Bu protokolün amacı meme tümörigenezini incelemektir. Bu teknikle, fare meme tümörleri çıkarılır ve tümörlerden birincil hücreler hazırlanır. Akciğer metastazını incelemek için bir akciğer ekstraksiyon protokolü dahildir. Ayrıca, fare embriyosundan fare embriyonik fibroblastlarını analiz etmek için başka bir protokol dahil edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Meme tümör oluşumunda, hastalığın metastatik evresi, etkilenen birey için en büyük tehdidi oluşturur. Değişmiş genotiplere sahip normal meme hücreleri artık diğer dokuları istila etme ve hayatta kalma yeteneğine sahiptir. Bu protokolde, fare meme tümörleri çıkarılır ve tümörlerden birincil hücreler hazırlanır. Bu prosedürden izole edilen hücreler daha sonra gen profili oluşturma deneyleri için kullanılabilir. Başarılı bir metastaz için, bu hücrelerin intravazasyon yapabilmesi, dolaşımda hayatta kalabilmesi, uzak organlara ekstravazasyon yapabilmesi ve bu yeni organ sisteminde hayatta kalabilmesi gerekir. Akciğerler meme kanseri metastazının tipik hedefidir. Akciğere metastaz seçiciliğine aracılık eden bir dizi gen keşfedilmiştir. Burada, genetik olarak tasarlanmış bir fare modelinden akciğer metastazı incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, fare embriyosundan fare embriyonik fibroblastlarını (MEF'ler) analiz etmek için başka bir protokol dahil edilmiştir. Aynı hayvan türünden MEF hücreleri, kanser olmayan hücre gen ekspresyonu hakkında bir ipucu sağlar. Birlikte, bu teknikler fare meme tümörigenezi, ilişkili sinyal mekanizmaları ve embriyolardaki anormalliklerin yolaklarının incelenmesinde yararlıdır.
Giriş
Metastazı, meme kanserinin ilerlemesindeki son adımdır 1. Kötü huylu hücrelerin birincil tümörden salındığı ve diğer organlara yayıldığı bir dizi adımı içerir 2. Hücreler intravaze olabilmeli, dolaşımda hayatta kalabilmeli, uzak organlara ekstravaze olabilmeli ve bu yeni organ sisteminde hayatta kalabilmelidir 3. Tümör oluşumundaki her adım, çeşitli genetik ve epigenetik değişiklikler yoluyla hücreler tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilir 4. Meme kanseri tümör oluşumunun mekanizmalarını incelemek için, kısa ömürleri, küçük boyutları ve hızlı üreme süreleri nedeniyle fare model sistemleri kullanılmıştır. Kanser araştırmalarında fare modellerini kullanmanın bazı önemli avantajları, insanlarla paylaştıkları moleküler ve fizyolojik benzerliklerdir 5.
Yerleşik fare ve insan hücre hatları meme kanseri araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Her ne kadar bu hücreleri kullanarak metastaz aşamaları hakkında bazı bilgiler elde edebilsek de, tümör baskılayıcılar/onkogenler ile genetik olarak manipüle edilmiş hayvan modelleri, embriyonik dönemden başlayarak tümör gelişimi ve metastaz hakkında çok daha fazla bilgi verecektir. Böylece, bu fare modelleri ile tümör büyümesinin genetik ve gelişimsel düzenlemesini elde edebiliriz. Ayrıca, tümör mikroçevresi de tümör hücresi gen ekspresyonunda önemli bir rol oynar ve yerleşik hücre dizileri kullanılarak yapılan çalışmalarla aynı senaryoyu taklit etmek zor olabilir. Birincil insan meme tümörleri, fare meme tümörigenezini incelemek için de kullanılabilir. İzole meme tümörlerinin kullanılmasının ana dezavantajı, bu yeni implante edilen tümörün farenin damar sistemine ve lenfatik dokusuna sahip olmamasıdır. Meme tümörijenezini incelemek için genetik fare model sistemleri, metastaz adımlarını izlememize, tümör mikroçevresini analiz etmemize ve tüm vücuda erişmemize izin verecektir 5.
Bu protokolün genel amacı, farelerde meme tümörijenezini incelemektir. Meme kanserlerinin tipik olarak beyin, akciğer ve kemiğe metastaz yaptığı bilinmektedir. Bu protokol, primer meme tümör hücrelerinin izolasyonunun yanı sıra meme kanserinin akciğere metastazı üzerinde çalışılmasına izin verir. Ayrıca, fare embriyosundan fare embriyonik fibroblastlarını (MEF'ler) analiz etmek için başka bir protokol dahil edilmiştir. Birlikte, bu teknikler fare meme tümörigenezini incelemede faydalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm farenin deneyleri Tıp LSU Okulu Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı komite (IACUC) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapıldı. Tüm cihazlar diseksiyon öncesinde otoklavlanmalıdır gerekir.
Fare göğüs tümörlerinden gelen primer hücre hazırlanması 1.
- Genetik olarak, daha önce tarif edildiği gibi 6 spontan tümörler geliştirmektedir fare meme tümörü virüs Polyoma Orta T-antijen (MMTV PyMT transgenik fare) ile tasarlanmış olan bir fare modeli kullanarak.
- İzofluran (% 99.9) ile fareler kurban ve steril bir ortamı (Şekil 1A) sağlamak için% 75 etanol püskürtün.
- Makasla boyun üretral orifis alanı cildi açın. Organların (Şekil 1B) kolay erişim sağlamak için cilt aşağı pin.
- Meme, meme tümörü izole ve soğuk, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (pH 7.4) (Şekil 1C) ile yıkayın.
- Tümörün aktarınsteril 10cm doku kültürü plakası yaklaşık 1 mm 3 adet steril jilet ve makas ile doğrayın ve. Daha sonraki aşamalar, steril bir laminer akış başlığı içinde yapılmalıdır.
- 37 ° C 'de 2 saat süre ile bir rocker 1 mg / ml lik bir nihai konsantrasyonda serumsuz DMEM ortamı içinde çözülmüş kollajenaz ile kesilmiş tümör dokusu inkübe edin. X gr 200'de 3 dakika boyunca tümör dokusu süspansiyon santrifüjleyin.
Not: Kolajenaz inkübasyon doku enzimatik ayrışması için gereklidir. - Süpernatant atılır ve 200 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj ile, PBS (pH 7.4) ile Çökelti 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatant süzün.
- Nutating ise 37 ° C 'de 5 dakika boyunca tripsin EDTA, 2 ml ile doku yeniden süspanse edin. 200 x g'de 3 dakika boyunca bir süspansiyon santrifüj ve yıkama tekrarlayın.
- 10 cm plaka, normal büyüme ortamında (DMEM,% 10 FBS, 2X pen / strep) doku pelletini. DeğişiklikOrtam Sonraki 3 gün boyunca her gün. İstediğiniz hücre sayısı kadar Kültür hücreleri elde edilir.
NOT: Yaklaşık 1x10 7 hücreleri bu prosedür izole edilecektir. MMTV PyMT karşılaştırıldığında örneğin MMTV-Neu gibi diğer fare meme tümör oluşumu modelleri, hücrelerin daha düşük verim verir. Bir düşük değerli ürününü oluşturmak modeller kullanılarak, bu artık bir daha büyük bir tümör ve Kültür hücreleri ile başlamak için faydalıdır.
2. Fare Akciğer Ekstraksiyon Akciğer Metastazı gözünüzde canlandırın için
- Akciğer çıkarma öncesinde, karaciğer ve diyaframı çıkarın. Akciğerleri rahatsız etmeden kaburga yerinden.
- Makas ince çift, şah damarından daha yakın olan trakea üst kısmını açın.
- Bir kateter kullanılarak, akciğer (Şekil 2A) doldurmak için trakea yoluyla Z-fix ya da Hindistan, mürekkep gibi 1 ml bir madde enjekte edilir. Göm parafin Akciğerler Z-düzeltin.
- Fekete çözümü Hindistan mürekkep enjekte akciğerleri De-leke(100 mi% 70 alkol,% 10 tamponlu formalin 10 ml buzlu asetik asit 5 mi) 5 dakika boyunca. Çapında bir ≥ 0.5 mm ile ikincil bölgelerde tümör nodülleri tanımlayın metastaz olarak nodüller belirler.
NOT: tümör tarafından bronşlar ve bronşiyol tıkanmaya, tümör nodülleri% 15 Hindistan mürekkebi absorbe edemez ve bu nedenle normal akciğer dokusu siyah olacak ve tümör nodülleri beyaz renk 7 olacak dolayı. Bu tek tek tümör nodülleri (Şekil 2B) görselleştirme sağlayacaktır.
Fare Embriyolar gelen fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) hazırlanması 3.
- İzofluran (% 99.9) ile birlikte hamile fareler kurban ve steril bir ortam sağlamak için% 75 etanol püskürtün.
- Makasla boyun üretral orifis alanı cildi açın ve rahim embriyolar izole.
- Cildi açarken embriyolar rahatsız etmemek için dikkatli olun.
- Rahim boynuzları çıkarın ve soğuk ste onları yıkayınPBS (pH 7.4) içinde çözündürülür.
- Buz soğukluğunda PBS (pH 7.4) içeren 10 cm'lik tabak içinde olan çok dikkatli bir şekilde plasenta ve yer embriyolar embriyo ayırın.
- Embriyo kafa, karaciğer ve gut çıkarın ve PBS (pH 7.4) ihtiva eden bir 12 gözlü doku kültür plakalarında kalan kısmı yerleştirin.
- Başka bir 12 kuyu plaka içeren tripsin EDTA embriyo gövdesini aktarın ve steril bir jilet ve makas kullanarak küçük parçalara (~ 1 mm 3) oyulmuş. 37 ° C'de 5 dakika boyunca tripsin EDTA, 5 ml kıyılmış malzeme inkübe edin.
- Doğranmış embriyolar 1 ml cenin sığır serumu (FBS) eklenerek tripsin inaktive. Santrifüj, 10 dakika boyunca 200 x g hızında süspansiyonu, dikkatli bir şekilde, süpernatant kaldırmak sıcak DMEM ortamı, 1 ml ile pelet tekrar süspansiyon ve 10 mi DMEM (% 20 FBS ve 2X penisilin / streptomisin içeren 10 cm'lik tabak bütün içeriğini aktarmak ).
- İki gün için orta her gün değiştirin. Kültür, istenen hücre kadar hücrelernumara elde edilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
hayvan kurban etmek tümör ilerleme aşaması, belirli çalışma ve IACUC kurallarına bağlıdır. Şekil 1A, fare meme tümörü virüs Polyoma Orta T-antijen (MMTV PyMT) ile 100 günlük bir C57BL / 6 farede üç ayda kurban edilmiştir. cilt makas ile boyun üretral orifis alanı açılmış ve cilt Şekil 1B gösterildiği gibi organlara kolay erişim sağlamak için aşağı tuş oldu. Bu durum, Şekil 1C'de elde edildi tümör kolay ulaşılmasına izin vermektedir. tümörlerden elde edilen birincil ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, taze fare tümör primer hücrelerin izole edilmesi içindir. Bu yöntemle hazırlanan lizatlar protein, DNA ve RNA analizleri için de yararlıdır. Primer meme tümörün kanserli hücreleri genellikle beyin, akciğer ve kemik 1 metastaz. Dahil metastaz saptanması için akciğer çıkarmak için kullanılan bir tekniktir. Şekil 2B'de görüldüğü gibi, bir mürekkep lekesi ile akciğer boyama tümör nodülleri görünüm için izin verir. Z-fix çözeltisi içinde akciğerlere Tespit bize akciğer bölümleri y...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir açıklama yok.
Teşekkürler
Mali destek için NIH, LACaTS ve Ochsner klinik vakfına teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | 4 > C |
| %0,05 Tripsin-EDTA | Hayat teknolojileri | 25300-062 | – 20 &°C'de saklayın; C |
| Kollajenaz Tip IV | Sigma-Aldrich | C5138 | – 20 &°C'de saklayın; C |
| Hyaluronidaz | Sigma-Aldrich | H3506 | – 20 &°C adresinde saklayın; C |
| Pen Strep | Life teknolojileri | 15140-122 | 4 > C |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | – 80 &°C'de saklayın; C |
| Z-fix | ANATECH# | 174 | RT Hindistan'da |
| Mağaza Ink | Yasutomo | RT | |
| AERRANE'de Mağaza (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | RT'de |
| Mağaza Etanol | EMD | AX0441-3 | RT'de Mağaza |
Kaynaklar
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
