Yöntem makalesi

Otofaji Analiz

8.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52577

⸱

1 Şubat 2015

1LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF), Senckenberg Research Institute

Bu makalede

Özet

Penicillium chrysogenum'da açlık pedleri (merkezi bir boşluk içeren bir mikroskop lamında agaroz ve musluk suyu karışımları) kullanarak otofajiyi incelemek için uygun ve güçlü bir yöntem burada sunulmaktadır.

Özet

Hücresel kalite kontrol sistemlerinin incelenmesi, çağdaş araştırmanın oldukça dinamik ve ilgili bir alanı olarak ortaya çıkmıştır. Hücrelerin, nükleik asitler, lipitler ve proteinler gibi biyolojik olarak ilgili moleküllere verilen hasara karşı çeşitli savunma hatlarına sahip olduğu ortaya çıkmıştır. Organel dinamiklerine (füzyon/fisyon/motilite/kalıtım) ve sıkı bir şekilde kontrol edilen proteaz aktivitesine ek olarak, fazla, hasar görmüş veya tehlikeye atılmış organellerin otofaji (hücresel 'kendi kendini yeme') ile bozulması bilim camiasından büyük ilgi görmüştür. Otofajinin düzenlenmesi oldukça karmaşıktır ve çoğu şimdiye kadar açıklanmamış olan genetik ve çevresel faktörlere bağlıdır. Burada, filamentli mantar Penicillium chrysogenum'da otofajinin uygun şekilde incelenmesine izin veren yeni bir yöntem sunulmaktadır. Otofajinin tekrarlanabilir bir şekilde uyarılması için mantarın 'açlık pedleri' olarak adlandırılan üzerinde büyümesine dayanır. Numuneler doğrudan mikroskopi ile test edilir ve otofaji indüksiyonu / ilerlemesi için değerlendirilir. Burada sunulan protokol, P. chrysogenum ile kullanım için sınırlı değildir ve diğer filamentli mantarlarda kullanım için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

İpliksi mantar gelişme işlemine çalışma için mükemmel bir model sistemleridir. Bunlar ucuz ekimi, döl ve genetik erişilebilirlik yüksek sayılar gibi birçok deneysel faydaları sunuyoruz. son nokta, çeşitli hücresel mekanizmalar için çok-çok uncharacterized genlerin önemini araştıran izin Transformantların yapımı için özellikle önemlidir. İpliksi mantar fazlası ve / veya işlevsel hücre bileşenlerinin çıkarılması için mitokondriyal bütünlüğü ve Otofaji sağlamak ve sürdürmek için çeşitli elemanlar ve anormal protein, mitokondriyal dinamikleri indirgenmesi için proteaz aktivitesi hücresel kalite kontrol yollarının mekanizmaların açıklanması için etkili olmuştur açlık 1,2,3 zamanlarında hücre canlılığı.

Ipliksi mantarlar 2 Otofaji çalışma için uygun bir çok deneysel teknik vardır: vaküol (i) inceleme ıproteazlar, transmisyon elektron mikroskopisi 4 tarafından önlendiği zaman f de yoğun otofajik organları içeren, (ii) flüoresan boya monodansyl kadavenn kullanılarak floresan mikroskop 5,6 ve asidifiye autophagosomal yapıları (iii) algılama ile GFP Atg8 odak izleyerek autophagosomes görselleştirme 7.

Burada, otofaji çalışmaları için penicillium chrysogenum büyüyen yeni bir yöntem sunulmaktadır. Ana unsur sadece agaroz sterilize musluk suyunda çözünmüş 1% oluşur 'açlık pedi' olduğunu. Ek bileşikler (örneğin, stres, temizleyiciler, otofaji modülatörleri) sürece otomatik floresan göstermez altlığınızda ilave edilebilir. ped sığ merkezi boşluğu ihtiva mikroskop slaytlar yer almaktadır. Bir spor süspansiyonu ile ya da küçük miselyum fragmanları ile aşılanır Bu ped. ilgi suşu sporulat başarısız olursa ikinci tavsiye ediliretkin bir şekilde, e (örneğin, Δ atg1 suşları 8). slaytlar numunenin kuruma önlemek için (bunlar kolayca boş pipet ucu kutuları kullanılarak inşa edilebilir) ve oda sıcaklığında inkübe ıslak odalarında konumlandırılmış. P. chrysogenum, bu koşullar altında bir kaç gün için büyümeye edebilmektedir. Otofaji mantar Otofaji için olumlu bir belirtecidir vakuolar genişleme ile mikroskobik edilebilir. Bu katkı, bir P. chrysogenum soyu (Wisconsin 54-1255) C-terminal 'SKL' dizisi 9 ile peroksisomlara hedeflenen yeşil floresan proteini oluşturan kullanılır. Bu nedenle, peroksizom bozulmasını izlemek mümkündür. Uygun lokalizasyon sinyallerini kullanarak, aynı zamanda hücrenin (örneğin, mitokondriya) 'in diğer bölmeleri etiket ve bozunmasını analiz etmek mümkündür. P. veri rağmen chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) kesinlikle mümkün, burada sunulmuşturDiğer ipliksi mantarlar için de 'açlık ped' yöntemi kullanmak (örneğin, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus türleri, vb).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

P. hazırlanması 1. chrysogenum Açlık Deneyler için

  1. P. Eğer Çevrede chrysogenum suşu pirinç ('yeşil pirinç') tutulur, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine miselyumu sporlanan ile kaplı 2-3 pirinç tanelerini yerleştirin. 500 ul YGG (10 g / l KCI, 20 g / l glukoz, 10 g / l maya azot baz, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l maya ekstresi) ile doldurun.
    1. Sporlar etkili bir pirinç ayrılacak şekilde 30 saniye için tüp karıştırın.
    2. Oda sıcaklığında 1 gün (örneğin, 20 ila 25 ° C) tüp inkübe edin.
    3. Steril musluk suyu bu spor süspansiyonu, bir 1/50 seyreltme hazırlanır, iyice karıştırın.
  2. P. Eğer Çevrede chrysogenum suşu bir agar plaka (örneğin, YGG agar) tutulur, 400 ul steril musluk suyu ve yaklaşık 100 mg gl içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine misel küçük parçalar aktarmaksteril bir kürdan veya pipet kullanarak eşek boncuk.
    1. Vortex 2 dakika süreyle tüp böylece misel parçalanmış olur. Hemen tüp içeriğini kullanın.

P. Yetiştiriciliği 2. Hazırlık Adımları Açlık Pedleri üzerinde chrysogenum

  1. Bir ısıtma plakası üzerinde açma ve yaklaşık 60 ° C'ye ayarlayın.
  2. Bir mikrodalga fırında pişirme çözümü ile musluk suyu ml 100'de agaroz 2 gr eritin. Bu çözüm ısıttıktan sonra tamamen açıktır özen gösterin. Değilse agaroz tamamen eriyene kadar, tekrar pişirin. Agaroz çözüm kullanılmadan önce yaklaşık 60 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.
  3. 400 ul steril musluk her (ek bileşikler eklenmiştir) su ya da (örneklerin sayısına bağlı olarak 2-4) 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri Dolgu 400 x ul (adım 2.5 bileşiği çözeltisi ul x ilaveli) ve koyun en az 1 dakika için ısıtma plakası üzerine bu yüzden water içinde ısınıyor.
  4. En az 1 dakika için ısıtma plakası üzerine bir merkezi boşluğu içeren mikroskop slayt yerleştirin.
  5. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve girdap kısaca çözeltisine agaroz 400 ul% 2 ekleyin. Eğer istenirse bu adımdan sonra ilave bileşikler (yani, 1 uM rapamisin) ekleyin. Eğer bu yapılırsa, girdap her ek madde tüp pipetle kısaca sonra. Erken katılaşma önlemek için ısıtma masaya geri tüpleri koyun.
    NOT: mikrosantrifüj tüpü içinde toplam hacim 800 ul olmalıdır.

Açlık Pedleri İçeren Mikroskop Slaytlar 3. Hazırlık

  1. (Hala ısıtma plakası üzerinde yer almaktadır) mikroskop lamı boşluğuna agaroz çözeltisi Pipet 140 ul. Mümkünse kabarcıkları yapmaktan kaçınmaya çalışın.
  2. Hemen agaroz çözeltisi üzerine bir kapak kayma yerleştirin.
    Not: Bu, düz bir yüzeye yol açacaktır.
  3. Mikro koyYaklaşık 4 dakika laboratuar tezgah üzerine kapsam slayt agaroz ped katılaşmaya izin.
  4. Dikkatlice başparmak veya işaret parmağı yardımı ile kaymasını agaroz ped lamel çıkarın (kirlenmeyi önlemek için eldiven giymek!).
  5. Kurumasını önlemek için bir ıslak odasına ped ile mikroskop lamı yerleştirin. Öneri: hala pipet uçları tutmak için ekleme sahip boş bir ipucu kutusunu kullanın. Alt tutulmasını sağlamak için, kutu, steril su eklenir. Insert üzerine mikroskop slaytlar yerleştirin ve kutusunu kapatın.

4. P. ile Açlık Pedleri aşılamak chrysogenum Kuluçka

  1. 1/50 spor (kültürler pirinç yetiştirilen olsaydı) seyreltme veya açlık pad merkezine üzerine (kültürler bir agar plaka üzerinde yetiştirilen olsaydı) misel parçalarını içeren sulandırılmamış çözeltinin 5 ul Pipet 5 ul.
  2. Bu şekilde hizmet vermektedir (ıslak odasına kapatın ve bir plastik torba içinde sarınaçlık yastıkları kuruma karşı ek koruma). Çok aksi aşılama damla rahatsız olacak, çünkü kutusunu taşımak için dikkatli olun.
  3. Örnekleri analiz etmek için en az 20 saat boyunca oda sıcaklığında sarılmış kutusunu saklayın.

Örneklerinde 5. mikroskobik analizi

  1. Inkübasyon 20 saat sonra numuneler mikroskobik analiz için hazır; Kuru kağıt mendil üzerine mikroskop lamı koyun (alt ıslak olma eğilimindedir).
  2. Açlık ped üzerine küçük bir su hacmi (yaklaşık 50 ul) pipetle. Ped üzerine bir lamel koyun ve fazla suyunu sıkın. Bir kağıt mendil ile fazla suyun çıkarın.
  3. Floresan mikroskop gözlem masaya mikroskop lamı koyun. Misel büyüme bir bakış elde etmek için, bir 20X objektif kullanın. Hif GFP lokalizasyonu incelemek için kullanın 63X veya 100X hedefleri. Için numune analiz yok numune kademeli kuruma önlemek içinuzun 15 dakika ıslak odasına geri koymadan önce.
  4. (40 saat ve büyüme 60 saat sonra, örneğin) düzenli aralıklarla 5.3 tekrarlayın.
    NOT: Numune ıslak odasına geri konabilir. O Miseliyum büyümeyi etkilemez gibi lamel kaldırmak için gerekli değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P. peroksizom bozulması yukarıda ayrıntılı protokol kullanılmasını göstermek için chrysogenum suşu Ws54-1255 (GFP-SKL) analiz edildi. Bu gerginlik GFP-SKL genellikle peroksizom 9 aktarılır. Örnek floresan mikroskobu ile analiz edildiğinde, bu çok sayıda küresel şekiller görünümüne yol açar. Otofaji oluşursa, vakuolleri büyütmek. GFP-SKL otofaji (pexophagy) tarafından vakuollerde dahil olur. Nedeniyle GFP vakuol proteazlar tarafından bozulmaya dirençli olduğu gerçeğini bu organellerin 10...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan yöntem, P. otofaji uygun ve tekrarlanabilir çalışma sağlar chrysogenum. Örneğin, bu mantar ya da değil Otofaji tepkisini modüle edebilen olup çeşitli bileşiklerin etkinliğini taramak için kullanılabilir. rapamisin ile sonuçlar Devri sinyallemesinin engellenmesi P. otofaji belirgin bir indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir chrysogenum, diğer organizmalar 11 kanıtlanabildiği.

Daha karmaşık mikroskopları (örneğin, konf...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

CQS, LOEWE Bütünleştirici Mantar Araştırmaları Mükemmeliyet Kümesi'nden (IPF) bir burs aldı. Yazar, bu çalışmada kullanılan P. chrysogenum suşları için Ida J. van der Klei'ye ve rapamisin armağanı için Andreas S. Reichert'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Merkezi boşluklu mikroskop slaytlarıCarl Roth GmbH, Karlsruhe, AlmanyaH884.1Bunlar temizlendikten sonra birden çok kez kullanılabilir.
Cam boncuklarCarl Roth GmbH, Karlsruhe, AlmanyaA553.1Çap: 0,25 - 0,50 mm

Kaynaklar

  1. Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
  2. Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
  3. Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
  4. Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
  5. Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
  6. Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
  7. Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
  8. Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
  9. Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
  10. Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
  11. Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
  12. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Otofaji AnaliziVakuol TranslokasyonuGFP Marker ProteinleriRapamisin UygulamasDelta 80 G1 MutandPeroksizom DegradasyonuFilament z Funguslar

İlgili makaleler