı hücreleri hazırlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, biz çift kanallı optik haritalama için optimal çalışma protokolü geliştirdik. Bu yazıda, çift kanallı optik haritalama deneyi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak tarif var. Bu protokol aritmi gelişiminde aksiyon potansiyeli yayılması ve Ca kinetik anlayışı geliştirmek için bir araçtır.
Giriş
Benzersiz kalsiyum (Ca) ve gerilim (V m) çift kanal optik haritalama tekniği 1-5 eşzamanlı sağlam kalpleri ve kültürlü hücre tek tabakalarında hem de V m ve Ca sinyallerini kaydetmek için etkili bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sayesinde daha iyi kardiyak aritmilerin yatan elektrofizyolojik mekanizmaları anlamak için kalsiyum geçici ve aksiyon potansiyellerinin arasındaki ilişki ile ilgili güçlü bilgi edinmek için yapar.
Kültürlenmiş hücre tekli katmanları, kardiyak elektrofizyoloji ve aritmiler altında yatan mekanizma üzerinde çalışmak için yararlı bir hücre modeli olduğunu kanıtlamıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Çözüm hazırlanması
- Norepinefrin (NP) çözeltisi
- . Saflaştınlmış Milli-Q (MQ), 25 ml su içinde, 30 mM askorbik asit (0,1475 g askorbik asit, 25 ml içine NP 40 mg çözülür norepinefrin (NP) ışığa duyarlı olduğu için bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışığa maruz kaçının.
- 0.22 mikron şırınga filtresi ile NP çözüm Filtre. -20 ° C'de 1 ml steril mikrotüpler içine çözeltisi ve mağaza alikosu. Dondurulmuş sonra, NP, bir ay boyunca stabildir.
- Tümlenmiş Yıkama ve Son Claycomb medya
- Claycomb ortamının 43.5 ml ile başlar ve fetal sığır serumu (FBS), 5 ml, penisilin / streptomisin, 0.5 ml, NP, 0.5 ml, 1 ile ek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Film 1 gösterildiği gibi bir kültür birleşik tek tabaka düzenli bir içsel ritmi sergiler. Biz o zaman tam konfluent HL-1 tek tabaka V m / Ca çift kanallı optik haritalama gerçekleştirdi. Şekil 1A kaydedilmiş bir tek V m ve Ca sinyallerinin örnek izlerini göstermektedir yendi. Eşit yayılır V m ve çift kanallı optik haritalama sistemi kullanılarak, Ca sinyallerinin Örnek eş zaman haritaları Şekil 1B ve 1C'de gösterilmi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, kalsiyum ve gerilim duyarlı floresan boyalar ile boyanmış bir kültür HL-1 atriyal miyosit tek tabaka optik haritalama kilit yönlerini açıklar. Bu, optimal HL-1 hücre tek tabaka, haritalama ekipman kurulumu kültürleme bir kültür tek tabaka eşleme ve veri analizi içerir.
Başarıyla kültür hücreleri eşleştirmek için, anahtar düzgün yayılı hücre tek tabaka hazırlamaktır. Lamelleri üzerine hücreleri ekim yaparken, eşit hücrelerini dağıtmak için emin olun. Bu en iyi elektriksel atışı c.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Biz HL-1 hücreleri ve ayrıntılı bakım protokolü sağlamak için Dr. Claycomb teşekkür etmek istiyorum. Biz de bizim çift kanal optik haritalama sistemi için bazı aksesuarlar yapım ile yaptığı yardım için hücre film ve Sayın Pete Caron üreten ile yardım için Bayan Elena Carrillo ve Dr Seth Robia teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser (XA 10GRNT3770030 & 12GRNT12050478) Amerikan Kalp Derneği, Ulusal Sağlık Enstitüleri (XA HL113640), ve (XA) Loyola Üniversitesi Araştırma Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Rhod2 kuru toz | AAT Bioquest | 21062 | |
| çoğul | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glikoz | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPE'ler | Sigma | H3375 |
Kaynaklar
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / e....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
