Yöntem makalesi

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

DOI:

10.3791/52544

⸱

8 Nisan 2015

 ,  ,  ,  , 
1Immunodynamics, German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute, 2Biophysical Analytics, German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute, 3Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 4Wimasis GmbH, 5Immunodynamics and Intravital Imaging, Charité - University of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfokal mikroskopi, kemik iliği gibi kompleks dokuların içinde çok sayıda hücre tipinde lokalizasyonu analizi için tercih edilen yöntemdir. Birçok durumda bu nedenle bir hakem-bağımlı önyargı tanıtan ve arası güvenilirlik azaltılması riskini taşıyan, manuel sayım dayanır Ancak, hücresel lokalizasyonu analizi ve ölçümü zordur. Hücre tipleri kendi oluşma sıklığı güçlü farklılık özellikle Dahası, rastgele pozisyon iki hücre sonuçları arasında eş-lokalizasyonu olmadığını değerlendirmek için genellikle zordur. Burada, kemik iliği hücre eş-lokalizasyonu tarafsız ölçümü için bir yöntem verilmektedir. protokol kemik iliği dahil tüm kemirgen uzun kemiklerin histolojik bölümleri elde etmek için kullanılan numune hazırlama, yanı sıra boyama protokolü ve yüksek çözünürlüklü görüntülerin satın açıklar. Hematopoetik olmayan HEMAT tanınması itibaren uzanan bir analiz iş akışıBu hücreler arasında doğrudan temasların miktarının 2-boyutlu (2D), kemik iliği görüntülerde opoietic hücre tipleri sunulmaktadır. Bu da belli bir hücre türü çevreleyen hücresel mikroçevresinin hakkında bilgi almak için, bir mahalle analizini içerir. Iki hücre türünün eş-lokalizasyonu rasgele hücre konumlandırma sadece sonucu veya hücreler arasında tercihli ilişkileri gösterir olup olmadığını değerlendirmek için, hematopoietik olarak stromal hücrelerin durumunda bu hipotezi test etmek için uygun olan bir simülasyon aracı, kullanılır. Bu yaklaşım, kemik iliği ile sınırlı değildir, ve histolojik verilerin tekrar üretilebilir, kantitatif analiz olanak sağlamak üzere diğer dokulara uzatılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nedeniyle optik görüntüleme dahil olmak üzere mikroskopi son hızlı teknolojik gelişmelere, tüm doku kapsamında hücrelerin analizi immunologlar için giderek erişilebilir hale gelmiştir. süspansiyon tek hücrelerin karakterizasyonu hücresel ve moleküler fonksiyonunu anlamak için değerli ve vazgeçilmez yöntemi temsil eder. Ancak, (mikro) ANATOMİK ortam içinde hücrelerin analizi bu tip bağışıklık tepkilerinin geliştirilmesi gibi karmaşık işlemler işbirliği çeşitli hücre tipleri arasındaki etkileşimleri anlamak için gereklidir.

Mikroskopist görüntülerden nitel bilgi elde etmek için nispeten kolay olsa da, kısmen, bu alanda analiz yöntemleri görüntü elde etme mümkündür ne göre geride gerçeğine, bu verileri ölçmek için bir sorun olmaya devam etmektedir. Birçok araştırmacı hala zaman alıcı onların histoloji görüntüleri manuel hücre sayım güveniyorböylece farklı değerlendiriciler arasında bir önyargı tanıtan ve diğer gruplar tarafından çoğaltmayı engelleyen. Çoğu zaman, bir temsilci görüntü zor okuyucu böyle bir olayın istatistiksel alaka yargılamak için yapım, bir yayında hücresel pozisyon veya ortak lokalizasyon bir açıklama altını seçilir.

Birlikte görüntü verilerinin tam bilgi içeriği nadiren istismar olduğu gerçeği ile, bu daha hızlı, tarafsız ve kapsamlı bir yaklaşım histolojik görüntüleri analiz etmek gerektiğini vurgulamaktadır.

Kemik iliği yetişkin omurgalıların hemopoeziste organı gibi önemli yaşamsal fonksiyonları alır karmaşık bir doku vardır. Hematopoetik hücrelerin 1,2 için doğum yeri olan ve B lenfosit gelişimi 3 önemli bir rol oynayan yanı sıra, aynı zamanda bağışıklık reaksiyonları 4 başlatılan ve olgun, sirkülasyon B hücreleri 5 destekleyen bir siteye olarak görür. I muhafaza Buna ek olarak, onun rolüolarak bağışıklık hafızasına sahip oluşturan çeşitli hücre tipleri 6-9 orada bulunan tespit edilmiş olarak mmunological olarak giderek artan bellek, son on yıl içinde takdir hale gelmiştir.

Karmaşık doku, kemik iliği mimarisi ve fonksiyonları arasındaki ilişki hala zor kalır. T ve B hücresi bölgeleri gibi makro bölümlerinde düzenlenir, ikincil lenfoid organların farklı olarak, kemik iliği açık bir makro bölümlere ayrılmasını yoksundur. Şimdiye kadar, kemik iliğinde farklı bölmeleri kemik korteks ya da damar yakınlıkları ile tanımlanır. Bu tür destek kök hücreleri, B hücreleri ya da uzun süreli plazma hücreleri (PC gibi bağışıklık hafıza hücre popülasyonlarında (bakımı), CD4 + ve gelişimi gibi bir dizi işlem kemik iliğinde çeşitli yerleşik stromal hücre popülasyonlarının önemi CD8 + hafızalı T hücreleri) açık bir şekilde kemik iliği mikro-bölümlendirme belirli bir derecede olduğunu gösterir.

Bu gözlemler, belirli işlevleri kemik iliğinde (hücre bakım çeşitli aşamalarında B hücresi gelişimini ve immünolojik hafızanın bakım sap) uzmanlaşmış farklı mikroanatomik niş kavramına yol açmıştır. Farklı işlevlere hizmet niş arasında heterojenite belirli bir ölçüde var gibi görünüyor olsa da, bu tür CXC-kemokin ligand 12 (CXCL12) veya interlökin 7 (IL-7), gibi stromal hücreler tarafından üretilen bazı faktörlerin için önemli bileşenler Bu niş 10 birkaç. Kemik iliğinde görselleştirme ve stromal hücrelerin karakterizasyonu nedeniyle uzun, ince dendritik uzantıları kemik iliği boyunca bir ağ oluşturan morfolojik özellikleri zordur, ve uygun belirteçler eksikliği stromal subpopülasyonunun ayırt etmek.

Bu nişler kendi hücresel ve moleküler Compositio açısından ortak özellikleri paylaşan ne kadar henüz olarak belli değiln ve elemanları belli bir niş benzersiz kılıyor. Stromal hücrelerin yanı sıra, hematopoietik hücre tipleri niş bazı en azından bazı sinyaller sağlayarak önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, niş bileşiminin karmaşıklığı yerinde kendi analizini gerektirir ve immunolojistlerden ve hematolog hücresel bileşenleri arasındaki mekansal ilişkileri analiz ederek, örneğin kemik iliği mikromimarisine, yakınlaştırmak için giderek daha önemli hale gelmiştir.

Burada, bir strateji sunulmuş bir otomatik ve tarafsız bir şekilde kemik iliğinde hücresel ortak yerelleştirme ve mahalle ilişkileri ölçmek için. Floresan hücreleri ve floresan olmayan hematopoietik hücreler, undekalsifiye kemik, bütün kemiğin kapsayan konfokal imajların ediniminin histolojik kesitlerin hazırlanması, hem de hücresel c otomatik görüntü analizine kimerik farelerin üretilmesi de dahil olmak üzere barındıran ayrıntılı bir iş akışıo-lokalizasyon ve simülasyon aracı ile rastgele konumlandırma onun doğrulama / ayrımcılık (Şekil 8) sağlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri, hayvan refahı (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) için uygun eyalet komiteleri tarafından onaylanmış ve güncel kılavuzlarda ve yönetmeliklere (hayvan deneyi lisans G0194 / 11) uygun olarak yapıldı.

Floresan Kemik İliği Kimerik Fareler 1. Nesil

Not: 9 daha önce anlatıldığı gibi, kemik iliği stromal hücreleri görselleştirmek için floresan kemik iliği kimerik farelerin üretilmesi gerçekleştirilir.

  1. Del-Cre ışınlama için onları hazırlamak için (tandem kırmızı floresan proteini (tdRFP) yayg 11-13 ifade fareler) ROSA-tdRFP fareler x tedavi başlayın. Alternatif olarak, floresan protein yerde bir ifade ile herhangi bir gerginlik kullanılır. Iki gün ışınlamadan önce, içme suyu yoluyla Neomisin, 1 mg / ml ve 1 mg / vitamin mi (A, D3, E, C) uygulayınız.
  2. Bir Sezyum-137 gama-ışıma wi ile 3.8 Gray ile iki kez fareler saçmak3 saatlik bir aralık ince. Bunun için, ilgili irradiator için uygun bir ışınlama pasta kafese fareler yerleştirin.
    NOT: Farelerin ışınlama için, bizim Enstitüsü anestezi gerektirmez. Işınlama için anestezi ile ilgili yerel kurumsal politikalar izleyin. Ağrı belirtileri varsa ışınlama sonrası günde karprofen derialtı (sc) 5 mg / kg ile hayvanları davranın.
  3. Sonraki gün, transfer tampon maddesi 9, C57BL / 6 verici farelerinin uzun kemik hazırlanabilir 3 x 10 6, kemik iliği hücrelerinin bir damardan enjeksiyonu ile farelerin sulandırın. Kadar 2 hafta boyunca Neomisin üzerinde fare ve vitamin tutun ve bu süre içinde kendi refahını ve ağırlığı izlemek. Spesifik deneysel tedavi başlamadan önce bağışıklık sisteminin yeniden sağlamak için en az 4 hafta bekleyin (bağışıklık) 9.
  4. Fareler Kurban ve bir diseksiyon gemide koyun,% 70 etanol ile bacakları sterilize. EuthanizYerel Kurumsal politikalarına uygun e fareler. Bizim Enstitü servikal dislokasyon gerçekleştirir.
  5. Uyluk cilt kaldırmak için forseps ve makas kullanın. Femoral kemik maruz kas dokusu çıkarın. Forseps ve makas kullanılarak kalça ve diz ekleminden femur kemiği luxate. Kırmak veya kemik kesmek için dikkatli olun.
  6. Dikkatle makas kullanılarak kemik, kas dokusu ve kıkırdak büyük parçalar kalan kaldırın. Laboratuvar kağıt mendil ile kemik sürtünme kalan kas dokusu çıkarın. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir petri çanağı içinde temizlenmiş toplama kemikleri.
  7. 6 saat - 4 için% 4 paraformaldehid (PFA, elektron mikroskobu dereceli) bütün femur kemikleri düzeltildi.
  8. PFA atın ve PBS O / N% 10 sakaroz kemikleri kuluçkaya yatmaktadır. Bir sonraki gün,% 20 sukroz O / N kemikleri inkübe edin. gün sonra,% 30 sakaroz O / N kemikleri kuluçkaya yatmaktadır.

Bones 2. Cryosectioning

NOT: 1 sonra6 -% 30 sakaroz 24 saat, kemikleri dondurma ve Kawamoto en bant yöntemi 14,15 göre bunları cryosection.

  1. Bir kuru buz ve aseton ile büyük bir beher (2000 ml hacim) hazırlanması (yaklaşık 2: 1 hacim oranında, örneğin, kuru buz, 400 ml aseton içinde, 200 mi) bir duman başlığı altına. (- 50 ml yaklaşık 30) içinde hekzan ile - (250 ml hacim 150) küçük bir behere koyun. (Don büyük beher dışında görünene kadar, yaklaşık 10 dakika) soğumasını bekleyin karışımı.
  2. Süper Cryoembedding Orta (SCEM) ile işaretlenmiş cryomold ¾ doldurun; tam da kalıp kenarlarına dokunmayın özen, dalmış kadar dikkatlice içine kemikleri yerleştirin. Büyük forseps ile sadece hekzan yüzeyine dokunmadan kalıp tabanı ile beher içine cryomold tutun.
    1. SCEM dondurma dış kenarlarını edelim (donukluk ile gösterilir, bu yaklaşık 15 sn sürer). Sonra tam hekzan içine kalıp açılır ve fre let it2 dakika - 1 için Eze. Dondurulmuş örnek çıkarın ve selofan sarın ve daha sonra alüminyum folyo (kurumasını örnek korumak ve ışığa maruz kalmasını önlemek için). Cryosectioning kadar -80 ° C'de saklayın.
  3. Femoral kemiklerin cryosectioning için sert dokular için bir standart mikrotom ve mikrotom bıçakları kullanın.
  4. -24 ° C'ye kadar mikrotom numune ve bıçak sıcaklığını ayarlayın. Örnek kesmeden önce yaklaşık 15 dakika mikrotomla içinde bekletin.
    1. SCEM veya optimum kesme sıcaklığı (Ekim) orta metal numune tutucu örnek blok Fix. Blok gerekirse yönünü ayarlayın. Kemik tamamen açılıncaya kadar örnek Trim ve iliği görünür. 7 um bölüm kalınlığı (ilk bölüm atmak) ayarlayın.
    2. Bir geyik deri-kaplı ahşap spatula kullanarak örnek blok üstünde yapışkan tarafı Kawamoto bant bir parça Fix. Daha sonra, örnek kesme ve kesittir, böylece bant edeceküst tarafta yer alan. Forseps kullanarak bir slayt cam bandı aktarın. Scotch bant ile slayt cam bandı sabitleyin.
  5. Bölümler en az 30 dakika kurumasını bekleyin ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın. Birlikte sopa önlemek için tek slaytlar arasındaki ayırıcılar ile plastik slayt kutulara lekesiz ve monte slaytlar saklayın. Lekeli ve monte slaytlar 4 ° C'de bir hafta kadar karton slayt klasörler için saklanabilir.

3. Resim Koleksiyonu

  1. Ortak immunofloresan protokolleri 9'a göre çözülme ve leke cryosections. Örneğin bir nükleer boya, doku bütünlüğünün görselleştirmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) içerir.
    Not: Leke, örneğin, RFP stromal hücreler (anti-TTT-biyotin antikoru ve streptavidin Alexa Fluor 555), sıçan anti-ana temel protein (MBP) antikoru ve anti-fare-Alexa Fluor 647 antikoru ile leke eozinofilleri görselleştirmek B hücreleri,Anti-κ hafif zincir-Floresein-izo-tiyosiyanat (FITC) ve anti-λ1 hafif zincir-FITC ile antikorlar sıçan anti-B220-Alexa Fluor 594 antikoru ve PC (boyama işleminin detayları 9'da tarif edilmiştir).
  2. Lekeli bölümleri bağlayın: bölümündeki Fluoromount bir damla koymak ve sonra dikkatlice hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek iken, bir # 1 cam kapak kayma ile kaplayın. Daha sonra, boyama için uygun lazer hatları ile donatılmış bir aracı olan lazer tarama konfokal mikroskobu gerçekleştirmek.
  3. Stromal hücreler aşağıdaki ayarları uygulayın, Wimasis aracını kullanarak kemik iliği hematopoetik hücrelerin otomatik eş-lokalizasyon analizi için görüntüleri kaydetmek için:
    1. Bir 20X objektif lens ve 708,15 x 708,15 um bir görüş alanı kullanın. Otomatik analiz için, karşılaştırılabilir sonuçlar tutmak için 2.048 x 2.048 piksel (px) tutarlı, tüm görüntülerin boyutunu tutmak.
    2. (Örn stromal yapıları için bir kanal kaydetmek, 561 nm lazer çizgi), çekirdek için bir kanal (örneğin, DAPI, 405 nm) ve ilgi hematopoietik hücreler (ek kanallar, örneğin, 3 kanal, eozinofiller, B hücreleri ve bilgisayarlar için 488/594/633 nm).
    3. 4 16 ortalama satırını kullanarak Tutanak görüntüleri. İdeal olarak, tek komşu görüntüleri alarak tüm femur bölüm kapsayacak. Alternatif olarak, kemik iliği (cisim yanı sıra epifiz) çeşitli bölgelerinden gelen komşu olmayan fotoğraf çekmek.
      NOT: Bitişik görüntüleri (örtüşen alanlarda hücrelerin tekrarlanan analiz önlemek için) arasındaki örtüşme üretmek için dikkatli olun.
  4. Bir mikroskopi görüntü dosyası formatında görüntü kaydetmek. Kontrol ve gerekirse, resim görüntüleyici / analiz yazılımı tüm kanallar için kontrastını ayarlamak.
  5. Görüntü dosyası başına İhracat 3 .jpg dosyaları: DAPI kanalı (kırmızı / yeşil / mavi (RGB) formatında, sarı kodlu sahte renk), stroma kanalı için bir .jpg dosyası (gri tonlama) ve bir .jpg için bir .jpg dosyası Dosya içerenhematopoetik hücreleri için kanallar (3 kanal maksimum RGB formatı, örneğin, FITC (PC'ler, yanlış renk: yeşil) / Alexa Fluor 594 (B hücreleri, yanlış renk: mavi) / Alexa Fluor 647 (eozinofiller, yanlış renk: kırmızı)) .

4. Otomatik Görüntü Analizi

  1. Görüntü segmentasyonu, eş-lokalizasyon ve mahalle analizi (Tartışma) kantifikasyonunu gerçekleştirmek için bir görüntü analizi aracını kullanın.
  2. Wimasis araçlarını kullanarak, aşağıdaki gibi devam edin:
    1. Bir alt çizgi ve görüntü türünü belirten bir sayı ile takip aynı dosya adıyla görüntü başına 3 .jpg dosyaları setleri yükleyin.
    2. Hematopoietik hücreler ile .jpg dosya _1 kullanarak, stroma kanalı .jpg dosya DAPI kanalı, _3 .jpg dosya _2. Image1_1.jpg (hematopoetik hücreleri), Image1_2.jpg (DAPI kanalı) ve Image1_3.jpg (Stroma kanalı) Örneğin:. Müşteri hesabı üzerinden resim yüklemek.
    3. Hücre temas ölçümü içinİlgili alanda tıklayarak hücre iletişim aracını seçin. Hücre civarı ölçümü için, hücre civarı aracını seçin ve (hücrelerin kenarlarından ölçülür) um tercih civarı yarıçapı girin.
    4. Sonuçları indirin.
      NOT: Bu sonuçlar özet ek olarak, .jpg hematopoietik hücrelerin ve tespit edilen nesnelerin sınırları stroma kanalı gösteren dosyaları vurgulanan, hem de her görüntü için ölçümler ihtiva eden tek .csv dosyaları olarak verilmiştir .csv dosyası, Yüklenen tüm görüntüler için verileri içerir.
  3. Kişiden ölçümler bir örnek Temsilcisi Sonuçlar gösterilen stromal hücreler, ya da diğer hematopoetik hücre tipleri temas, kırmızı, yeşil veya mavi hücre frekansları ile temas (hematopoetik hücreler (kırmızı, yeşil veya mavi hücrelerin) sıklığını belirlemek Şekil 4). Frekansları belirlemek için, görüntünün başına verilen kontak sayıları bölmektoplam hücre görüntü başına sayar.
    1. Bireysel fareler ile deneyler için, tek fareler için tüm görüntülerin toplam temas sayımları Özetle ve tüm görüntülerin toplam hücre sayımlarının toplamı ile bölünmesi.
  4. Aşama 4,3 (tarif edildiği gibi civarı ölçümlerinden, stromal hücreler ve / veya diğer hematopoietik hücre tiplerine tercihli yakınlık içinde, kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin frekanslarından seçilmiş bir mesafe olan kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin sıklığını belirlemek Ayrıca bakınız Temsilcisi Sonuçlar, Şekil 4).

Rastgele Kemik İliği Konumlandırma 5. Simülasyon

  1. Analiz kemik iliği histolojik görüntülerde rasgele hücre konumlandırma simülasyonları çalıştırmadan önce, önceden aşağıdaki dosyaları hazırlamak: Hücre iletişim aracı, DAPI kanalı için orijinal .jpg dosyaları ve orijinal .jpg dosyaları tarafından sağlanan tek .csv dosyaları stromal kanalı.
  2. Gerçekleştirmek içingörüntülerin bir dizi toplu simülasyonları (örneğin, bir femur bölümünden tüm görüntüleri), bir klasördeki tüm orijinal .jpg dosyaları (_1, _2 ve _3) ve ilgili tek .csv dosyalarını toplamak.
    NOT: rastgele kemik iliği hücre konumlandırma için simülasyon aracı istek üzerine mevcuttur.
  3. Kutu "Otomatik yük görüntü verisi" kontrol simülasyon aracını başlatın.
    NOT: Program .csv dosyasından hücre sayımları ve ortalama hücre boyutunu otomatik olarak okuyacaktır. Bu değerler "Hücre sayısı" ve "Hücre boyutu AVG" (Şekil 5A) için kutularında görüntülenir.
  4. .csv Dosyaları, yani, kendi adlarına ortak faktör için ortak etiketi girin. Toplu modu simülasyonu için kullanılması gereken görüntü setleri numarasını girin.
  5. (Dosya adı biten _3) ile stroma kanalından oluşturulan .jpg dosyasını yükleyin.
  6. DAPI kanal maskesini üretmek için ayarları girin:
    1. Kutusunu "kontrol? Maskesi uygulayın "10 (- 255 aralığında 0) bir ikili maske içine DAPI görüntü dönüştürmek için eşiğini ayarlayın.
    2. Kutusunu işaretleyin "dilate?" "? 8-bit" kutusunu işaretleyin ve 5 px genişlemesi notu ayarlayın. "/ Erozyon? W" kutusunu işaretleyin.
    3. Simüle görüntülerin analizi için kullanılan civarı yarıçapı (mahalle yarıçapı) için istenen değeri girin. (Piksel ölçekleme xy: 0.346 um) 2048 X 2048 piksel boyutunda ile 708,15 x 708,15 um'lik bir görüntü için, 29 piksel, 10 um gelmektedir.
  7. Kutusunu işaretleyin "Otsu kullanılsın mı?" Stromal yapıların otomatik tespiti için Otsu algoritması 17 kullanmak için.
    NOT: Bu iletişim ve civarı aracı tarafından kullanılan aynı algoritma. Kaydedilen görüntü ve simüle görüntünün otomatik analizinde aynı görüntü segmentasyon algoritması kullanılarak karşılaştırılabilir veri tutmak için çok önemlidir.
  8. Ar hematopoetik hücreler için ayarları girine dairesel şekiller olarak simüle.
    NOT: kırmızı, yeşil ve mavi hücreler hücre sayıları doğrudan (ayrıca bkz 5.6 adım) .csv dosyasından yüklenir.
    1. Kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin px ortalama çapı hesaplamak için simülasyon aracını kullanın. Görüntü için toplam hücre sayısı bölü px görüntüde her hücre türünün toplam alanı olarak tek bir hücre ortalama alanı belirler. Formülü kullanarak bir diskin yarıçapı hesaplamak için ortalama alanını kullanın. Ortalama çapı belirlemek için yarıçapı ikiye katlayın.
  9. Nesne bölütleme fonksiyonları içeren bir görüntü analizi yazılımı ile analiz hücre tiplerinin hücre boyutu dağılımı ölçülür. Bütün hematopoietik hücre tipleri (18 ve Şekil 5B) için σ belirler.
    NOT: Kaydedilen hücrelerin hücre boyutu dağılımları otomatik görüntü analizi ile tespit olmadığından, gerçek dağıtımları bir yaklaşım olarak bir Gauss dağılımı kullanın. t genişliğiO dağılım eğrisi σ tarif edilmektedir ve çeşitli hücre tipleri için oldukça farklı olabilir. (Daha fazla bilgi için, Şekil 5B bakınız).
    1. Hareketsiz görüntü analiz aracı ile tam bir hücre olarak tanınan küçük nesneyi açıklar px çapı: Bu ölçümlerden, "hücre boyutu cutoff" belirler.
  10. Grafik kullanıcı arabirimi (Şekil 5A) üzerinde ilgili kutulara parametreleri girin.
    1. Px bir çap olarak, kesilmiş hücre boyutunu, yani, simülasyonda izin verilen minimum hücre boyutunu girin.
    2. (Adım 5.9 dan itibaren), kırmızı, yeşil ve mavi hücreler için hücre boyutu dağılımının simülasyonu için px σ girin.
    3. Alt bölümünde "Maske hücreler" in "Sil" kutusunu işaretleyin. Bu maskenin bir no-go alanı ile en az bir piksel ile örtüşmektedir, bu ayar ile, program, bir hücre için yeni bir pozisyon seçti. Hücre üst üste kaçının "kutusunu işaretleyin? ̶1 'dir; alt bölüm "Hücre dışlama" olarak.
    4. Px iki hücre merkezleri arasında izin verilen minimum mesafeyi girin.
      NOT: minimum mesafe kaydedilmiş görüntülerden tespit edilmesi gerekmektedir. Yanlış ölçülen minimum mesafeler kaydedilmiş ve simüle görüntülerin karşılaştırılması için önyargılı / yapay sonuçlara yol açacaktır.
    5. Örtüşme merkezden merkeze asgari mesafe ile tanımlanır, eğer% 100 örtüşme maksimum alan ayarlayın.
    6. 1.000 tekrarlara simülasyon aracı ayarlayın.
    7. Kutusunu işaretleyin "otomatik kaydetme hücreleri?" .rect Dosyaları (metin biçimi) olarak partinin her görüntünün tüm tekrarlar için simüle nesnelerin koordinatlarını kaydetmek için. Kutusunu işaretleyin "otomatik kaydetme görüntüleri?" Her simüle görüntü için bir .tiff dosyasını kaydetmek için. Kaydedilen dosyalar için ortak bir etiket girin.
      NOT: "? Kaydetme hücreleri" seçeneği gerçek simüle ima kaydederken karşılaştırıldığında, simülasyon çalışma süresini ve toplam veri boyutu azaltırges. .rect dosyaları dikdörtgen gibi simüle hücre koordinatları kaydetmek ve gerekirse daha iyi taklit edilmesini görüntü içine dönüştürülebilir.
  11. "Çalıştır simülasyon" üzerine tıklayarak simülasyonu başlatın.
    NOT: simülasyon aracı otomatik olarak tekrarlanan simülasyonlar her set için, kırmızı, yeşil, mavi, ve stromal hücreler, kırmızı, yeşil ve mavi hücreler için ortalama temas sayısı ve civarı sayıları dahil olmak üzere her görüntünün 1.000 simülasyonları için bir .csv dosyası oluşturur . Ayrıca, tüm bu değerler için, standart sapma (STD) ve ortalama standart hata (SEM) ile 1.000 simülasyon ortalamaları verilmektedir.
  12. Iletişim frekansları ve 1.000 simüle resimlerden biri dizi civarı frekansları ortalama belirleyin. Bunun için, görüntü başına kaydedilen hücre sayımı ile ortalama temas ve civarı sayıları bölmek. Kaydedilen görüntünün otomatik eş-lokalizasyon analiz sonuçlarına frekansları karşılaştırın.
  13. Uygun Amerika Uygulaanalizi 19 bağlı STICAL yöntemler (Şekil 7, biz iki-kuyruklu Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılır).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kawamoto bant yöntemi ile undekalsifiye kemik cryosections Kesme diyafizinde gibi olan epifiz alanlarında hem de tüm kemik hala mineralize kemiğe bağlı endosteal bölgede kemik iliği, sağlam bir bölüm olarak kesilmesini sağlayan ve onların Trabeküler kemik yüksek yoğunluklu (Şekil 1). Bölümlerin Nükleer boyama hazırlanmasında küçük çatlaklar tam olarak önlenemez, ancak, sinüzoidler ve arterlerin yapısı yanı sıra parankim retiküler ağ bozulmadan kalır ortaya koymaktadır.

Bir k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modern optik görüntüleme yöntemleri ilerlemelere rağmen, histolojik verilerin analizi hala sık sık uygun ölçüm araçları ve yöntemleri, eksikliği veya ilgi küçük bir alanda odaklanmak önyargılı analizler tarafından engellenir. Burada sunulan sinerjik yaklaşım görüntü tüm kemik iliği bölgeyi kapsayan analiz, otomatik segmentasyon ve çeşitli hematopoetik ve stromal hücre tipleri, eş-lokalizasyon analizi nesne tanıma ve Yeni müşteriler tarafından sağlanan olmayan rastgele meydana kişileri nihayet bir doğrulama aracı birleşt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Juan Escribano Navarro, Wimasis GmbH, Münih, Almanya'ya bağlıdır. Diğer yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz değerli tartışmalar için Andreas Radbruch teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik yardım için hayvan bakımı ve Robert Günther yardım için Gruczek, Patrick Thiemann ve Manuela OHDE Sabine müteşekkiriz. Biz yazının redaksiyon için histoloji örneklerinin değerlendirilmesi ve Randy LİNGUİST için eğitimli değerlendiriciler Laura OEHME, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Floransa Pache ve Katharina Horn teşekkür ederiz. Biz MBP-spesifik antikorların J. ve N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, ABD teşekkürler.

Bu çalışma intravital mikroskopi için JIMI-bir DFG çekirdek tesisi ağ hibe ile ve ile DFG HA5354 / 4-1, tarafından desteklenen TRR130 / TP17 ve DFG AEHSZ için 2165 (HA5354 / 6-1) İÇİN Uluslararası Max Planck tarafından desteklenen Enfeksiyon Hastalıkları ve İmmünoloji (IMPRS-IDI), Berlin Okulu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

figure-materials-20 Wimasis, Münih

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Neomisinfigure-materials-1 SigmaN6386 SIGMANeomisin trisülfat tuzu hidrat, AB tehlike kodu: GHS08
Ursovit AD3ECSerumwerke Bernburg1 ml içeriği: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. kolekalsiferol, 30 mg tokoferil asetat, 100 mg askorbik asit, 1 mg sorbik asit, 200 mg polioksil 35 hint yağı, 0,5 mg propil gallat
Transfer tamponu (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penisilin / streptomisin) figure-materials-2 SigmaP4333, H3375
Tavuk gama globulinine konjuge 4-Hidroksi-3-nitrofenilasetil hapten Tavuk gama globulini
(CGG) 100 mgfigure-materials-3 RocklandD602-0100
Paraformaldehit çözeltisi (EM sınıfı)Bilim Hizmetleri15713AB tehlike kodları: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrosefigure-materials-4 Carl Roth4621.1
Kuru buz
Asetonfigure-materials-5 Sigma-Aldrich179124 SIGMA-ALDRICHAB tehlike kodları: GHS02, GHS07
Hexanefigure-materials-6 Sigma-Aldrich208752 SIGMA-ALDRICHAB tehlike kodları: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek kriyokalıplar (standart)figure-materials-7 Sakura455725 x 20 x 5 mm
Doku-Tek O.C.T.figure-materials-8 Sakura4583
Kawamoto'nun SCEM gömme ortamıfigure-materials-9 Section-Lab, JP
Kawamoto'nun kriyoseksiyon hazırlık kiti figure-materials-10 Section-Lab, JP
Kawamoto'nun kriyofilm tipi 2C(9)figure-materials-11 Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, düşük profilfigure-materials-12 Thermo Scientific3052835U x G: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), kalınlık: 0,25 mm (0,01 inç)
Poliklonal tavşan anti-RFP antikoru, biyotinillenmişfigure-materials-13 Rockland600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidinfigure-materials-14 Life TeknolojilerS-32355
Sıçan anti-MBPJ. ve N. Leeşu adresten edinilebilir: J. ve N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, ABD, klon MT-14.7
Keçi anti-sıçan-Alexa Fluor 647figure-materials-15 Yaşam TeknolojileriA-21247
Sıçan anti-B220 - Alexa Fluor 594şirket içinde üretilen ve birleştirilen (DRFZ), klon RA3.6B2, Life Technologies
Mouse anti-l1 hafif zincirinden, şirket içinde üretilen ve birleştirilen (DRFZ), klon LS136
Sıçan anti-k hafif zincir - FITC, şirket içinde üretilen ve birleştirilen (DRFZ), klon 187.1
DAPI (4 ve asal;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)< bir href = http://www.sigmaaldrich.com "target = "_blank">figure-materials-16 SigmaD9542 SIGMA
Floresan montaj ortamıfigure-materials-17 DAKOS3023
Kapak kaymaları (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)figure-materials-18 Carl RothH875.2
Superfrost sürgülü gözlükler (75 x 25 mm)figure-materials-19 VWR48311-703
lazer taramalı konfokal mikroskop. Zeiss LSM710 ve Zen 2010 Sürüm 6.0 yazılımı kullandık.
için otomatik görüntü analiz araçlarıHücre iletişim aracı ve hücre çevresi aracı, talep üzerine Wimasis tarafından sağlanacaktır.
VC2012 çalışma zamanıMicrosoftücretsiz indirme
Rastgele hücre konumlandırmasimülasyon aracı, istek üzerine bizden temin edilebilir.
segmentasyon işlevlerinesahip görüntü analiz yazılımıKemik iliğindeki hematopoetik hücre tiplerinin hücre boyutu dağılımlarını ölçmek için Volocity (Perkin Elmer) kullandık (). Alternatifler Definiens Image Analysis (Definiens) veya Cell Profiler (ücretsiz indirme)
Fiji görüntü analiz yazılımı Ücretsiz indirme. Fiji, manuel hücre sayımı için eğitimli değerlendiriciler tarafından kullanılmıştır (Şekil 3).
Alexa Fluor 594 -FITC405, 488, 561, 594, 633 nm lazer çizgileri ve 20X/0.8 NA hava objektif lensi ile donatılmış Kemik iliği için Görüntü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
  2. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
  3. Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
  4. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  5. Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
  6. Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
  7. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  8. Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
  9. Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
  10. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
  11. Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
  12. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
  13. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  14. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
  15. Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
  16. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
  17. Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
  18. Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
  19. Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
  20. MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666(1967).
  21. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  22. Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
  23. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
  24. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
  25. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
  26. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  27. Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21(1980).
  28. Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
  29. Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
  30. Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
  31. Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
  32. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
  33. Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bone Marrow AnalysisConfocal MicroscopyHistological SectioningImmunofluorescence StainingImage SegmentationColocalization QuantificationNeighborhood AnalysisSimulation ToolCell Contact MeasurementStromal Cell Interaction

İlgili makaleler