Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

11.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52565

⸱

18 Mart 2015

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Özet

Vasküler kanalların inşası, kardiyovasküler hastalıklardan kaynaklanan hasarlı ve yaralı damarların cerrahi onarımı için temel bir stratejidir. Mevcut protokol, insan fibroblastlarından kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücre (PiPSC) kullanılarak fonksiyonel doku mühendisliği yapılmış damar greftlerinin oluşturulabileceği verimli ve tekrarlanabilir bir strateji sunmaktadır. Farelere aşılamadan önce PiPSC-endotel hücrelerinin veya düz kas hücrelerinin tohumlanması için, doğal bir damar içinde bulunan matris protein yapısını ve kan akışını yakından taklit eden hücrelerden arındırılmış bir damar iskele biyoreaktörü tasarladık. Bu yaklaşımın avantajlı olduğu gösterilmiştir, çünkü PiPSC'den türetilmiş greftlerle aşılanan bağışıklık eksikliği olan fareler, ameliyattan 3 hafta sonra belirgin şekilde artmış sağkalım oranı ile sunulmuştur. Bu protokol, yakın gelecekte rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve potansiyel olarak hastaya özgü hücre tedavisi için değerli bir araçtır.

Giriş

vasküler kanalların yapımı kardiyovasküler hastalıklar sonucu hasar ve yaralı damarların cerrahi onarımı için bir temel stratejidir. , Alograftlarını, otolog doku (perikard veya safen ven) ve xenografts 1; Bugüne kadar, cerrahide kullanılan greft materyalleri biyouyumlu sentetik polimerler ([Gore-Tex ePTFE] veya polietilen tereftalat [Dacron] politetraflüoroetilen [Teflon], genişletilmiş politetrafloroetilen) içerir. Yapay greftler (örn, Gore-Tex ve Dacron) en sık kullanılan iken, bu malzemeler büyük olasılıkla darlık, kalsiyum birikimi, trombo-embolizasyon ve enfeksiyonlar dahil birçok kısa ve uzun vadeli komplikasyonlara neden. Ile mevcut biyolojik greft olan hastalar tromboembolik olaylar azalmış olsa da, hala bu tür kireçlenme bozulması 2 sayesinde ikincil greft yetmezliği ve kısaltılmış dayanıklılık gibi sınırlamalarla karşılaşabilirler. Bu nedenle, cerrahi t önemli gelişmelere rağmenyaş, araştırmacılar ve klinisyenler üzerinde tekniki hala damar hastalıkları için ideal bir kanal tanımlamak için ihtiyaç yükü vardır. Daha yakın zamanlarda, vasküler doku mühendisliği araştırma alanı hücreleri başarılı aşılama 1 için fonksiyonel gemi özetler bir biomimetic ortamı yaratmak amacı ile, biyolojik olarak parçalanabilen iskeleleri dahil edildiği bir kavram üretti. Temelde, vasküler yapıların başarısı üç temel bileşenleri bağlıdır; yani iskele, bir endotelyal hücre iç tabaka ve bir düz kas hücresi tabakası, ana damar karşılaştırılabilir mekanik özelliklerinin temin edilmesi için uygun olan hücre dışı matris içeren bir iskele ve / regülatör başlatılması için gerekli olan hücre / moleküler sinyali meydana getiren hücreler onarım.

Uzun vadeli greft açıklığı ve neo-dokuların sürekli gelişim, inci iskelelerinin etkin hücre tohumlama son derece bağımlı olanereby kritik öneme sahip, hücre tipi kararını hale getirir. Çeşitli raporlar, küçük çaplı devreleri 3-6 geliştirmek için olgun endotelyal ve çeşitli kaynaklardan yumuşak kas hücrelerinin kullanımını göstermektedir. Umut verici olmasına rağmen, yeterli otolog damarların olmaması, olgun endotel ve düz kas hücrelerinin önemli bir yük olarak kalmaktadır elde edildi. Daha yakın zamanlarda, çeşitli kaynaklardan alınan kök hücreler vasküler doku mühendisliği uygulamaları için istismar edilmiştir. Gerçekten de, embriyonik kök hücreler 7 de dahil olmak üzere, kök hücre tipleri, çeşitli uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, kemik iliğinden türetilmiş mononükleer hücreler, 12, mezenkimal kök hücreler 13, endotelyal progenitör hücreler ve erişkin damar duvarı kök türevi hücre antijeni-1 (Sca-1) + 14,15 tanımlanmış tüm ortam yanıt olarak fonksiyonel endotel veya düz kas hücreleri ya da farklılaşma yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir kök / progenitör hücreleri veKültür koşulları. Ayrıca, kök hücrelerin sınırsız kendini yenileme kapasitesi onlara olgun endotel ve sadece büyüme tutuklama ve yaşlanmayı geçiren kez önce sonlu sayıda bölebilirsiniz düz kas hücrelerinin aksine daha aday olun.

aşılama gibi biyouyumluluk, biyomekanik özellikleri ve biyolojik ayrışma oranı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır için iskele malzemesinin seçimi başarılı doku mühendisliği gemi üretmek için. Temelde, malzeme biyobozunur olmalıdır greft için iskeleler oluşturmak için kullanılan ve gereksiz alıcı bağışıklık yanıtları monte olmaz. Ayrıca, hücre eki ve sonraki yaşam için uygun bir gözeneklilik ve mikro kapsaması gerekir. Bugüne kadar, vasküler doku mühendisliği iskeleleri için kullanılan en yaygın malzeme poliglikolik asit, polilaktik asit, ve poli ε-kaprolakton 16 polimerleri içerir. Daha yakın zamanlarda, decellularized biyolojik maddeler varAyrıca bazı başarı ile uygulanmıştır. Çeşitli laboratuarlar otolog hücreler hücresizleştirilmiş bir insan, köpek veya domuz damarları tohumlama pıhtılaşma ve intimal hiperplazi 17-19 karşı biyolojik bir greft mesafede olduğunu göstermiştir. Vasküler doku mühendisliğinde diğer stratejiler iskele desteği 20, 21 olmadan örneğin hücre dışı matriks proteinleri tabanlı vasküler greft, fibrin jel 13 tohumlama hücreleri ve üreten hücre tabakaları içerir.

Mevcut protokol fonksiyonel endotel ve düz kas hücreleri, ağır kombine immün yetmezlik içine doku mühendisliği gemilerin fonksiyonel PiPSC türetilmiş damar hücrelerini liman için decellularized damar iskele oluşan biyoreaktör ve grefti nesil (SCID içine insan PiPSC farklılaşmasını gösteriyor ) fareler. PiPSC bu hücreler farelerde tümörler oluşturur ya da etik zam yok, çünkü damar greft doku mühendisliği için kullanılacak optimum hücre tipi veallo-immün yanıtlar. Ayrıca, biz pip-endotel hücreleri ve tırtıl-düz kas hücrelerinin üretilmesi için strateji verimli ve 10,11 tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Bundan sonra, biz, böylece aşılama ve hayatta kalma etkinliğini arttırmak, yakından bir yerli geminin içinde var matriks proteinleri taklit etmek PiPSC türetilmiş vasküler hücrelerin tohumlama için bir decellularized gemi tasarladı. Bundan başka, tohumlama PiPSC damarların decellularization makrofajlar gibi bağışıklık hücre tipleri ile monte enflamatuar yanıtların ortaya çıkmasını engellemektedir. Daha da önemlisi, bu protokol sadece insanlar içine çeviri için damar olukları umut oluşturmak için bir metodoloji temsil etmez, aynı zamanda eğitim ve fare modelleri ile vasküler doku yenilenmesini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak değerli bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre tüm hayvan deneyleri.

Kültür Medya 1. Hazırlık

  1. F-12K ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin: insan fibroblast hücre çizgisi CCL-153 kültür ortamı olun.
  2. PiPSC üretimi için yeniden programlanması Ortamın: Nakavt Dulbecco modifiye kartal ortamı (DMEM)% 20 Nakavt serum değiştirilmesi, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM Minimum Esansiyel Medium (MEM) Aslî Olmayan Amino Asitler, 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü 2 (bFGF-2) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. Medyayı kullanmadan önce bFGF-2 taze her zaman ekleyin.
  3. Düz kas hücresi uyarılması için Farklılaşma Ortamı (DM) olun (SMC) farklılaşması:% 10 FBS, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 100 U / ml penisilin ve streptomisin ve 25 ng / ml Platelet Derive Büyüme Faktörü içeren medya-MEM α(PDGF-ββ).
  4. Yap Endotel Farklılaşma Ortam endotel hücre (AK) farklılaşmasını uyarması (AT-DM): Endotel Büyüme ortamı-2 (EGM-2), 50 ng içeren ortam / ml Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı.

Kısmen kaynaklı Pluripotent Kök Hücre içine 2. yeniden programlanması İnsan Fibroblastlar (PiPSC)

  1. Kültür ortamı içinde,% 0.04 jelatin çözeltisi kaplamalı şişeler Kültür insan fibroblast hücre çizgisi CCL-153.
  2. Geçiş hücreleri 1 arasında bir oranda her 3 günde bir, 6. PiPSC kuşak en yüksek verimlilik için geçit 9 önce hücrelerin kullanın. % 90 ortak akışkanlığa - Hücreler 80 ulaştıktan sonra transfeksiyon için hazırdır.
  3. 4 yeniden programlama faktörleri içeren polisistronik plazmid pCAG2LMKOSimO linearize oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4 (Oct4), Sox2 Kruppel benzeri faktör 4 (Klf4) ve c-myc (pCAG-OSKM). 37 ° C'de 3 saat Pvu I kısıtlama enzimi 5 adet olan plazmid 5 ug Digest. Arındırmaküreticinin protokolüne göre, ticari bir kit kullanılarak plazmid.
  4. Transfekte üreticinin protokolüne uygun olarak insan deri fibroblast (NHDF) nucleofection kiti ile elektroporasyon yoluyla doğrusallaştırılmış pCAG-OSKM plazmid 4 ug 2 x 10 6, insan fibroblast. Yavaşça önceden ısıtılmış yeniden programlanması Medya 5 ml ihtiva eden ön% 0.04 jelatin kaplı T25 şişesi üzerine transfekte edilmiş hücreleri, tohum.
  5. 24 saat sonra, transfekte edilen hücrelerin saf popülasyonu seçmek için 25 ug / ml neomisin ve ek orta değiştirin.
  6. 4 gün kadar her gün orta değiştirin.
    Not: İnsan fibroblastları yeniden programlama 4 gün sonra PiPSC olur.

Endotel ve düz kas hücrelerinin içine PiPSC 3. Farklılaşma

  1. 4 gün boyunca DM içeren kolajen IV önceden kaplanmış yemekleri Tohum PiPSC SMC'ler içine farklılaşmayı teşvik etmek. 4 gün kadar her gün orta değiştirin.
  2. Kolajen IV önceden kaplanmış yemekleri c Tohum PiPSC6 gün süre ile endotelyal-DM ontaining endotel hücrelerine farklılaşmasını uyarması. 6 gün kadar her gün orta değiştirin.

4. decellularized Aort Greft Hazırlanması

Not: Tüm çözümler ve ekipman steril olmalıdır.

  1. Servikal dislokasyon ile fare Kurban ve diseksiyon mikroskop altında yatar pozisyonda fare sabitleyin.
  2. Göğüs boşluğu açmak için sternum üzerinden ve göğüs kafesi etrafında kesin. Aorta maruz kalp, akciğerler ve yemek borusu çıkarın. Yavaşça forseps ile peri-aort yağ çıkarmak.
  3. Makasla ön ucundan aort kesin ve hafifçe künt forseps ile sona tutun. Künt diseksiyon ile arkasında omurga sütununda aort ayırın. Dikkatle bipolar elektrokoagulatör ile ligasyonu ile aort tüm dallanma arterlerin kapatın ve makas ile ligasyon uzak ucundan kesim.
  4. 3 m ile aort lümeni temizlemek için bir 5 ml şırınga kullanınkan pıhtılarının oluşumunu önlemek için, heparin, 100 U ihtiva eden tuz çözeltisi l.
  5. Böbrek içine şube önce aort arka ucunu kesin. Aort bütünlüğünü tutulması tüm prosedür sırasında çok önemlidir.
  6. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde sulandırılmış% 0.075 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi, 5 ml ile aort lümeni yıkayın.
  7. 10 cm Petri kabındaki 0.075% SDS çözeltisi içinde torasik aorta bekletin. Oda sıcaklığında 150 rpm'de 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin.
  8. PBS 5 ml aort lümeni yıkayın.
  9. 10 cm Petri için PBS içinde aort bekletin. Oda sıcaklığında 150 rpm'de 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. PBS her 20 dakikada yenileyin.
  10. PBS 5 ml aort lümeni yıkayın.
  11. En fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de PBS içinde hücresizleştirilmiş aort greft tutun.

PiPSC ve Biyoreaktör Havalandırma 5. Çift Tohumculuk

Not: Tüm çözüms ve ekipmanlar steril olmalıdır. Bir doku kültürü kaputu tüm işlemleri gerçekleştirin.

  1. Şekil 1'de gösterildiği gibi. Biyoreaktör akış devreyi kurunuz boru ile kuluçka odasına, medya rezervuar, peristaltik pompa ve uyum odasını bağlayın. Dolaşımı için gerekli ortamın az hacmi 40 ml'dir.
  2. Ön-koşul, bir 10 cm Petri için DM ortamı aortu ıslatılması ile kültür ortamı ile hücresizleştirilmiş damar. Oda sıcaklığında 50 rpm'de 1 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin.
  3. Mikroskop altında decellularized kabın iki ucunda içine 1 cm uzunluğunda Naylon tüpleri (OD 0.9 mm, ID 0.75 mm) takın. Gemi ve 8-0 ipek dikişlerle tüpleri kravat.
  4. Bölme duvar giriş ve çıkış portları (1/32 "boru) ile Naylon tüpler bağlanarak kuluçka odasında decellularized aort greft birleştirin. Orta 5mls her seferinde inkübasyon odası koruyun.
  5. Ekleyerek önceden ısıtılmış tarafından Trypsinize PiPSCtripsin kültür çanak kapağı ve hafifçe çanak 10 kez rock. Tripsin atın ve 2 inkübatör çanak bırakın - 3 dk. Tabak önceden ısıtılmış bir kültür ortamı ilave edin ve hücreleri ile orta karıştırın.
  6. Hemasitometre kullanarak hücre sayısını sayın. Santrifüj 300 x g 5 dakika boyunca 5 x 10 5 hücre, her biri hücre süspansiyonları iki alikot. Tamamen süpernatant aspire.
  7. Tamamen süpernatant aspire sonra, DM 50 ul pip hücre pelet 1 pelletini. Decellularized damar lümenine bu hücre süspansiyonu enjekte.
  8. Ardından, Matrigel 100 ul diğer tırtıl hücre pelletini. Dikkatle decellularized aort greft üzerine karışımı pipetle.
  9. Karışım damar dış yüzeyi etrafında sarar eşit bir jel gibi devlet dönüşür kadar 15 dakika - 10 için bekleyin. DM inkübasyon odası doldurun.
  10. 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde ayarını bütün biyoreaktör yerleştirin. Elle ilk 2 saat içinde decellularized greft boyuna ekseni her yarım saatte yaklaşık 90 ° döndürün.
  11. Hücre yapışmasını sağlamak için 12 saat için statik kültür tutun.
  12. Düz kas hücre değişimini etkileme peristaltik pompa ile lümen yoluyla DM verin. 5 ml / dakika ve 24 saat boyunca 20 ml / dakika için adım adım artış, başlangıç ​​akış hızını başlatın.
  13. 24 saat süre ile 20 ml / dak dolaşım aracı, akış hızı tutun.
  14. Orta akışını durdurun ve inkübatör dışına ayarı biyoreaktör taşımak.
  15. Yeniden tohum PiPSC ile greft lümen. 5.6 - Trypsinize, adımlarda 5.5 olarak saymak ve santrifüj 1 x 10 6 PiPSC. 50 ng / ml VEGF ihtiva eden EGM-2 ortamında 50 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Greft lümenine hücre karışımı enjekte edilir.
  16. Endotel değişimi etkilemek için 50 ng / ml VEGF ihtiva eden EGM-2 ortamında inkübasyon odası ve bütün dolaşımda orta değiştirin.
  17. Inci geri ayarı biyoreaktör TaşıE inkübatör. Manuel greft ilk 2 saat içinde 90 ° her 30 dk döndürmek ve daha sonra 12 saat için statik bir kültür tutun.
  18. 5 ml / dakika ve 35 ml / dak kadar adım adım artış, akışı dolaşan başlatın. 5 gün boyunca 35 ml / dakika akış hızındaki tutun. Her gün dolaşan ve oda ortamı değiştirin.
  19. Fare daha fazla aşılama için tasarlanmış greft Hasat.

Fareler içine Çift numaralı seribaşı PiPSC Graft 6. Tırnak

  1. Kullanım NOD.CB17-Prkdc scid / damar grefti alıcı olarak NcrCrl erkek fareler. 35 gr, ve iyi sağlık koşulları içinde - Her zaman fareler, yaklaşık 10 haftalık olan yaklaşık 25 tartmak emin olun.
  2. Periton boşluğu içine Hypnorm (25 mg / kg) ve Hypnovel (25 mg / kg) 'in bir bileşimini vermek suretiyle alıcı fare anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze vazelin oftalmik merhem sürün. Fareler rahat kasları var ve sürekli nefes sağlayarak verimli anesthetization onaylayın.
    1. Onun boynu tıraş ve genişletilmiş bir yatar pozisyonda fare sabitleyin. Fare solunum yolu açık kalmasını sağlamak için anestetikler ile kombinasyon halinde atropin sülfat (1,7 mg / kg) uygulayınız.
  3. Fare sternum alt çenenin bir orta hat kesi hazırlayın. 5- ila 10 kat büyütme ile bir mikroskop altında, yanal sağ tükürük bezleri kaldırın ve sağ karotis arter ortaya çıkarmak için doğru cleidomastoid kas çıkarın.
  4. Yavaşça yakın ucuna doğru uzak ucundan sağ ortak karotid arteri harekete geçirmek için bağlanmış dokular çıkarın. Bir 8-0 ipek sütür ile iki kez karotis arter orta kısmını bağlayan ve iki bağları arasında teşrih.
  5. Her gemi sonunda otoklav naylon tüp yapılmış bir manşet geçmek ve microhemostat kelepçeleri her ucunu sabitleyin.
  6. Bir ucunda dikiş bağı sökün ve heparinin bir damla (100 U / ml) uygulanır. Hemen sonra, th uzak ucunu terse arter tüm manşet vücudu kapsayacak ve manşete bir 8-0 ipek sütür ile ters gemi düzeltmek için.
    1. Arterin diğer kısmına aynı işlemi tekrarlayın. Tuzlu su çözeltisi ile yıkayın arter kan pıhtıları kaldırmak için.
  7. Arter manşetleri aşkın decellularized damar uçlarını sürgülü ve 8-0 ipek sütür ile sabitlemek karotis arter iki ucu arasında bir decellularized damar grefti implante. Greft atışını değerlendiren önce ya biter vasküler kelepçeleri çıkartın.
  8. Geri orijinal konumuna doğru tükürük bezi yerleştirin. 6-0 polyglactin sütür kullanarak bir kesintiye sütür ile cerrahi yere cilt kapatın.
  9. Prosedür tamamlandıktan sonra bilincini yeniden başlayıncaya kadar tutarlı, fare hayati belirtilerini gözlemlemek. Servikal dislokasyon ve hasat damar grefti ile 24 saat ya da daha sonra daha fazla analiz için 3 hafta ya alıcı fareler Kurban.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PiPSC başarılı üretimi 4 transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) taşıyan bir doğrusallaştırılmış pCAG2LMKOSimO plazmitle insan fibroblastları nucleofecting 4 gün sonra doğrulanmıştır. PiPSC fibroblastlar (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde farklı bir fenotipini gösterdi ve mRNA (Şekil 2B) ve protein (Şekil 2C) seviyelerinin 10 4 yeniden programlama faktörleri olarak ifade edilmiştir. Bir PiPSC tabanlı vasküler greft et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol fonksiyonel doku mühendisliği kaplar insan fibroblastlardan PiPSC kullanılarak üretilebilir olan bir ses, hızlı, basit, verimli ve tekrarlanabilir bir strateji gösterir. Bu teknik, yakın gelecekte rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve potansiyel hastaya özgü hücre tedavisi için değerli bir araç temsil eder. Protokol etkinliğini sağlamak için kritik adım vasküler biyoreaktör içinde PiPSC hazırlanmasını, steril ve tamamen hücresizleştirilmiş aort greft, iskeleleri PiPSC başarılı tohum ve farklılaşmasının h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi çatışan mali çıkarları var.

Teşekkürler

Bu çalışma The British Heart Foundation ve The Oak Foundation tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan Fibroblastları CCL-153ATCCCCL-153Prenatal insan embriyonik fibroblastları
ATCC F-12K Ortamı (Kaighn'in Ham'ın F-12 Ortamının Modifikasyonu)ATCC30-2004
Fetal Sığır SerumuATCC30-2020
Embriyonik kök hücreler için optimize edilmiş nakavt DMEM ortamıYaşam teknolojileri (Gibco)12660-012
Nakavt Serum Replasman Ömrüteknolojileri (Invitrogen)10828-028
İnsan Temel FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
alfa-MEM ortamıYaşam teknolojileri (Invitrogen)32571093
İnsan PDGFAr-Ge D Sistemi120-HD-001
Jelatin Çözeltisi% 2SigmaG1393
Plazmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)Addgene20866
ve nbsp; PvuI Kısıtlama EnzimiNew England BiolabsRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
Nükleofeksiyon Kiti (NHDF Kiti)LONZAVPD-1001
NeomisinSIGMAG418
KL 1500 LCD, Stereo Mikroskopi için AydınlatmaSCHOTTKL 1500 LCDStereo mikroskopi
için soğuk ışık aydınlatmasıNikon Zoom Steromikroskop SMZ800NikonSMZ800
Heparin sodyum tuzuSigmaH3393
%10 SDS Stok Çözelti Moleküler Biyoloji ReaktifiSevern BiotechCAS 151-21-3
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu SalinSigmaD8537
Matrigel (10mg/ml)BDA6661
Çalkalayıcı IKA Vibrax Çalkalama platformu VX 7 Jepson Bolton'ın, Janke& KunkelS32-102
Masterflex L/S Dijital Pompa TahrikiCole-ParmerWZ-07523-80
Masterflex L/S 6 kanallı, 6 silindirli kartuşlu pompa kafasıCole-ParmerEW-07519-15
Masterflex L/S pompa kafası için büyük kartuşlarCole-ParmerEW-07519-75
Masterflex platinle kürlenmiş silikon pompa hortumu, L/S 14, 25 ftCole-Parmer WZ-96410-14Boru peristaltik pompadan geçer
0,5 mm ID, 0,8 mm OD Silikon BoruSILEXN/ABorular inkübasyon odasını, ortam rezervuarını ve uyumluluk odasını birbirine bağlar;
Montaj Redüktörü 0,5 ila 1,6, doğal PolipropilenIbidi10829Adaptör iki tip boruyu birbirine bağlar
1/32 "Boru, ID 0.01" (250 & mikro; m) Malzeme: PEEKLabSmithT-132-010PGrefti dış boruya bağlayan inkübasyon odası duvarından
Tek Parça Bağlantı Parçaları LabSmithT-132-100Yukarıdaki boruları kuluçka odası duvarından sabitleyin
Naylon tüpler (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) Smiths MedicalN/ATüpleri, aort greft NOD'unun iki ucuna yerleştirilir
. CB17-Prkdcscid/NcrCrl fareCharles River
Cerrahi sütürler, 8-0  ipekETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000Farelerde kullanım için nöroleptanaljezik
Hypnovel (Midazolam)Roche59467-70-8Anestezi indüksiyonu
Diseksiyon mikroskobuCarl ZeissStemi 2000
Naylon BoruPortex LTD800/200/100/2000,65 mm çapında ve 1 mm uzunluğunda; arter manşet yapmak için
ElektrokoagülatörMartin SN 54.131Aort
Bipolar mikro hemostat forsepslerindeMartin80-91-12-04Damar uçlarının fiksasyonu
Damar DilatörS & TJFX-7
Damar DilatörS & TJFL-3dZ
Damar DilatörS & TD-5aZ
Mini uygulayıcı ve nbsp;AESCULAPFE572K Mikro
kanama durdurucu klipsleriAESCULAPFE720K
Cerrahi sütürler, 6-0 VICRYLETHICONV489
geçen Boru arter dallarının bağlanması

Kaynaklar

  1. Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
  2. Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
  3. Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
  4. Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
  5. Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
  6. Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
  7. Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118(2014).
  8. Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
  9. Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
  10. Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
  11. Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
  12. Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
  13. Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
  14. Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
  15. Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
  16. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
  17. Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).
  18. Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  19. Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
  20. Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
  21. Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
  22. Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
  23. Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
  24. Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
  25. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
  26. McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
  27. Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kısmen İndüklenmiş Pluripotent Kök HücrelerDeselülerize Aorta GreftleriBiyoreaktör Akış DevresiÇift Ekim TekniğiFare Greftleme ProsedürüEndotelyal Düz Kas DiferansiyasyonuKardiyovasküler Hastalık TedavisiRejeneratif Tıp Yaklaşımıİmmün Yetmezlikli Fare Modeli
Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.